JP3062409B2 - 新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素及びその製造方法 - Google Patents
新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素及びその製造方法Info
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- JP3062409B2 JP3062409B2 JP30409094A JP30409094A JP3062409B2 JP 3062409 B2 JP3062409 B2 JP 3062409B2 JP 30409094 A JP30409094 A JP 30409094A JP 30409094 A JP30409094 A JP 30409094A JP 3062409 B2 JP3062409 B2 JP 3062409B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シチジン１リン酸（以
下、ＣＭＰということがある。）−シアル酸からシアル
酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトー
ス残基の６位、又は複合糖質を構成しうる単糖の６位に
転移させる、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シア
ル酸転移酵素及びその製造方法に関する。
下、ＣＭＰということがある。）−シアル酸からシアル
酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトー
ス残基の６位、又は複合糖質を構成しうる単糖の６位に
転移させる、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シア
ル酸転移酵素及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、動物細胞における糖蛋白質、糖脂
質などの複合糖質が有する生物活性が次々と明らかにさ
れ、複合糖質における糖鎖の重要性が認識されつつあ
る。複合糖質中の糖鎖の非還元末端に存在することの多
い糖としてシアル酸が挙げられるが、糖鎖の持つ生理機
能、生物学的意識が重要視される中で、このシアル酸は
とりわけ多くの機能を有していると考えられている。こ
のことから、糖鎖にシアル酸を転移するシアル酸転移酵
素の重要性もまた、広く認識されている。
質などの複合糖質が有する生物活性が次々と明らかにさ
れ、複合糖質における糖鎖の重要性が認識されつつあ
る。複合糖質中の糖鎖の非還元末端に存在することの多
い糖としてシアル酸が挙げられるが、糖鎖の持つ生理機
能、生物学的意識が重要視される中で、このシアル酸は
とりわけ多くの機能を有していると考えられている。こ
のことから、糖鎖にシアル酸を転移するシアル酸転移酵
素の重要性もまた、広く認識されている。
【０００３】シアル酸をオリゴ糖、複合糖質糖鎖などに
結合させる場合、例えばシアル酸を糖鎖中の非還元末端
におけるガラクトース残基の６位にα２，６結合で結合
させる場合、従来より化学合成法と酵素法が知られてい
る。しかしながら、化学合成法は、その合成方法が複雑
であり、また副反応も生じるため、シアル酸をガラクト
ースの６位に選択的に結合させた生成物を収率よく合成
することは極めて難しいという欠点があった。
結合させる場合、例えばシアル酸を糖鎖中の非還元末端
におけるガラクトース残基の６位にα２，６結合で結合
させる場合、従来より化学合成法と酵素法が知られてい
る。しかしながら、化学合成法は、その合成方法が複雑
であり、また副反応も生じるため、シアル酸をガラクト
ースの６位に選択的に結合させた生成物を収率よく合成
することは極めて難しいという欠点があった。
【０００４】一方、酵素法は、化学合成法と比較して、
方法が非常に簡便で、かつ副反応が全く生じないため高
収率で合成することが可能である。このような酵素は、
ラット、ブタ、ヒト等の動物の顎下線、肝臓などの臓器
から取得されているが（Poulson et al. J.Biol.Chem.
252 2356-2362 (1977) 、Weinstein et al. J.Biol.Che
m. 257 13835-13844 (1982) 、Miyagi et al. Eur.J.Bi
ochem. 126 253-261 (1982) ）、精製が困難で大量に得
られないため非常に高価であり、さらには酵素としての
安定性が悪いという問題を抱えていた。
方法が非常に簡便で、かつ副反応が全く生じないため高
収率で合成することが可能である。このような酵素は、
ラット、ブタ、ヒト等の動物の顎下線、肝臓などの臓器
から取得されているが（Poulson et al. J.Biol.Chem.
252 2356-2362 (1977) 、Weinstein et al. J.Biol.Che
m. 257 13835-13844 (1982) 、Miyagi et al. Eur.J.Bi
ochem. 126 253-261 (1982) ）、精製が困難で大量に得
られないため非常に高価であり、さらには酵素としての
安定性が悪いという問題を抱えていた。
【０００５】また、現在までに精製されているシアル酸
転移酵素は、すべて動物細胞由来の酵素であるため、そ
れらのほとんどすべては糖蛋白質からなる。これら動物
由来のシアル酸転移酵素の一部は既にクローニングされ
ており、このシアル酸転移酵素の遺伝子を用いて、酵
母、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞などを宿主として
シアル酸転移酵素を生産させれば、その酵素活性を示す
酵素蛋白質が得られる。
転移酵素は、すべて動物細胞由来の酵素であるため、そ
れらのほとんどすべては糖蛋白質からなる。これら動物
由来のシアル酸転移酵素の一部は既にクローニングされ
ており、このシアル酸転移酵素の遺伝子を用いて、酵
母、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞などを宿主として
シアル酸転移酵素を生産させれば、その酵素活性を示す
酵素蛋白質が得られる。
【０００６】しかし、これらを宿主として生産された酵
素が示す比活性は、本来の動物組織や、動物細胞内での
シアル酸転移酵素の比活性と比較すると非常に低い値を
示す。これは、酵母、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞
などを宿主として生産したシアル酸転移酵素は、動物細
胞内で生産されている本来のシアル酸転移酵素と蛋白質
の一次構造は同じであっても、蛋白質部分に付加される
糖鎖が異なり、その結果、本来の酵素と比較して組み換
え体の比活性が非常に低くなっているものと考えられる
からである。
素が示す比活性は、本来の動物組織や、動物細胞内での
シアル酸転移酵素の比活性と比較すると非常に低い値を
示す。これは、酵母、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞
などを宿主として生産したシアル酸転移酵素は、動物細
胞内で生産されている本来のシアル酸転移酵素と蛋白質
の一次構造は同じであっても、蛋白質部分に付加される
糖鎖が異なり、その結果、本来の酵素と比較して組み換
え体の比活性が非常に低くなっているものと考えられる
からである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、微生
物由来の新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸
転移酵素を、大量にかつ安価に生産することである。
物由来の新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸
転移酵素を、大量にかつ安価に生産することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者等は、フォトバクテリウム属に属する
微生物が、シアル酸を複合糖質糖鎖又は遊離の糖鎖中の
ガラクトース残基等に転移させる酵素を生産することを
見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、フォトバ
クテリウム属に属する微生物由来であって、下記の理化
学的性質を有する新規なβ−ガラクトシド−α２，６−
シアル酸転移酵素である。 (1) 作用及び特異性：シチジン１リン酸−シアル酸から
シアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラ
クトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質を構成し
うる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転
移させる。 (2) 至適pH：５〜６ (3) 至適温度：30℃ (4) 分子量：64,000±5,000（ゲル濾過による） また、本発明は、下記の理化学的性質を有する新規なβ
−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素である。 (1) 作用及び特異性：シチジン１リン酸−シアル酸から
シアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラ
クトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質を構成し
うる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転
移させる。 (2) 至適pH：５ (3) 至適温度：30℃ (4) pH安定性：4.5 〜６ (5) 熱安定性：35℃で５分間加熱後の活性は、初期活性
の約90％を保持する。
の結果、本発明者等は、フォトバクテリウム属に属する
微生物が、シアル酸を複合糖質糖鎖又は遊離の糖鎖中の
ガラクトース残基等に転移させる酵素を生産することを
見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、フォトバ
クテリウム属に属する微生物由来であって、下記の理化
学的性質を有する新規なβ−ガラクトシド−α２，６−
シアル酸転移酵素である。 (1) 作用及び特異性：シチジン１リン酸−シアル酸から
シアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラ
クトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質を構成し
うる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転
移させる。 (2) 至適pH：５〜６ (3) 至適温度：30℃ (4) 分子量：64,000±5,000（ゲル濾過による） また、本発明は、下記の理化学的性質を有する新規なβ
−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素である。 (1) 作用及び特異性：シチジン１リン酸−シアル酸から
シアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラ
クトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質を構成し
うる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転
移させる。 (2) 至適pH：５ (3) 至適温度：30℃ (4) pH安定性：4.5 〜６ (5) 熱安定性：35℃で５分間加熱後の活性は、初期活性
の約90％を保持する。
【０００９】45℃で５分間加熱後の活性は、初期活性の
