WO2022209658A1 - α－１，２グルコシダーゼとその製造方法並びに用途 - Google Patents

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WO2022209658A1
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arthrobacter
glucose
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dna
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輝正 虎谷
貴視 鈴木
恵子 日野
光 渡邊
創 阿賀
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株式会社林原
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/06—Arthrobacter

Definitions

  • the present invention provides an ⁇ -1,2 glucosidase, its production method and uses, more specifically, a novel ⁇ -1,2 glucosidase, its production method, a microorganism capable of producing said enzyme, a DNA encoding said enzyme and its use.
  • Recombinant DNA and transformants comprising
  • Disaccharides in which two molecules of D-glucose are linked via an ⁇ -glucoside bond include trehalose in which D-glucose is ⁇ , ⁇ -1,1 linked between the aldehyde groups at the 1-position, and D-glucose is the aldehyde at the 1-position.
  • Neotrehalose having ⁇ , ⁇ -1,1 bonds between groups, Kojibiose having D-glucose bonded to the 2-position hydroxyl group of another D-glucose by ⁇ -glucosidic bond, and D-glucose to the 3-position hydroxyl group of another D-glucose ⁇ -glucosidically bonded nigerose, maltose in which D-glucose is ⁇ -glucosidically bonded to the 4-position hydroxyl group of another D-glucose, and isomaltose in which D-glucose is ⁇ -glucosidically bonded to the 6-position hydroxyl group of another D-glucose There are 6 types.
  • Enzymes that hydrolyze these ⁇ -glucosidic bonds and catalyze the reaction to produce D-glucose are collectively called “ ⁇ -D-glucosidase (or ⁇ -glucosidase)”, but mainly non-reducing of malto-oligosaccharides.
  • An enzyme that hydrolyzes the ⁇ -1,4 glucosidic bond to which the terminal glucose is bound to produce D-glucose is generally called ⁇ -glucosidase (maltase).
  • Some ⁇ -glucosidases have strong glycosyltransferase activity, and hydrolyze the ⁇ -1,4 glucosidic bond to which the non-reducing terminal glucose is bound using maltose or maltooligosaccharide as a substrate, and convert the cleaved D-glucose to other carbohydrates.
  • the enzyme is also called "transglucosidase". Those originating from Aspergillus niger, which is black koji mold, are widely used.
  • Non-Patent Document 1 discloses the ⁇ -glucosidase originating from Aspergillus niger preferentially hydrolyzes ⁇ -1,4 glucosidic bonds, it also produces isomaltose, nigerose, and kojibiose to a lesser extent due to the transfer action mentioned above. It is also known to catalyze the hydrolysis of isomaltose, nigerose and kojibiose (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 Another ⁇ -glucosidase originating from Aspergillus niger has been reported to preferentially hydrolyze ⁇ -1,4-glucosidic bonds as well as ⁇ -1,3-glucosidic bonds of nigerose and nigerooligosaccharides.
  • ⁇ -1,2 glucosidases that specifically hydrolyze ⁇ -1,2 glucosidic bonds to produce D-glucose from kojibiose or kojioligosaccharides are known.
  • An object of the present invention is to provide a novel enzyme that specifically hydrolyzes the ⁇ -1,2 glucoside bond of kojibiose or koji-oligosaccharide to produce D-glucose, and a method for producing the same.
  • ⁇ -1,2 glucosidase that specifically hydrolyzes ⁇ -1,2 glucooligosaccharides (kojioligosaccharides) to which D-glucose is linked via ⁇ -1,2 glucosidic bonds. Focusing on the fact that it was almost unknown, kojibiose (2-O- ⁇ -D-glucosyl-D-glucose), which is the minimum unit of ⁇ -1,2 glucooligosaccharide, was used as a substrate to specifically hydrolyze kojibiose. Using the activity of producing D-glucose as an index, we have diligently screened microorganisms capable of producing ⁇ -1,2 glucosidase.