約70％を保持する。 (6) 分子量：約61,000（12.5％ SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による） 約64,000（ゲル濾過による） (7) 等電点：4.6 さらに、本発明は、フォトバクテリウム属に属し、β−
ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有
する微生物を培地に培養し、得られた菌体から酵素を採
取することを特徴とするβ−ガラクトシド−α２，６−
シアル酸転移酵素の製造方法である。
約70％を保持する。 (6) 分子量：約61,000（12.5％ SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による） 約64,000（ゲル濾過による） (7) 等電点：4.6 さらに、本発明は、フォトバクテリウム属に属し、β−
ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有
する微生物を培地に培養し、得られた菌体から酵素を採
取することを特徴とするβ−ガラクトシド−α２，６−
シアル酸転移酵素の製造方法である。
【００１０】さらに、本発明は、上記フォトバクテリウ
ム属に属し、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転
移酵素生産能を有する微生物が、フォトバクテリウム
ダムセーラ（Photobacterium damsela) JTO160、ATCC 3
3539及びATCC 35083からなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とするβ−ガラクトシド−α2,6
−シアル酸転移酵素の製造方法である。
ム属に属し、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転
移酵素生産能を有する微生物が、フォトバクテリウム
ダムセーラ（Photobacterium damsela) JTO160、ATCC 3
3539及びATCC 35083からなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とするβ−ガラクトシド−α2,6
−シアル酸転移酵素の製造方法である。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、フ
ォトバクテリウム属に属し、β−ガラクトシド−α２，
６−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物を培地に培
養し、菌体中にβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸
転移酵素を生産させ、これを採取することより得ること
ができる。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、フ
ォトバクテリウム属に属し、β−ガラクトシド−α２，
６−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物を培地に培
養し、菌体中にβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸
転移酵素を生産させ、これを採取することより得ること
ができる。
【００１２】ここで用いる微生物としては、フォトバク
テリウム属に属し、β−ガラクトシド−α２，６−シア
ル酸転移酵素生産能を有する微生物であれば、いずれで
も用いることができるが、中でもフォトバクテリウム
ダムセーラ種に属するものが好ましく、その例として
は、フォトバクテリウム ダムセーラ JTO160 、ATCC 3
3539、ATCC 35083などが挙げられる。フォトバクテリウ
ム ダムセーラは、いずれも海洋性細菌であり、フォト
バクテリウム ダムセーラ JTO160 は、相模湾の海水中
から分離されたものである。一例として、フォトバクテ
リウム ダムセーラ JTO160 のスクリーニング法を以下
に示す。
テリウム属に属し、β−ガラクトシド−α２，６−シア
ル酸転移酵素生産能を有する微生物であれば、いずれで
も用いることができるが、中でもフォトバクテリウム
ダムセーラ種に属するものが好ましく、その例として
は、フォトバクテリウム ダムセーラ JTO160 、ATCC 3
3539、ATCC 35083などが挙げられる。フォトバクテリウ
ム ダムセーラは、いずれも海洋性細菌であり、フォト
バクテリウム ダムセーラ JTO160 は、相模湾の海水中
から分離されたものである。一例として、フォトバクテ
リウム ダムセーラ JTO160 のスクリーニング法を以下
に示す。
【００１３】海水、海砂、もしくは海泥を微生物源とし
て、これらを直接もしくは滅菌海水で希釈した後に、マ
リンブロス2216−寒天培地（ディフコ社製、寒天濃度1.
5 ％）なる平板培地に塗布し、生育する海洋性微生物を
取得する。得られた微生物を常法にしたがってシングル
コロニーアイソレーションした後に、マリンブロス2216
（ディフコ社製）なる液体培地を用い、それぞれの微生
物を培養する。微生物が十分生育した後に、培養液から
菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に、0.2 ％
トライトンX-100 （関東化学社製）なる界面活性剤を含
む、20mMカコジレート緩衝液（pH6.0 ）を添加し、菌体
を懸濁する。この菌体懸濁液を、氷冷下、超音波処理し
て細胞を破砕する。この細胞破砕液を酵素溶液として、
常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、シアル酸
転移活性を示す菌株より本菌株を得ることができる。
て、これらを直接もしくは滅菌海水で希釈した後に、マ
リンブロス2216−寒天培地（ディフコ社製、寒天濃度1.
5 ％）なる平板培地に塗布し、生育する海洋性微生物を
取得する。得られた微生物を常法にしたがってシングル
コロニーアイソレーションした後に、マリンブロス2216
（ディフコ社製）なる液体培地を用い、それぞれの微生
物を培養する。微生物が十分生育した後に、培養液から
菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に、0.2 ％
トライトンX-100 （関東化学社製）なる界面活性剤を含
む、20mMカコジレート緩衝液（pH6.0 ）を添加し、菌体
を懸濁する。この菌体懸濁液を、氷冷下、超音波処理し
て細胞を破砕する。この細胞破砕液を酵素溶液として、
常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、シアル酸
転移活性を示す菌株より本菌株を得ることができる。
【００１４】このようにして得られるフォトバクテリウ
ム ダムセーラ JTO160の菌学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １) 形態 (1) 細胞の形態は桿菌で、大きさは１×0.５μｍ〜２×
１μｍ。
ム ダムセーラ JTO160の菌学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １) 形態 (1) 細胞の形態は桿菌で、大きさは１×0.５μｍ〜２×
１μｍ。
【００１５】(2) 運動性を有し、鞭毛（極単毛）を有す
る。 (3) グラム染色性は陰性。 (4) 胞子は形成しない。 ２）生理学的性質 (1) 生育温度 25〜35℃ (2) 集落の色調 特徴的集落色
素を産生せず (3) Ｏ−Ｆテスト Ｆ (4) カタラーゼテスト 陽性 (5) オキシダーゼテスト 陽性 (6) グルコースからのガスの生成 陽性 (7) Ｖ−Ｐ反応 陽性 (8) ゼラチン分解能 無 (9) デンプン分解能 無 (10)硝酸塩還元能 有 (11)発光性 無 (12)酸素に対する態度 通性嫌気性 (13)グルコースの蓄積 有 (14)β−ヒドロキシ酪酸の蓄積 無 (15)β−ヒドロキシ酪酸の利用能 有 (16)Na+ 要求性 有 (17)プテリジン誘導体に対する感受性 10μｇ 有 150 μｇ 有 (18)キノン系 Q-8,Q-7 (19)菌体内DNA のGC含量（モル％）* 42 (20)リパーゼ活性 有 (21)アルギニンジヒドラーゼ活性 有 (22)資化性 酢酸塩 無 マルトース 有 Ｌ−プロリン 有 ピルビン酸塩 無 Ｄ−キシロース 無 セロビオース 無 Ｄ−ガラクトース 有 Ｄ−ガラクチュロン酸 無 Ｄ−グルコン酸塩 無 グルコース 有 Ｌ−グルタミン酸塩 無 Ｄ−マンノース 有 シュークロース 無 マンニトール 無 注）＊：ＨＰＬＣ法によって行った。
る。 (3) グラム染色性は陰性。 (4) 胞子は形成しない。 ２）生理学的性質 (1) 生育温度 25〜35℃ (2) 集落の色調 特徴的集落色
素を産生せず (3) Ｏ−Ｆテスト Ｆ (4) カタラーゼテスト 陽性 (5) オキシダーゼテスト 陽性 (6) グルコースからのガスの生成 陽性 (7) Ｖ−Ｐ反応 陽性 (8) ゼラチン分解能 無 (9) デンプン分解能 無 (10)硝酸塩還元能 有 (11)発光性 無 (12)酸素に対する態度 通性嫌気性 (13)グルコースの蓄積 有 (14)β−ヒドロキシ酪酸の蓄積 無 (15)β−ヒドロキシ酪酸の利用能 有 (16)Na+ 要求性 有 (17)プテリジン誘導体に対する感受性 10μｇ 有 150 μｇ 有 (18)キノン系 Q-8,Q-7 (19)菌体内DNA のGC含量（モル％）* 42 (20)リパーゼ活性 有 (21)アルギニンジヒドラーゼ活性 有 (22)資化性 酢酸塩 無 マルトース 有 Ｌ−プロリン 有 ピルビン酸塩 無 Ｄ−キシロース 無 セロビオース 無 Ｄ−ガラクトース 有 Ｄ−ガラクチュロン酸 無 Ｄ−グルコン酸塩 無 グルコース 有 Ｌ−グルタミン酸塩 無 Ｄ−マンノース 有 シュークロース 無 マンニトール 無 注）＊：ＨＰＬＣ法によって行った。
【００１６】以上の菌学的性質より、本菌はフォトバク
テリウム ダムセーラと推定された。そこで、フォトバ
クテリウム ダムセーラ GIFU 10450（基準株）とＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験を行った結果、
89％と高い相同値が得られたため、本菌はフォトバクテ
リウム ダムセーラと同定された。なお、ＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリダイゼーション試験はマイクロプレートを用
いたフォトビオチン標識方法によって行った。
テリウム ダムセーラと推定された。そこで、フォトバ
クテリウム ダムセーラ GIFU 10450（基準株）とＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験を行った結果、
89％と高い相同値が得られたため、本菌はフォトバクテ
リウム ダムセーラと同定された。なお、ＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリダイゼーション試験はマイクロプレートを用
いたフォトビオチン標識方法によって行った。
【００１７】フォトバクテリウム ダムセーラ JTO160
は、平成６年11月24日付で、工業技術院生命工学工業技
術研究所に、FERM BP-4900として寄託されている。ま
た、フォトバクテリウム ダムセーラ ATCC 33539 及び
ATCC 35083はいずれもAEMERICAN TYPE CULTURE COLLECT
ION (ATCC)に寄託されており、 ATCC 33539 の菌学的性
質は、Int.J. Syst.Bact. 32 267 (1982) 、及び MacDO
NELL et al. Syst.Appl.Microbiol. 6 171-182 (1985)
に、ATCC 35083の菌学的性質は、Grimes et al.Microb.
Ecol. 10 271-282 (1984) に記載されている。
は、平成６年11月24日付で、工業技術院生命工学工業技
術研究所に、FERM BP-4900として寄託されている。ま
た、フォトバクテリウム ダムセーラ ATCC 33539 及び
ATCC 35083はいずれもAEMERICAN TYPE CULTURE COLLECT
ION (ATCC)に寄託されており、 ATCC 33539 の菌学的性
質は、Int.J. Syst.Bact. 32 267 (1982) 、及び MacDO
NELL et al. Syst.Appl.Microbiol. 6 171-182 (1985)
に、ATCC 35083の菌学的性質は、Grimes et al.Microb.
Ecol. 10 271-282 (1984) に記載されている。
【００１８】上記微生物の培養に用いる培地としては、
それらの微生物が利用し得る炭素源、窒素源、無機物等
を含むものを用いる。炭素源としては、ペプトン、トリ
プトン、カゼイン分解物、肉エキス等が挙げられ、好ま
しくはペプトンを用いる。窒素源としては、酵母エキス
を用いるのが好ましい。塩類としては、塩化ナトリウ
ム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、
塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭
酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ほ
う酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を適
宜組み合わせて用いるのが好ましい。
それらの微生物が利用し得る炭素源、窒素源、無機物等
を含むものを用いる。炭素源としては、ペプトン、トリ
プトン、カゼイン分解物、肉エキス等が挙げられ、好ま
しくはペプトンを用いる。窒素源としては、酵母エキス
を用いるのが好ましい。塩類としては、塩化ナトリウ
ム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、
塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭
酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ほ
う酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を適
宜組み合わせて用いるのが好ましい。
【００１９】また、上記成分をすべて含んだマリンブロ
ス2216なる培地（ディフコ社製）を用いることもでき
る。さらには、上記塩類を適度に含む人工海水を用い、
これにペプトン、酵母エキス等を添加した培地を用いる
こともできる。培養条件は培地の組成によって多少異な
るが、培養温度は15〜35℃、好ましくは20〜33℃、pHは
6.８〜8.８、好ましくは7.３〜8.２、培養時間は８〜48
時間、好ましくは16〜24時間である。
ス2216なる培地（ディフコ社製）を用いることもでき
る。さらには、上記塩類を適度に含む人工海水を用い、
これにペプトン、酵母エキス等を添加した培地を用いる
こともできる。培養条件は培地の組成によって多少異な
るが、培養温度は15〜35℃、好ましくは20〜33℃、pHは
6.８〜8.８、好ましくは7.３〜8.２、培養時間は８〜48
時間、好ましくは16〜24時間である。
【００２０】目的とする酵素は菌体内に存在するため、
公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕法、フレンチプレ
ス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法など
のいずれかの方法を行えばよく、その菌体破砕物から目
的とする酵素を分離精製する。本発明における好ましい
菌体破砕法は、超音波破砕法である。例えば、菌体破砕
物から遠心分離により固形物を除去した後に、得られた
菌体破砕液上清を市販の陰イオン交換カラム、陽イオン
交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイト
カラム、 CDP−ヘキサノールアミンアガロースカラム、
CMP−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カ
ラム等のカラムクロマトグラフィー及びネイティブ−PA
GE等を適宜組み合わせて電気泳動的に単一バンドになる
まで精製することができる。
公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕法、フレンチプレ
ス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法など
のいずれかの方法を行えばよく、その菌体破砕物から目
的とする酵素を分離精製する。本発明における好ましい
菌体破砕法は、超音波破砕法である。例えば、菌体破砕
物から遠心分離により固形物を除去した後に、得られた
菌体破砕液上清を市販の陰イオン交換カラム、陽イオン
交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイト
カラム、 CDP−ヘキサノールアミンアガロースカラム、
CMP−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カ
ラム等のカラムクロマトグラフィー及びネイティブ−PA
GE等を適宜組み合わせて電気泳動的に単一バンドになる
まで精製することができる。
【００２１】なお、β−ガラクトシド−α２，６−シア
ル酸転移酵素は、完全に精製してもよいが、部分精製品
でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシ
ド−２，６−シアル酸転移酵素は、精製品と部分精製品
の両者を含むものとする。本発明のβ−ガラクトシド−
α2,6 −シアル酸転移酵素の特徴は、フォトバクテリウ
ム属に属する微生物、中でもフォトバクテリウム ダム
セーラ種に属する微生物由来であり、かつＣＭＰ−シア
ル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖
中のガラクトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質
を構成しうる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の
６位に転移させる作用及び基質特異性を有する点にあ
る。本酵素の至適pHは５〜６の範囲内にあり、至適温度
は30℃、分子量はゲル濾過法によると64,000±5,000で
ある。ここで、動物由来の複合糖質を構成しうる単糖で
６位の炭素に水酸基を有する単糖とは、例えばガラクト
ース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン等をい
う。
ル酸転移酵素は、完全に精製してもよいが、部分精製品
でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシ
ド−２，６−シアル酸転移酵素は、精製品と部分精製品
の両者を含むものとする。本発明のβ−ガラクトシド−
α2,6 −シアル酸転移酵素の特徴は、フォトバクテリウ
ム属に属する微生物、中でもフォトバクテリウム ダム
セーラ種に属する微生物由来であり、かつＣＭＰ−シア
ル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖
中のガラクトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質
を構成しうる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の
６位に転移させる作用及び基質特異性を有する点にあ
る。本酵素の至適pHは５〜６の範囲内にあり、至適温度
は30℃、分子量はゲル濾過法によると64,000±5,000で
ある。ここで、動物由来の複合糖質を構成しうる単糖で
６位の炭素に水酸基を有する単糖とは、例えばガラクト