  • ⁇ -1,2 gluco-oligosaccharides with a degree of glucose polymerization of 2 to 5 that is, ⁇ -1,2 glucoside bonds of koji-oligosaccharides from kojibiose to kojipentaose were specifically hydrolyzed to convert D-glucose.
  • a bacterium A8F5 strain that produces a completely novel ⁇ -1,2 glucosidase that is an enzyme that produces and has significantly higher heat resistance (temperature stability) than the enzyme described in Non-Patent Document 4.
  • this novel ⁇ -1,2 glucosidase a method for producing the same, a microorganism capable of producing the enzyme, a DNA encoding the enzyme, a recombinant DNA comprising the same, and a transformant are established to establish the present invention. completed.
  • the present invention provides an ⁇ -1,2 glucosidase having the activity of specifically hydrolyzing ⁇ -1,2 glucooligosaccharides with a degree of glucose polymerization of 2 to 5 to produce D-glucose, a method for producing the same, and the enzyme.
  • the above problems are solved by providing a microorganism capable of producing , a DNA encoding the enzyme, a recombinant DNA containing the same, and a transformant.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention is an ⁇ -1,2 glucooligosaccharide (Kojioligosaccharide) with a degree of glucose polymerization of 2 to 5, that is, ⁇ -1 of kojibiose, kojitriose, kojitetraose and kojipentaose. ,2 glucosidic bonds, and hardly hydrolyzes other ⁇ -glucosidic bonds.
  • Non-Patent Document 4 has temperature stability up to 45°C, whereas the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention is stable up to 55°C and is more stable.
  • ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention acts on known kojioligosaccharides, it preferentially hydrolyzes kojibiose. By decomposing and removing kojibiose, a non-digestible koji-oligosaccharide composition can be produced.
  • FIG. 2 shows recombinant DNA for expression of recombinant ⁇ -1,2 glucosidase.
  • FIG. 2 shows the optimum pH of ⁇ -1,2 glucosidase.
  • FIG. 2 shows the optimum temperature for ⁇ -1,2 glucosidase.
  • FIG. 2 shows pH stability of ⁇ -1,2 glucosidase.
  • FIG. 2 shows temperature stability of ⁇ -1,2 glucosidase.
  • the present invention provides an ⁇ -1,2 glucosidase having the activity of specifically hydrolyzing ⁇ -1,2 glucoside bonds of ⁇ -1,2 glucooligosaccharides with a degree of glucose polymerization of 2 to 5 to produce D-glucose. It is related.
  • ⁇ -1,2 glucooligosaccharide with a degree of glucose polymerization of 2 to 5 means kojibiose in which two molecules of D-glucose are linked via an ⁇ -1,2 glucosidic bond, 3 to 5 molecules of D - Kojitriose, Kojitetraose, Kojipentaose in which glucose is linked via an ⁇ -1,2 glucosidic bond.
  • the enzymatic activity of the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention can be measured as follows. Kojibiose as a substrate was dissolved in a 25 mM phosphate buffer (pH 6.5) to a concentration of 0.1% (w/v) to obtain a substrate solution. 0.1 mL of the diluted and prepared enzyme solution was added to initiate the reaction at 40°C. After inactivating the enzyme and stopping the reaction by heating for 10 minutes, the amount of D-glucose in each solution is quantified by the conventional glucose oxidase-peroxidase method (GOD method).
  • GOD method glucose oxidase-peroxidase method
  • the amount of D-glucose produced in 30 minutes of reaction is calculated by subtracting the amount of D-glucose at 0.5 minutes from the amount of D-glucose at 30.5 minutes.
  • One unit (U) of activity of ⁇ -1,2 glucosidase is defined as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 ⁇ mole of kojibiose to produce 2 ⁇ mole of D-glucose per minute under the above conditions.
  • ⁇ -1,2 glucosidases of the present invention include ⁇ -1,2 glucosidases having the following physicochemical properties.