ース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン等をい
う。
【００２２】本酵素としては、具体的にはフォトバクテ
リウム ダムセーラ JTO160 由来の酵素、フォトバクテ
リウム ダムセーラ ATCC 33539 由来の酵素、フォトバ
クテリウム ダムセーラ ATCC 35083 由来の酵素等が挙
げられるが、一例としてフォトバクテリウム ダムセー
ラ JTO160 由来の酵素の酵素学的性質及び理化学的性質
を以下に示す。 (1) 作用及び基質特異性 ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしく
は遊離の糖鎖中のガラクトース残基の６位、特にその非
還元末端に存在するガラクトースの６位に、またラクト
ース、Ｎ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在
するガラクトースの６位、特にその非還元末端に存在す
るガラクトースの６位に、さらにはガラクトース、マン
ノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミンなどの動物由来の複合糖質を構成しうる単糖
で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転移させ
る。 (2) 熱安定性 本酵素溶液10μl を30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55
℃及び60℃の水浴中で５分間加熱した後、酵素活性を測
定し、非加熱時の酵素活性を100％として加熱後の残存
活性を比較した。その結果より、本酵素は30℃では100
％、35℃では約90％、45℃では約70％の残存活性を示
す。 (3) ｐＨ安定性 pH3.７から5.０（酢酸緩衝液）、pH5.０から7.３（カコ
ジレート緩衝液）及びpH7.３から8.０（トリス−塩酸緩
衝液）で酵素溶液を調製し、この酵素溶液10μl を用い
て酵素活性を測定した。酵素活性を比較した結果より、
本酵素はpH4.５〜６で安定である。 (4) 至適温度 酵素の失活が最小限に抑制され、かつ酵素反応が速やか
に進む温度は、30℃〜35℃である。 (5) 至適ｐＨ pH3.７から5.０（酢酸緩衝液）、pH5.０から7.３（カコ
ジレート緩衝液）及びpH7.３から8.０（トリス−塩酸緩
衝液）で調製した糖受容体基質を用いて、酵素活性を測
定した。その結果より、本酵素の至適pHは５である。 (6) 分子量 分子量の測定は SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法及
びゲル濾過法で測定した。 SDS−ポリアクリルアミド電
気泳動法では、常法にしたがって、 SDSを含むポリアク
リルアミドゲルの濃度が12.5％のゲルで、分子量マーカ
ー（分子量97,400のフォスフォリラーゼｂ、66,267のウ
シ血清アルブミン、42,400のアルドラーゼ、30,000のカ
ルボニックアンヒドラーゼ、20,100のトリプシンインヒ
ビター、14,400のリゾチーム）とともに電気泳動を行
い、移動度から分子量を求めた。その結果より、本酵素
の分子量（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法）は約6
1,000である。
リウム ダムセーラ JTO160 由来の酵素、フォトバクテ
リウム ダムセーラ ATCC 33539 由来の酵素、フォトバ
クテリウム ダムセーラ ATCC 35083 由来の酵素等が挙
げられるが、一例としてフォトバクテリウム ダムセー
ラ JTO160 由来の酵素の酵素学的性質及び理化学的性質
を以下に示す。 (1) 作用及び基質特異性 ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしく
は遊離の糖鎖中のガラクトース残基の６位、特にその非
還元末端に存在するガラクトースの６位に、またラクト
ース、Ｎ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在
するガラクトースの６位、特にその非還元末端に存在す
るガラクトースの６位に、さらにはガラクトース、マン
ノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミンなどの動物由来の複合糖質を構成しうる単糖
で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転移させ
る。 (2) 熱安定性 本酵素溶液10μl を30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55
℃及び60℃の水浴中で５分間加熱した後、酵素活性を測
定し、非加熱時の酵素活性を100％として加熱後の残存
活性を比較した。その結果より、本酵素は30℃では100
％、35℃では約90％、45℃では約70％の残存活性を示
す。 (3) ｐＨ安定性 pH3.７から5.０（酢酸緩衝液）、pH5.０から7.３（カコ
ジレート緩衝液）及びpH7.３から8.０（トリス−塩酸緩
衝液）で酵素溶液を調製し、この酵素溶液10μl を用い
て酵素活性を測定した。酵素活性を比較した結果より、
本酵素はpH4.５〜６で安定である。 (4) 至適温度 酵素の失活が最小限に抑制され、かつ酵素反応が速やか
に進む温度は、30℃〜35℃である。 (5) 至適ｐＨ pH3.７から5.０（酢酸緩衝液）、pH5.０から7.３（カコ
ジレート緩衝液）及びpH7.３から8.０（トリス−塩酸緩
衝液）で調製した糖受容体基質を用いて、酵素活性を測
定した。その結果より、本酵素の至適pHは５である。 (6) 分子量 分子量の測定は SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法及
びゲル濾過法で測定した。 SDS−ポリアクリルアミド電
気泳動法では、常法にしたがって、 SDSを含むポリアク
リルアミドゲルの濃度が12.5％のゲルで、分子量マーカ
ー（分子量97,400のフォスフォリラーゼｂ、66,267のウ
シ血清アルブミン、42,400のアルドラーゼ、30,000のカ
ルボニックアンヒドラーゼ、20,100のトリプシンインヒ
ビター、14,400のリゾチーム）とともに電気泳動を行
い、移動度から分子量を求めた。その結果より、本酵素
の分子量（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法）は約6
1,000である。
【００２３】ゲル濾過法では、AsahiPak GS-510 なるゲ
ル濾過カラム（旭化学社製）を用いて、緩衝液として0.
2MのNaClを含む20mMリン酸緩衝液（pH6.0）を使用し、
分子量マーカー（分子量 158,000のアルドラーゼ、68,0
00のアルブミン、45,000のアルブミン) のゲル濾過を行
い、各蛋白質の溶出位置を測定した後、本酵素のゲル濾
過を行い、その溶出位置とマーカー蛋白質の溶出位置を
比較計算し、分子量を求めた。その結果より、本酵素の
分子量（ゲル濾過法）は約64,000である。 (7) アミノ末端アミノ酸配列 本酵素のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法によ
り決定した。本酵素溶液20μl (0.3μg/μl ) につい
て、7.５％ SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を常
法に従って行った後、本酵素をウェスタンブロッテイン
グ法によりバイオダインＡ（日本ポール製) なる膜に吸
着させ、アミノ酸配列分析装置477A及び120Aプロテイン
シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）に
より、アミノ末端側12個のアミノ酸配列を決定した。そ
の結果より、本酵素のアミノ末端アミノ酸配列は、 X-A
sn-Ser-Asp-Asn-Thr-Ser-Leu-Lys-Glu-Thr-Valである。
ル濾過カラム（旭化学社製）を用いて、緩衝液として0.