  • pH stability stable in the range of pH 4.5 to 10.5 under conditions of 4°C and 24 hours hold; and
  • temperature stability up to 55°C under conditions of pH 6.5 and 1 hour hold. Stable.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention usually has a predetermined amino acid sequence, an example of which is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing or an amino acid sequence homologous thereto. be done.
  • a mutant enzyme having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is specific for the ⁇ -1,2 glucoside bond of ⁇ -1,2 gluco-oligosaccharide with a degree of glucose polymerization of 2 to 5.
  • amino acid sequence having an amino acid sequence in which one or two or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 to the extent that it retains the enzyme activity of hydrolyzing to and producing D-glucose
  • An amino acid sequence having usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 It is preferable to have The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is derived from the amino acid sequence encoded by the structural gene of ⁇ -1,2 glucosidase (the amino acid sequence written together with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing). One methionine residue encoded by the translation initiation codon is removed.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention is not limited by its source, preferred sources include microorganisms, and particularly the microorganism A8F5 strain isolated from soil by the present inventors or a mutant strain thereof is preferably used.
  • the mutant strains referred to herein include, for example, mutant strains in which culture properties are improved compared to the A8F5 strain as the parent strain by artificially introducing mutations, and ⁇ -1,2 glucosidase-producing ability of the A8F5 strain as the parent strain. Mutant strains that produce higher enzyme production than the strain, mutant strains that produce ⁇ -1,2 glucosidase with higher activity, and the like.
  • the A8F5 strain of microorganisms having the ability to produce ⁇ -1,2 glucosidase is a microorganism newly isolated from soil by the present inventors.
  • the strain was identified by examining the homology with that of known bacteria, and the microorganism A8F5 strain was identified as a bacterium, Arthrobacter humicola. rice field.
  • the present inventors named the microorganism strain A8F5 as the novel microorganism Arthrobacter Humicola A8F5, and designated the Independent Administrative Agency Product Evaluation Technology, located at 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. It was deposited at the National Institutes of Technology (NITE) Patent Microorganisms Depositary (NPMD), received as receipt number NITE ABP-03446 on March 16, 2021, and has been given accession number NITE BP-03446.
  • NITE National Institutes of Technology
  • microorganisms having the ability to produce ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention include not only the above bacteria but also mutant strains thereof, as well as the substrate kojibiose used herein, which is treated with a culture solution as a crude enzyme solution.
  • Microorganisms having ⁇ -1,2-glucosidase-producing ability belonging to other genera and species isolated and selected from nature by screening methods for investigating glucose production, and mutant strains thereof are also included.
  • the present invention also relates to a DNA having a base sequence encoding the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention and a base sequence complementary to the base sequence.
  • the DNA of the present invention may be naturally derived or artificially synthesized as long as it has a base sequence encoding the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention.
  • Natural sources include, for example, Arthrobacter genus microorganisms including Arthrobacter Humicola A8F5 strain.
  • Encoding DNA can be cloned.
  • chemical synthesis may be performed based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8 in the sequence listing. It is also possible to advantageously carry out PCR synthesis using a DNA containing the DNA as a template and chemically synthesized DNA as an appropriate primer.
  • An example of the DNA according to the present invention includes a DNA having a base sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, a base sequence homologous thereto, and a base sequence complementary to those base sequences. .
  • a DNA having a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing is used as long as it retains the activity of the encoded ⁇ -1,2 glucosidase.
  • the DNA of the present invention also includes those substituted with the bases of and those having a complementary base sequence thereto.
  • Recombinant DNA is generally composed of DNA and an autonomously replicable vector, and can be prepared relatively easily by conventional recombinant DNA techniques if the DNA is available.
  • Examples of such vectors include plasmids, phages, cosmids, etc., and can be appropriately selected according to the cells to be introduced or the method of introduction.
  • the specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in host cells may be appropriately selected.
  • a promoter sequence may be appropriately selected in order to ensure the expression of the above gene, and this and the above gene may be integrated into various plasmids or the like to be used as an expression vector.
  • expression vectors include, for example, phage vectors, plasmid vectors, viral vectors, retroviral vectors, chromosomal vectors, episomal vectors and virus-derived vectors (e.g. bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, yeast chromosomal elements and viruses (e.g.
  • Baculovirus, papovavirus, vaccinia virus, adenovirus, avian pox virus, pseudorabies virus, herpes virus, lentivirus and retrovirus)) and combinations thereof (eg, cosmids and phagemids) are available.
  • Preferred vectors for use in bacteria include, for example, pRSETA, pQE-70, pQE-60, pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH6a, pNH18A and pNH46A; Examples include pDR540 and pRIT5.
  • Preferred vectors for use in eukaryotes also include pPICZ ⁇ A, pWLNE0, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL.
  • DNA of the present invention For inserting the DNA of the present invention into such vectors, methods commonly used in the art are employed. Specifically, first, gene DNA containing the target DNA and an autonomously replicable vector are cleaved with restriction enzymes and/or ultrasonic waves, and then the resulting DNA fragment and vector fragment are ligated. The recombinant DNA thus obtained can be introduced into a host as appropriate to form a transformant, which can be cultured to replicate infinitely.
  • the recombinant DNA obtained in this way can be introduced into appropriate host microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast.
  • Transformants can be obtained by applying the colony hybridization method or by culturing in a nutrient medium and selecting those that produce ⁇ -1,2 glucosidase.
  • the medium used for culturing the microorganisms of the present invention may be any nutrient medium capable of growing the microorganisms and producing ⁇ -1,2 glucosidase. Either medium or natural medium may be used. Any carbon source can be used as long as it can be used for the growth of microorganisms. Examples of carbon sources include starch and partial decomposition products thereof, plant-derived starch and phytoglycogen, animal- and microorganism-derived glycogen and pullulan, and partial decomposition products thereof.
  • Sugars such as , glucose, fructose, lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, and molasses
  • organic acids such as citric acid and succinic acid
  • alcohols such as methanol and ethanol
  • concentration of these carbon sources in the medium can be appropriately selected depending on the type of carbon source.
  • nitrogen sources for example, inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates, and organic nitrogen-containing substances such as urea, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract and meat extract can be appropriately used.
  • salts such as calcium salts, magnesium salts, potassium salts, sodium salts, phosphates, manganese salts, zinc salts, iron salts, copper salts, molybdenum salts, and cobalt salts can be used as appropriate.
  • salts such as calcium salts, magnesium salts, potassium salts, sodium salts, phosphates, manganese salts, zinc salts, iron salts, copper salts, molybdenum salts, and cobalt salts can be used as appropriate.
  • amino acids, vitamins and the like can be appropriately used as necessary.
  • Cultivation is usually carried out aerobically at a temperature of 15 to 37°C and a pH range of 5.5 to 10, preferably at a temperature of 20 to 34°C and a pH range of 5.5 to 8.5.
  • the culture time may be any time that allows the microorganism capable of producing ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention to proliferate, preferably 10 to 150 hours.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture medium under the culture conditions is not particularly limited, but is usually preferably 0.5 to 20 ppm. For this purpose, measures such as adjusting the amount of ventilation and stirring are employed as appropriate.
  • the culture method may be either batch culture or continuous culture.
  • the culture containing the enzyme of the present invention is collected.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase activity is mainly found in cultured cells, and a cell crushing extract can be collected as a crude enzyme solution, or the entire culture can be used as a crude enzyme solution.
  • a known solid-liquid separation method is employed to recover the cells from the culture. For example, a method of centrifuging the culture itself, a method of filtration separation using a precoat filter or the like, a method of separation by membrane filtration such as a flat membrane or a hollow fiber membrane, and the like are appropriately employed.
  • the extract of disrupted cells can be used as it is as a crude enzyme solution, it is generally used after being concentrated.
  • an ammonium sulfate (ammonium sulfate) salting-out method an acetone and alcohol precipitation method, a membrane concentration method using a flat membrane, a hollow membrane, or the like can be employed.