2MのNaClを含む20mMリン酸緩衝液（pH6.0）を使用し、
分子量マーカー（分子量 158,000のアルドラーゼ、68,0
00のアルブミン、45,000のアルブミン) のゲル濾過を行
い、各蛋白質の溶出位置を測定した後、本酵素のゲル濾
過を行い、その溶出位置とマーカー蛋白質の溶出位置を
比較計算し、分子量を求めた。その結果より、本酵素の
分子量（ゲル濾過法）は約64,000である。 (7) アミノ末端アミノ酸配列 本酵素のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法によ
り決定した。本酵素溶液20μl (0.3μg/μl ) につい
て、7.５％ SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を常
法に従って行った後、本酵素をウェスタンブロッテイン
グ法によりバイオダインＡ（日本ポール製) なる膜に吸
着させ、アミノ酸配列分析装置477A及び120Aプロテイン
シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）に
より、アミノ末端側12個のアミノ酸配列を決定した。そ
の結果より、本酵素のアミノ末端アミノ酸配列は、 X-A
sn-Ser-Asp-Asn-Thr-Ser-Leu-Lys-Glu-Thr-Valである。
【００２４】以上説明した本発明のβ−ガラクトシド−
α２，６−シアル酸転移酵素を用いることによって、単
糖の６位、又はオリゴ糖や糖蛋白質糖鎖等に存在するガ
ラクトースの６位にシアル酸を転移することができる。
即ち、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコ
サミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどの複合糖質糖
鎖を構成しうる単糖、ガラクトースを有するラクトー
ス、Ｎ−アセチルラクトサミン等のオリゴ糖、又はアシ
アロフェツイン、アシアロα1 −酸性糖蛋白質等の糖蛋
白質、ガングリオシド等の糖脂質などを糖受容体基質と
して用いるとともに、ＣＭＰ−シアル酸を糖供与体基質
として用い、本酵素を作用させることにより、それぞれ
のシアロ体を生産することができる。
α２，６−シアル酸転移酵素を用いることによって、単
糖の６位、又はオリゴ糖や糖蛋白質糖鎖等に存在するガ
ラクトースの６位にシアル酸を転移することができる。
即ち、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコ
サミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどの複合糖質糖
鎖を構成しうる単糖、ガラクトースを有するラクトー
ス、Ｎ−アセチルラクトサミン等のオリゴ糖、又はアシ
アロフェツイン、アシアロα1 −酸性糖蛋白質等の糖蛋
白質、ガングリオシド等の糖脂質などを糖受容体基質と
して用いるとともに、ＣＭＰ−シアル酸を糖供与体基質
として用い、本酵素を作用させることにより、それぞれ
のシアロ体を生産することができる。
【００２５】反応は、酵素が失活しない条件であればい
ずれの条件でも行うことができる。即ち、反応温度は、
15〜50℃、好ましくは25〜35℃、pHは、４〜7.５、好ま
しくは５〜６である。また、緩衝液としては、このpH範
囲であるならばいずれのものをも用いることができる。
反応によって生じたオリゴ糖、糖蛋白質、糖脂質などの
シアロ体は、カラムクロマトグラフィー等で分離精製す
ることができる。
ずれの条件でも行うことができる。即ち、反応温度は、
15〜50℃、好ましくは25〜35℃、pHは、４〜7.５、好ま
しくは５〜６である。また、緩衝液としては、このpH範
囲であるならばいずれのものをも用いることができる。
反応によって生じたオリゴ糖、糖蛋白質、糖脂質などの
シアロ体は、カラムクロマトグラフィー等で分離精製す
ることができる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 （実施例１）フォトバクテリウム ダムセーラ JTO160 由来のβ−ガ
ラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の製造 マリンブロス2216なる培地を常法にしたがって調製し、
この液体培地10mlを試験管に分注してオートクレーブを
用いて滅菌操作を行った。マリンブロス2216−寒天プレ
ート（寒天濃度1.５％）で継代したフォトバクテリウム
ダムセーラ JTO160 のコロニーから白金耳菌体を採取
し、上記マリンブロス2216液体培地10mlに接種し、30℃
下、毎分150回転で８時間培養した。得られた培養液を
前培養液とした。
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 （実施例１）フォトバクテリウム ダムセーラ JTO160 由来のβ−ガ
ラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の製造 マリンブロス2216なる培地を常法にしたがって調製し、
この液体培地10mlを試験管に分注してオートクレーブを
用いて滅菌操作を行った。マリンブロス2216−寒天プレ
ート（寒天濃度1.５％）で継代したフォトバクテリウム
ダムセーラ JTO160 のコロニーから白金耳菌体を採取
し、上記マリンブロス2216液体培地10mlに接種し、30℃
下、毎分150回転で８時間培養した。得られた培養液を
前培養液とした。
【００２７】本培養は、以下の手順で実施した。3000ml
容のコブ付フラスコに常法にしたがって調製したマリン
ブロス2216なる培地を500ml 張り込み、オートクレーブ
を用いて滅菌操作を行った。これに前培養で得られた培
養液５mlを接種し、30℃下、毎分150回転で16時間培養
した。得られた菌体を遠心分離装置で回収し、湿重量で
約２ｇを得た。
容のコブ付フラスコに常法にしたがって調製したマリン
ブロス2216なる培地を500ml 張り込み、オートクレーブ
を用いて滅菌操作を行った。これに前培養で得られた培
養液５mlを接種し、30℃下、毎分150回転で16時間培養
した。得られた菌体を遠心分離装置で回収し、湿重量で
約２ｇを得た。
【００２８】この菌体を、40mlの１M NaCl、0.２％トラ
イトンX-100なる界面活性剤（関東化学社製）を含む20m
M カコジレート緩衝液（pH6.０）に懸濁し、氷冷下で超
音波破砕した。破砕は、懸濁液の660nm の吸光度が30％
以下になるまで行った。破砕終了後、菌体破砕液につい
て、４℃下、100,500gで１時間遠心分離を行い、破砕液
上清を得た。得られた上清を、0.２％トライトンX-100
なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.
０) 5000mlに対して、セルロースチューブを用いて４℃
で一晩透析した。この透析を３回行ったが、透析終了
後、透析チューブ内に沈澱が生じていたため、再度４℃
下、100,500gで１時間遠心分離を行い、菌体破砕液から
粗酵素液を調製した。
イトンX-100なる界面活性剤（関東化学社製）を含む20m
M カコジレート緩衝液（pH6.０）に懸濁し、氷冷下で超
音波破砕した。破砕は、懸濁液の660nm の吸光度が30％
以下になるまで行った。破砕終了後、菌体破砕液につい
て、４℃下、100,500gで１時間遠心分離を行い、破砕液
上清を得た。得られた上清を、0.２％トライトンX-100
なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.
０) 5000mlに対して、セルロースチューブを用いて４℃
で一晩透析した。この透析を３回行ったが、透析終了
後、透析チューブ内に沈澱が生じていたため、再度４℃
下、100,500gで１時間遠心分離を行い、菌体破砕液から
粗酵素液を調製した。
【００２９】得られた粗酵素液を、予め0.２％トライト
ンX-100なる界面活性剤を含む20mMカコジレート緩衝液
（pH6.０）で平衡化したQ-Sepharose HR 26/10（ファル
マシア製）なる強陰イオン交換カラムに吸着させ、0.２
％トライトンX-100なる界面活性剤を含む20mM カコジレ
ート緩衝液（pH6.０）から１M 塩化ナトリウムを含む同
緩衝液へ、直線濃度勾配法（総溶出量1060ml）で溶出さ
せ、塩化ナトリウム濃度が0.25M から0.35M の間に溶出
してくる酵素活性を有する画分を回収した。
ンX-100なる界面活性剤を含む20mMカコジレート緩衝液
（pH6.０）で平衡化したQ-Sepharose HR 26/10（ファル
マシア製）なる強陰イオン交換カラムに吸着させ、0.２
％トライトンX-100なる界面活性剤を含む20mM カコジレ
ート緩衝液（pH6.０）から１M 塩化ナトリウムを含む同
緩衝液へ、直線濃度勾配法（総溶出量1060ml）で溶出さ
せ、塩化ナトリウム濃度が0.25M から0.35M の間に溶出
してくる酵素活性を有する画分を回収した。
【００３０】回収した画分を、0.２％トライトンX-100
なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.
０）5000mlに対して４℃で一晩透析した。なお、透析外
液は３回交換した。透析した画分を、予め0.２％トライ
トンX-100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩
衝液（pH6.０）で平衡化したハイドロキシアパタイト
（高研製）に吸着させ、0.２％トライトンX-100 なる界
面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.０）か
ら、0.２％トライトンX-100なる界面活性剤を含む0.35M
リン酸緩衝液（pH6.０）へ、直線濃度勾配法（総溶出
量620ml）で溶出させ、リン酸緩衝液濃度が0.08M から
0.16M の間に溶出してくる酵素活性を有する画分を回収
した。この画分を、0.２％トライトンX-100 なる界面活
性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.０）5000ml
に対して４℃で一晩透析した。なお、透析外液は３回交
換した。
なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.