  • ⁇ -1,2 glucosidase can also be immobilized by a known method using a cell disruption extract having ⁇ -1,2 glucosidase activity and its concentrate.
  • a method of binding to an ion exchanger, a method of covalent bonding/adsorption with a resin or membrane, a method of entrapment using a polymer substance, or the like can be employed as appropriate.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention can be used as it is or after being concentrated, but if necessary, it can be further separated and purified by a known method before use.
  • a known method before use can also For example, after dialysis of the concentrated crude enzyme sample obtained by salting out the supernatant of the crushed bacterial cell extract with ammonium sulfate, anion exchange using "DEAE-Toyopearl 650S" gel (manufactured by Toso Corporation), etc.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention can be obtained as a purified enzyme that has been electrophoretically purified to a single level by purification using lithography or the like.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention specifically releases glucose residues bound to carbohydrates via ⁇ -1,2 glucosidic bonds, it is allowed to act on carbohydrates of unknown structure to produce D-glucose. It is possible to clarify whether or not the unknown sugar is a sugar having an ⁇ -1,2 glucosyl group by examining whether or not is liberated.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention can efficiently decompose kojibiose and kojitriose, the rate of decomposition of kojitetraose and kojipentaose is relatively slow.
  • Kojibiose and kojitriose are degraded by acting on oligosaccharides, and D-glucose is removed from the resulting decomposition products to produce kojioligosaccharides larger than kojitriose, that is, kojioligosaccharides having a glucose polymerization degree of 4 or more.
  • Kojitetraose Kojipentaose, Kojihexaose, Kojiheptaose, Kojioctaose, etc.
  • Kojitetraose Kojipentaose, Kojihexaose, Kojiheptaose, Kojioctaose, etc.
  • indigestible kojioligosaccharide composition can be produced as a main component of an indigestible kojioligosaccharide composition.
  • the present invention will be described in detail below through experiments.
  • the activity of ⁇ -1,2 glucosidase in the following experiments was determined by the activity measurement method described above as the activity of hydrolyzing the substrate kojibiose to produce D-glucose.
  • ⁇ Experiment 1 Screening for ⁇ -1,2 glucosidase-producing bacteria> 928 strains of microbial strains isolated from the soil, Kojibiose (purity: 97.0% by mass, Hayashibara Co., Ltd.) 15 g / L, yeast extract (trade name “Yeast Extract SH”, sold by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) 1.0 g/L, peptone (trade name "Hipolypeptone", sold by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) 5.0 g/L, dipotassium phosphate 1.0 g/L, monosodium phosphate heptahydrate 0.6 g/ L, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g/L, ferrous sulfate heptahydrate 0.01 g/L, manganese sulfate pentahydrate 0.01 g/L, calcium carbonate 3.0 g/L , and water (3 mL each, sterilized in an autoclave at
  • TLC plate silica gel aluminum plate (trade name “silica gel 60F254”, 10 x 20 cm, manufactured by Merck)
  • solvent n-butanol:pyridine:water (volume ratio 6:4:1)
  • Developing method ascending method, 1-time development Detection method: sulfuric acid-methanol method
  • the lanes indicated by symbols "9” to “13” represent the crude enzyme solution of the A8F5 strain, respectively, maltose, isomaltose, nigerose, It is a chromatogram of the reaction solution reacted with trehalose and neotrehalose, and the lanes indicated by symbols “2" to “6” are chromatograms of standard products of maltose, isomaltose, nigerose, trehalose, and neotrehalose) .
  • the enzyme from strain A8F5 was found to be a novel ⁇ -1,2 glucosidase that specifically hydrolyzes kojibiose.
  • ⁇ Experiment 2 Identification of ⁇ -1,2 glucosidase-producing strain A8F5>
  • the base sequence of the 16S rRNA (rDNA) of the ⁇ -1,2 glucosidase-producing strain A8F5 isolated in the soil screening was determined, and the strain of the microorganism A8F5 was identified based on this base sequence information.
  • the above monocolonized A8F5 strain was fished, suspended in 50 ⁇ L of a commercially available simple DNA extraction reagent (trade name “MightyPrepreagent for DNA”, sold by Takara Bio Inc.), treated at 95° C. for 10 minutes, and then treated for 15 minutes. The supernatant containing the genomic DNA was collected by centrifugation at ,000 rpm for 2 minutes.
  • a sense primer 8F having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and an antisense primer 1512R having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing were used for the recovered genomic DNA of the A8F5 strain.
  • PCR was performed and the PCR amplified product was subjected to agarose electrophoresis, a PCR amplified product of about 1.5 kbp was observed, which was recovered by ethanol precipitation and used as 16S rDNA.
  • Experiment 2-2 Determination of 16S rDNA base sequence>
  • the nucleotide sequence of the A8F5 strain 16S rDNA obtained in Experiment 2-1 was determined by a conventional method, and it was found to have the nucleotide sequence (1,263 bp) shown by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • Experiment 2-3 Identification of microorganism A8F5 strain> The nucleotide sequence of 16S rDNA determined in Experiment 2-2 was subjected to homology search from the nucleotide sequence database using the nucleotide sequence homology search program "BLASTN".
  • Table 1 shows the results of the top 5 species that showed high homology in the homology search performed on the 16S rDNA of the A8F5 strain.
  • the 16S rDNA nucleotide sequence of the A8F5 strain showed 100% homology (identity) with Arthrobacter humicola. In general, it is said that if there is 99% or more homology in the classification of fungi based on the nucleotide sequence of 16S rDNA, there is a high possibility that they are of the same species. Based on the nucleotide sequence of 16S rDNA, the A8F5 strain was identified as Arthrobacter humicola and designated as Arthrobacter humicola A8F5 strain.
  • the Arthrobacter Humicola A8F5 strain has been deposited at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) located at 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. It was received as receipt number NITE ABP-03446 on March 16, 2016, and has been given accession number NITE BP-03446.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • NPMD Patent Microorganism Depositary Center
  • ⁇ Experiment 4 Purification of ⁇ -1,2 glucosidase> Ammonium sulfate was added to 200 mL of the crude enzyme solution obtained in Experiment 3 to give a final concentration of 1.5 M, dissolved, left overnight to salt out, and the resulting precipitate was collected by centrifugation and added to 10 mM phosphate buffer. (pH 7.0) to obtain 28 mL of dialyzed enzyme solution with a total activity of 22.0 U. Anion exchange column chromatography (gel volume: 7 mL), the ⁇ -1,2 glucosidase activity was adsorbed to the anion exchanger.
  • ⁇ -1,2 glucosidase active fraction was collected from the eluted fraction, dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), and anion-exchanged pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0).
  • anion column chromatography gel volume 1 mL
  • a chromatographic carrier trade name “Resource Q”, manufactured by GE Healthcare
  • a fraction with ⁇ -1,2 glucosidase activity was collected from the eluted fraction, dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), and treated with hydroxyapatite pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0).
  • ⁇ -1,2 glucosidase activity was eluted without being adsorbed to hydroxyapatite.
  • a fraction with ⁇ -1,2 glucosidase activity was collected from the eluted fraction, membrane-concentrated to 2 mL, and then gel filtration carrier (trade name: "Superdex 200 pg", manufactured by GL Healthcare Life Science), subjected to gel filtration column chromatography (gel volume 120 mL), eluted with the same buffer, and ⁇ -1,2 glucosidase active fractions were collected from the eluted fractions. did.
  • ⁇ Experiment 5-1 Molecular weight> The ⁇ -1,2 glucosidase purified product obtained by the method of Experiment 4 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 5 to 20% (w/v) concentration gradient) and molecular weight markers electrophoresed at the same time. (Bio-Rad Laboratories), the molecular weight of the ⁇ -1,2 glucosidase was found to be 68,000 ⁇ 5,000 daltons.