０）5000mlに対して４℃で一晩透析した。なお、透析外
液は３回交換した。透析した画分を、予め0.２％トライ
トンX-100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩
衝液（pH6.０）で平衡化したハイドロキシアパタイト
（高研製）に吸着させ、0.２％トライトンX-100 なる界
面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.０）か
ら、0.２％トライトンX-100なる界面活性剤を含む0.35M
リン酸緩衝液（pH6.０）へ、直線濃度勾配法（総溶出
量620ml）で溶出させ、リン酸緩衝液濃度が0.08M から
0.16M の間に溶出してくる酵素活性を有する画分を回収
した。この画分を、0.２％トライトンX-100 なる界面活
性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.０）5000ml
に対して４℃で一晩透析した。なお、透析外液は３回交
換した。
【００３１】透析した画分を、Sephacryl S-200(ファル
マシア製）なるゲル濾過カラム（2.6 ×60cm）に供し、
0.１M 塩化ナトリウム及び0.２％トライトンX-100なる
界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.０)
で溶出させ、溶出量100ml から140 mlに溶出される酵素
活性を有する画分を分取した。この画分を、0.２％トラ
イトンX-100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート
緩衝液（pH6.０）5000mlに対して４℃で透析した。
マシア製）なるゲル濾過カラム（2.6 ×60cm）に供し、
0.１M 塩化ナトリウム及び0.２％トライトンX-100なる
界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（pH6.０)
で溶出させ、溶出量100ml から140 mlに溶出される酵素
活性を有する画分を分取した。この画分を、0.２％トラ
イトンX-100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート
緩衝液（pH6.０）5000mlに対して４℃で透析した。
【００３２】得られた画分を、予め0.２％トライトンX-
100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（p
H6.０）で平衡化した CDP−ヘキサノールアミンアガロ
ースを担体としたカラム（0.７×1.２cm）に吸着させ、
４mlの同緩衝液でカラムを洗浄後、８mlの２M 塩化ナト
リウムで溶出させた。溶出した画分を、0.２％トライト
ンX-100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝
液（pH6.０）に対して透析した。この画分を SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動したところ、目的酵素は単
一のバンドを示し、約61,000の分子量を示した。この画
分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて 643倍に上
昇し、全活性は257U、活性収率は19％であった。
100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝液（p
H6.０）で平衡化した CDP−ヘキサノールアミンアガロ
ースを担体としたカラム（0.７×1.２cm）に吸着させ、
４mlの同緩衝液でカラムを洗浄後、８mlの２M 塩化ナト
リウムで溶出させた。溶出した画分を、0.２％トライト
ンX-100 なる界面活性剤を含む20mM カコジレート緩衝
液（pH6.０）に対して透析した。この画分を SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動したところ、目的酵素は単
一のバンドを示し、約61,000の分子量を示した。この画
分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて 643倍に上
昇し、全活性は257U、活性収率は19％であった。
【００３３】なお、本酵素の活性測定は、糖供与体基質
（ＣＭＰ−シアル酸）、糖受容体基質（アシアロ糖蛋白
質）及び酵素溶液を混合して酵素反応を行った後、糖受
容体基質に転移されたシアル酸を定量することにより行
った。詳しくは以下の通りである。20mMカコジレート緩
衝液（pH6.０) に、糖受容体としてアシアロフェツイン
を6.25mg/ml 濃度で溶解し、この溶液80μl を糖受容体
基質溶液とした。この糖受容体基質溶液に、14Ｃでシア
ル酸をラベルしたＣＭＰ−シアル酸を含むＣＭＰ−シア
ル酸溶液10μl (6.7nmol、6,700cpm/nmol)を加え、予め
30℃に保温した後に、酵素溶液10μl を添加し、30℃下
で５分間反応させた。反応終了後、反応溶液を0.1MのNa
Clで平衡化した内径10mm、長さ160mm の Sephadex G-50
（ファルマシア社製）のカラムに供した。溶離液として
は、0.1MのNaClを用いた。カラムのボイド画分に溶出す
る、酵素反応によってシアル酸が転移した糖受容体基質
を集め、この画分の放射活性を測定し、転移されたシア
ル酸量を計算して酵素活性を決定した。酵素１単位（1
U) は、１分間に１ナノモルのシアル酸を転移する酵素
量とした。
（ＣＭＰ−シアル酸）、糖受容体基質（アシアロ糖蛋白
質）及び酵素溶液を混合して酵素反応を行った後、糖受
容体基質に転移されたシアル酸を定量することにより行
った。詳しくは以下の通りである。20mMカコジレート緩
衝液（pH6.０) に、糖受容体としてアシアロフェツイン
を6.25mg/ml 濃度で溶解し、この溶液80μl を糖受容体
基質溶液とした。この糖受容体基質溶液に、14Ｃでシア
ル酸をラベルしたＣＭＰ−シアル酸を含むＣＭＰ−シア
ル酸溶液10μl (6.7nmol、6,700cpm/nmol)を加え、予め
30℃に保温した後に、酵素溶液10μl を添加し、30℃下
で５分間反応させた。反応終了後、反応溶液を0.1MのNa
Clで平衡化した内径10mm、長さ160mm の Sephadex G-50
（ファルマシア社製）のカラムに供した。溶離液として
は、0.1MのNaClを用いた。カラムのボイド画分に溶出す
る、酵素反応によってシアル酸が転移した糖受容体基質
を集め、この画分の放射活性を測定し、転移されたシア
ル酸量を計算して酵素活性を決定した。酵素１単位（1
U) は、１分間に１ナノモルのシアル酸を転移する酵素
量とした。
【００３４】（実施例２）シアリルメチル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンの
製造 メチル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンを糖受容体
基質として、シアリルメチル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラ
クトサミンの製造を行った。メチル−β−Ｄ−Ｎ−アセ
チルラクトサミン 79.4mg (200μmol)、ＣＭＰ−シアル
酸 9.4mg（16μmol)及び実施例１で得られたβ−ガラク
トシド−α2,6 −シアル酸転移酵素270Uを、１mlの20mM
カコジレート緩衝液（pH6.０）に溶解し、30℃下で１
時間反応させた。反応の進行は、同条件で上記の1/10ス
ケールで、糖供与体基質として14Ｃでシアル酸をラベル
したＣＭＰ−シアル酸を用い、転移されたシアル酸量を
測定して確認した。反応終了後、反応液１mlに蒸留水を
添加し10mlとした。この溶液を、蒸留水で平衡化したDo
wexl-x2 （フォスフェートフォーム）のカラム（1.５×
９cm，15.9ml，室町化学社製）に供した。
製造 メチル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンを糖受容体
基質として、シアリルメチル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラ
クトサミンの製造を行った。メチル−β−Ｄ−Ｎ−アセ
チルラクトサミン 79.4mg (200μmol)、ＣＭＰ−シアル
酸 9.4mg（16μmol)及び実施例１で得られたβ−ガラク
トシド−α2,6 −シアル酸転移酵素270Uを、１mlの20mM
カコジレート緩衝液（pH6.０）に溶解し、30℃下で１
時間反応させた。反応の進行は、同条件で上記の1/10ス
ケールで、糖供与体基質として14Ｃでシアル酸をラベル
したＣＭＰ−シアル酸を用い、転移されたシアル酸量を
測定して確認した。反応終了後、反応液１mlに蒸留水を
添加し10mlとした。この溶液を、蒸留水で平衡化したDo
wexl-x2 （フォスフェートフォーム）のカラム（1.５×
９cm，15.9ml，室町化学社製）に供した。
【００３５】90mlの蒸留水でカラムを洗浄し、その後５
mM Sodium Phosphate (pH6.8) 60mlで溶出を行い、５ml
ずつ分画した。それぞれの画分のグリコシド結合型シア
ル酸を、過よう素酸−レゾルシノール法で測定し、グリ
コシド結合型シアル酸を含む20mlから50mlまでの画分を
集め、ローターリーエバポレーターで濃縮した。濃縮し
た反応生成物を、活性炭カラム（1.５×6.8cm, 12ml,和
光純薬社製）に供した。その後、カラムの３倍量の蒸留
水でカラムを洗浄し、カラムの２倍量の10％、20％、50
％及び100％エタノールでそれぞれ溶出し、各画分のグ
リコシド結合型シアル酸を過よう素酸−レゾルシノール
法で測定した。グリコシド結合型シアル酸を含む10％、
20％、50％エタノール溶出画分を集め、ローターリーエ
バポレーターで濃縮した。
mM Sodium Phosphate (pH6.8) 60mlで溶出を行い、５ml
ずつ分画した。それぞれの画分のグリコシド結合型シア
ル酸を、過よう素酸−レゾルシノール法で測定し、グリ
コシド結合型シアル酸を含む20mlから50mlまでの画分を
集め、ローターリーエバポレーターで濃縮した。濃縮し
た反応生成物を、活性炭カラム（1.５×6.8cm, 12ml,和
光純薬社製）に供した。その後、カラムの３倍量の蒸留
水でカラムを洗浄し、カラムの２倍量の10％、20％、50
％及び100％エタノールでそれぞれ溶出し、各画分のグ
リコシド結合型シアル酸を過よう素酸−レゾルシノール
法で測定した。グリコシド結合型シアル酸を含む10％、
20％、50％エタノール溶出画分を集め、ローターリーエ
バポレーターで濃縮した。
【００３６】得られた反応生成物について、 1Ｈ−ＮＭ
Ｒ及び13Ｃ−ＮＭＲによる測定を行った。結果をそれぞ
れ図３及び図４に示す。図３及び図４より、酵素合成に
よって生じた反応生成物はα２，６シアリルメチル−β
−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンであることが明らかと
なった。また、反応生成物についてマススペクトルを測
定した。結果を図５に示す。シアリルメチル−β−Ｄ−
Ｎ−アセチルラクトサミンの分子量は 688であるが、図
５の結果より、分子量 689に相当するピーク（(M+H+)
）を確認することができた。
Ｒ及び13Ｃ−ＮＭＲによる測定を行った。結果をそれぞ
れ図３及び図４に示す。図３及び図４より、酵素合成に
よって生じた反応生成物はα２，６シアリルメチル−β