  • ⁇ Experiment 5-2 N-terminal amino acid sequence>
  • the ⁇ -1,2 glucosidase purified product obtained by the method of Experiment 4 was subjected to N-terminal amino acid sequence analysis by standard Edman degradation. 4 was found, namely Thr-Val-Gln-Pro-Gly-Leu-His.
  • ⁇ Experiment 6-1 Cloning of DNA encoding ⁇ -1,2 glucosidase and determination of nucleotide sequence> After lysing the cells of the Arthrobacter Humicola A8F5 strain obtained by culturing for 72 hours in the liquid medium used in Experiment 3 with lysozyme, DNA extraction kit (trade name "NucleoBond HMW DNA” (Takara Bio Inc. ) to extract the genomic DNA. The obtained genomic DNA was subjected to agarose (0.7%) electrophoresis, and the purity was confirmed by confirming the rRNA band. The genomic DNA was analyzed using a DNA sequencer.
  • the structural gene of ⁇ -1,2 glucosidase derived from Arthrobacter Humicola A8F5 strain has a base sequence with a chain length of 1,956 bp shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and It was found to encode an amino acid sequence consisting of 652 residues.
  • ⁇ -1,2 Glucosidase was found to have an amino acid sequence consisting of 651 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • the molecular weight of ⁇ -1,2 glucosidase derived from Arthrobacter Humicola A8F5 strain was calculated to be 68,650 daltons from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. This value agreed well with the molecular weight of 68,000 ⁇ 5,000 daltons determined by SDS-PAGE in Experiment 5-1.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase gene sequence was amplified.
  • PCR was performed using the expression plasmid vector "pRSET A" as a template to amplify the target gene sequence.
  • transformation into E. coli XL10 Gold, colony PCR, and plasmid extraction were carried out. After linearizing the obtained plasmids with restriction enzymes, they were subjected to agarose gel electrophoresis to confirm that each plasmid had the correct size.
  • the obtained recombinant DNA for expression "pRSETA/ ⁇ 1,2GDHis" is shown in FIG. As shown in FIG.
  • the ⁇ -1,2-glucosidase gene in the recombinant DNA for expression, is expressed using the T7 promoter, and the recombinant ⁇ -1,2-glucosidase has a histidine at its C-terminus. It is designed to be produced in a form with a His tag consisting of 6 residues. Then, "pRSETA/ ⁇ 1,2GDHis" was introduced into Escherichia coli BL21(DE3)plysS converted into competent cells as a host and transformed to obtain a transformant "RSETA/ ⁇ 1,2GDHis".
  • ⁇ Experiment 6-3 Expression of recombinant ⁇ -1,2 glucosidase in transformant> TB medium containing 100 mg/mL ampicillin and 10 mg/mL chloramphenicol (available from Invitrogen Co., Ltd.) was prepared by placing 50 mL each in a 500 mL Erlenmeyer flask, and 16 tubes were prepared. The transformant 'RSETA/ ⁇ 1,2GDHis' was inoculated and cultivated at 27° C. for 16 hours with shaking at 240 rpm. The resulting culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to collect the cells, which were washed with physiological saline.
  • the washed cells were suspended in 10 mL of water containing a protease inhibitor, crushed with an ultrasonicator (trade name “ULTRASONIC PROCESSOR Q700”, manufactured by QSONICA), and then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was harvested by To about 10 mL of the supernatant of the cell crushed extract obtained, 10 mL of 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5 M sodium chloride and 40 mM imidazole was added to prepare a crude enzyme solution. The total ⁇ -1,2-glucosidase activity in the resulting crude enzyme solution was 724 units.
  • ⁇ Experiment 6-4 Purification of recombinant ⁇ -1,2 glucosidase> 20 mL of the crude enzyme solution obtained in Experiment 6-3 was charged into a column (diameter 0.5 x 15 cm, volume: 3 mL) packed with "Ni Sepharose 6 Fast Flow” (manufactured by GL Healthcare Life Sciences), and His Tagged recombinant ⁇ -1,2 glucosidase was adsorbed onto the column.