−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンであることが明らかと
なった。また、反応生成物についてマススペクトルを測
定した。結果を図５に示す。シアリルメチル−β−Ｄ−
Ｎ−アセチルラクトサミンの分子量は 688であるが、図
５の結果より、分子量 689に相当するピーク（(M+H+)
）を確認することができた。
【００３７】さらに、糖供与体基質として14Ｃでシアル
酸をラベルしたＣＭＰ−シアル酸を用いた対照実験か
ら、今回の条件で16μmol のα２，６シアリルメチル−
β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンを製造できたと計算
された。 （実施例３）ピリジルアミノ化糖鎖のシアリル化(1) 実施例１で得られた酵素を用い、ピリジルアミノ化糖鎖
を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルアミ
ノ化糖鎖としては、Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ：
バイアンテナリー糖鎖（ Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6
(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4Gl
cNAc-PA、宝酒造製) 及び２種類のＮ−アセチルラクト
サミンタイプモノシアリレイッテド：バイアンテナリー
糖鎖（ NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6 (Gal
β1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3) Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNA
c-PA、 Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6 (NeuAcα2-6Gal
β1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3) Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNA
c-PA、宝酒造製) を用いた。
酸をラベルしたＣＭＰ−シアル酸を用いた対照実験か
ら、今回の条件で16μmol のα２，６シアリルメチル−
β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンを製造できたと計算
された。 （実施例３）ピリジルアミノ化糖鎖のシアリル化(1) 実施例１で得られた酵素を用い、ピリジルアミノ化糖鎖
を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルアミ
ノ化糖鎖としては、Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ：
バイアンテナリー糖鎖（ Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6
(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4Gl
cNAc-PA、宝酒造製) 及び２種類のＮ−アセチルラクト
サミンタイプモノシアリレイッテド：バイアンテナリー
糖鎖（ NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6 (Gal
β1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3) Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNA
c-PA、 Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6 (NeuAcα2-6Gal
β1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3) Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNA
c-PA、宝酒造製) を用いた。
【００３８】いずれの糖受容体を用いた場合も、糖受容
体基質が 2.0μM 、ＣＭＰ−シアル酸が 5.7μM 及び酵
素が１U となるように、それぞれを20mM カコジレート
緩衝液（pH6.０）25μl 中に溶解し、30℃下で20時間反
応させた。反応終了後、 100℃で２分間反応溶液を処理
することにより酵素を失活させた。その後、HPLCで反応
生成物の分析を行った。
体基質が 2.0μM 、ＣＭＰ−シアル酸が 5.7μM 及び酵
素が１U となるように、それぞれを20mM カコジレート
緩衝液（pH6.０）25μl 中に溶解し、30℃下で20時間反
応させた。反応終了後、 100℃で２分間反応溶液を処理
することにより酵素を失活させた。その後、HPLCで反応
生成物の分析を行った。
【００３９】HPLCシステムとしては Shimazu LC-10（島
津製）、カラムとしてはTakara PALPAK Type R (宝酒造
製) を用い、酵素を失活させた反応液10μl を、0.15％
Ｎ−ブタノールを含む100 mM酢酸−トリエチルアミン
（pH5.０) で平衡化したカラムに注入した。ピリジルア
ミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（100 mM酢酸−トリエチ
ルアミン、pH5.０) 及び溶出液Ｂ（0.５％、ｎ−ブタノ
ールを含む100mM 酢酸−トリエチルアミン、pH5.０）を
用い、30〜100％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜35
分）及び 100％溶出液Ｂ（35〜50分）により、順次ピリ
ジルアミノ化糖鎖の溶出を行い、１ml/minの流速、40℃
のカラム温度の条件下、蛍光（Ex：320nm 、Em：400nm)
を検出することによりピリジルアミノ化糖鎖を検出し
た。
津製）、カラムとしてはTakara PALPAK Type R (宝酒造
製) を用い、酵素を失活させた反応液10μl を、0.15％
Ｎ−ブタノールを含む100 mM酢酸−トリエチルアミン
（pH5.０) で平衡化したカラムに注入した。ピリジルア
ミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（100 mM酢酸−トリエチ
ルアミン、pH5.０) 及び溶出液Ｂ（0.５％、ｎ−ブタノ
ールを含む100mM 酢酸−トリエチルアミン、pH5.０）を
用い、30〜100％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜35
分）及び 100％溶出液Ｂ（35〜50分）により、順次ピリ
ジルアミノ化糖鎖の溶出を行い、１ml/minの流速、40℃
のカラム温度の条件下、蛍光（Ex：320nm 、Em：400nm)
を検出することによりピリジルアミノ化糖鎖を検出し
た。
【００４０】その結果、上記の分析方法でＮ−アセチル
ラクトサミンタイプジシアリレイッテド：バイアンテナ
リー糖鎖（ NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6
(NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3) Manβ1-4Gl
cNAcβ1-4GlcNAc-PA) を溶出させた場合の溶出位置と同
一のリテンションタイムを示すピークを検出した。即
ち、本酵素を用いることにより、Ｎ−アセチルラクトサ
ミンタイプ：バイアンテナリー糖鎖及び２種類のＮ−ア
セチルラクトサミンタイプモノシアリレイッテド：バイ
アンテナリー糖鎖のいずれからも、Ｎ−アセチルラクト
サミンタイプジシアリレイッテド：バイアンテナリー糖
鎖を合成することが明らかとなった。
ラクトサミンタイプジシアリレイッテド：バイアンテナ
リー糖鎖（ NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6
(NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3) Manβ1-4Gl
cNAcβ1-4GlcNAc-PA) を溶出させた場合の溶出位置と同
一のリテンションタイムを示すピークを検出した。即
ち、本酵素を用いることにより、Ｎ−アセチルラクトサ
ミンタイプ：バイアンテナリー糖鎖及び２種類のＮ−ア
セチルラクトサミンタイプモノシアリレイッテド：バイ
アンテナリー糖鎖のいずれからも、Ｎ−アセチルラクト
サミンタイプジシアリレイッテド：バイアンテナリー糖
鎖を合成することが明らかとなった。
【００４１】（実施例４）フォトバクテリウム ダムセーラ ATCC 33539 及び ATC
C 35083 由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸
転移酵素の製造 ATCC 33539及びATCC 35083を、マリンブロス2216（ディ
フコ社製）なる液体培地を用いてそれぞれ培養した。微
生物が十分に生育した後、培養液から菌体を遠心分離に
よって集めた。集めた菌体に、0.2 ％トライトンX-100
（関東化学社製）なる界面活性剤を含む、20mMカコジレ
ート緩衝液（pH6.0 ）を添加し、菌体を懸濁した。この
菌体懸濁液を氷零下で超音波処理し、細胞を破砕するこ
とにより、粗酵素溶液を調製した。
C 35083 由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸
転移酵素の製造 ATCC 33539及びATCC 35083を、マリンブロス2216（ディ
フコ社製）なる液体培地を用いてそれぞれ培養した。微
生物が十分に生育した後、培養液から菌体を遠心分離に
よって集めた。集めた菌体に、0.2 ％トライトンX-100
（関東化学社製）なる界面活性剤を含む、20mMカコジレ
ート緩衝液（pH6.0 ）を添加し、菌体を懸濁した。この
菌体懸濁液を氷零下で超音波処理し、細胞を破砕するこ
とにより、粗酵素溶液を調製した。
【００４２】（実施例５）ピリジルアミノ化糖鎖のシアリル化(2) 実施例４で得られた各酵素を用い、ピリジルアミノ化糖
鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルア
ミノ化糖鎖としては、ピリジルアミノ化ラクトース（Ga
lβ1-4Glc-PA 、宝酒造製) を用い、実施例３と同様に
して分析した。
鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルア
ミノ化糖鎖としては、ピリジルアミノ化ラクトース（Ga
lβ1-4Glc-PA 、宝酒造製) を用い、実施例３と同様に
して分析した。
【００４３】糖受容体基質についてのHPLCの分析結果を
図６に、ATCC 33539由来の酵素による反応物質について
のHPLCの分析結果を図７に、ATCC 35083由来の酵素によ
る反応物質についてのHPLCの分析結果を図８に示す。図
７では、リテンションタイム5,500 のピークがピリジル
アミノ化α2,6 −シアリルラクトースを示し、図８で
は、リテンションタイム5,499 のピークがピリジルアミ
ノ化α2,6 −シアリルラクトースを示している。即ち、
本酵素を用いることにより、ピリジルアミノ化ラクトー
スからピリジルアミノ化α2,6 −シアリルラクトースを
合成することが明らかとなった。
図６に、ATCC 33539由来の酵素による反応物質について
のHPLCの分析結果を図７に、ATCC 35083由来の酵素によ
る反応物質についてのHPLCの分析結果を図８に示す。図
７では、リテンションタイム5,500 のピークがピリジル
アミノ化α2,6 −シアリルラクトースを示し、図８で
は、リテンションタイム5,499 のピークがピリジルアミ
ノ化α2,6 −シアリルラクトースを示している。即ち、
本酵素を用いることにより、ピリジルアミノ化ラクトー
スからピリジルアミノ化α2,6 −シアリルラクトースを
合成することが明らかとなった。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、微生物由来の新規なβ
−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を提供す
ることができ、大量にかつ安価に本酵素を提供すること
が可能である。
−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を提供す
ることができ、大量にかつ安価に本酵素を提供すること
が可能である。
【図１】本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル
酸転移酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
酸転移酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図２】本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル
酸転移酵素の熱安定性を示すグラフである。
酸転移酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図３】本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル
酸転移酵素を用いて合成した、α２，６シアリルメチル
−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンの 1Ｈ−ＮＭＲス
ペクトル（303Kで測定）を示すグラフである。
酸転移酵素を用いて合成した、α２，６シアリルメチル
−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンの 1Ｈ−ＮＭＲス
ペクトル（303Kで測定）を示すグラフである。
【図４】本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル
酸転移酵素を用いて合成した、α２，６シアリルメチル
−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンの13Ｃ−ＮＭＲス
ペクトル（303Kで測定）を示すグラフである。
酸転移酵素を用いて合成した、α２，６シアリルメチル
−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンの13Ｃ−ＮＭＲス
ペクトル（303Kで測定）を示すグラフである。
【図５】本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル
酸転移酵素を用いて合成した、α２，６−シアリルメチ
ル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンのマススペクト
ルを示すグラフである。
酸転移酵素を用いて合成した、α２，６−シアリルメチ
ル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルラクトサミンのマススペクト
ルを示すグラフである。
【図６】ピリジルアミノ化ラクトースについてのHPLCに
よる分析結果を示すグラフである。
よる分析結果を示すグラフである。
【図７】ATCC 33539由来のβ−ガラクトシド−α２，６
−シアル酸転移酵素を用いて合成した、ピリジルアミノ
化α2,6 −シアリルラクトースについてのHPLCによる分
析結果を示すグラフである。
−シアル酸転移酵素を用いて合成した、ピリジルアミノ
化α2,6 −シアリルラクトースについてのHPLCによる分
析結果を示すグラフである。
【図８】ATCC 35083由来のβ−ガラクトシド−α２，６
−シアル酸転移酵素を用いて合成した、ピリジルアミノ
化α2,6 −シアリルラクトースについてのHPLCによる分
析結果を示すグラフである。
−シアル酸転移酵素を用いて合成した、ピリジルアミノ
化α2,6 −シアリルラクトースについてのHPLCによる分
析結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 児玉 久 神奈川県横浜市青葉区梅が丘６−２ 日 本たばこ産業株式会社 生命科学研究所 内 (56)参考文献 特開 平５−199871（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−504678（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−505771（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 フォトバクテリウム属に属する微生物由
来であって、下記の理化学的性質を有する新規なβ−ガ
ラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素。 (1) 作用及び特異性：シチジン１リン酸−シアル酸から
シアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラ
クトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質を構成し
うる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転
移させる。 (2) 至適pH：５〜６ (3) 至適温度：30℃ (4) 分子量：64,000±5,000（ゲル濾過による） - 【請求項２】 下記の理化学的性質を有する新規なβ−
ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素。 (1) 作用及び特異性：シチジン１リン酸−シアル酸から
シアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラ
クトース残基の６位、又は動物由来の複合糖質を構成し
うる単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転
移させる。 (2) 至適pH：５ (3) 至適温度：30℃ (4) pH安定性：4.5 〜６ (5) 熱安定性：35℃で５分間加熱後の活性は、初期活性
の約90％を保持する。45℃で５分間加熱後の活性は、初
期活性の約70％を保持する。 (6) 分子量：約61,000（12.5％ SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による） 約64,000（ゲル濾過による） (7) 等電点：4.6 - 【請求項３】 フォトバクテリウム属に属し、請求項１
又は２記載のβ−ガラクトシド−α2，6−シアル酸転移
酵素生産能を有する微生物を培地に培養し、得られた菌
体から酵素を採取することを特徴とする該β−ガラクト
シド−α2，6−シアル酸転移酵素の製造方法。 - 【請求項４】 微生物が、フォトバクテリウム ダムセ
ーラ（Photobacterium damsela) JTO160、ATCC 33539及
びATCC 35083からなる群から選ばれた少なくとも１種で
あることを特徴とする請求項３記載のβ−ガラクトシド
−α２，６−シアル酸転移酵素の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30409094A JP3062409B2 (ja) | 1994-12-07 | 1994-12-07 | 新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素及びその製造方法 |
| US08/739,015 US5827714A (en) | 1994-12-07 | 1996-10-28 | β-galactoside-α-2, 6-sialyltransferase, and a process for producing from Photobacterium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30409094A JP3062409B2 (ja) | 1994-12-07 | 1994-12-07 | 新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08154673A JPH08154673A (ja) | 1996-06-18 |
| JP3062409B2 true JP3062409B2 (ja) | 2000-07-10 |
Family
ID=17928905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30409094A Expired - Fee Related JP3062409B2 (ja) | 1994-12-07 | 1994-12-07 | 新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3062409B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5827714A (en) * | 1994-12-07 | 1998-10-27 | Japan Tobacco Inc. | β-galactoside-α-2, 6-sialyltransferase, and a process for producing from Photobacterium |
| JPH10234364A (ja) * | 1997-02-28 | 1998-09-08 | Japan Tobacco Inc | β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素 |
| JP3140976B2 (ja) | 1997-02-28 | 2001-03-05 | 日本たばこ産業株式会社 | β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子 |
| WO2006054333A1 (ja) * | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Japan Tobacco Inc. | 短縮型シアル酸転移酵素 |
| EP2116598A4 (en) | 2007-03-02 | 2010-06-09 | Japan Tobacco Inc | Novel Beta GALACTOSIDE ALPHA-2,6-SIALYLTRANSFERASE, GENE FOR THEIR CODING AND METHOD FOR INCREASING ENZYMATIC ACTIVITY |
-
1994
- 1994-12-07 JP JP30409094A patent/JP3062409B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08154673A (ja) | 1996-06-18 |
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