  • washing was performed by passing 5 beds of eluent A (20 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5 M sodium chloride and 40 mM imidazole), and further eluent A and eluent B (150 mM imidazole
  • eluent A (20 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5 M sodium chloride and 40 mM imidazole
  • eluent A and eluent B 150 mM imidazole
  • the column was further washed by passing a mixture of 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) at a ratio of 95:5 through 5 beds, and then passing eluent B through 5 beds.
  • the adsorbed His-tagged recombinant ⁇ -1,2-glucosidase was eluted, and the ⁇ -1,2-glucosidase-active fraction was filtered through an ultrafiltration membrane (trade name “Amicon Ultra 0.5 50K”, Merck Millipore).
  • the purified enzyme preparation was prepared by exchanging the buffer solution with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) using the company's commercial product.
  • the purified recombinant ⁇ -1,2 glucosidase had a specific activity of 59.2 units/mg-protein, a yield from the crude enzyme solution of 31.1%, and a purification ratio of 31.2. was double.
  • this purified enzyme preparation was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, almost a single recombinant ⁇ -1,2 glucosidase protein band was observed.
  • ⁇ Experiment 7-1 optimum pH and optimum temperature> Using a purified preparation of recombinant ⁇ -1,2 glucosidase, the effects of pH and temperature on ⁇ -1,2 glucosidase activity were investigated according to the activity measurement method. These results are shown in FIG. 3 (optimal pH) and FIG. 4 (optimal temperature).
  • the optimum pH of the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention was pH 6.0 to 6.5 under reaction conditions of 40° C. for 30 minutes. Also, it was found that the optimum temperature is 35 to 45° C. under the conditions of pH 6.5 and reaction for 30 minutes.
  • pH stability and temperature stability> A purified preparation of recombinant ⁇ -1,2 glucosidase was used to examine the pH stability and temperature stability of ⁇ -1,2 glucosidase activity. pH stability was determined by keeping the enzyme in 90 mM Britton-Robinson buffer at each pH for 24 hours at 4° C., then adjusting the pH to 6.5 and measuring the residual enzyme activity. Temperature stability was measured using 25 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.1% bovine serum albumin, keeping the enzyme solution at each temperature for 1 hour, ice-cooling, and measuring the remaining D-glucose producing activity.
  • the substrate specificity of ⁇ -1,2 glucosidase was investigated using the 27 carbohydrates shown in Table 3 below. Each carbohydrate was dissolved as a substrate in 20 mM Britton-Robinson buffer (pH 6.5) to a final concentration of 1%, and ⁇ -1,2 glucosidase was added to 1 U or 10 U of the enzyme per gram of solid substrate. The working amount was reacted at 30° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction product produced from each substrate was subjected to the same TLC analysis as used in Experiment 1 to confirm the presence or absence of enzymatic action on each saccharide and the produced saccharide.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention not only hydrolyzes ⁇ -1,2 bonds of kojibiose to produce D-glucose, but also kojitriose, kojitetraose and The ⁇ -1,2 bonds of kojipentaose were hydrolyzed to produce D-glucose from each. However, the effect on kojipentaose was weak, and the production rate of D-glucose was slow. It was also found that the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention acts very slightly on nigerose (3-O- ⁇ -glucosylglucose) to produce D-glucose.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention is a series of maltooligosaccharides including maltose, a series of isomaltooligosaccharides including isomaltose, trehalose, sucrose, lactose, cellobiose, laminaribiose, gentibiose, starch, dextran. , pullulan, and other carbohydrates that do not have an ⁇ -1,2 glucosidic bond.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention specifically hydrolyzes the ⁇ -1,2 glucosidic bonds of kojibiose, kojitriose, kojitetraose and kojipentaose to form D-glucose. , that is, an enzyme that specifically hydrolyzes ⁇ -1,2 glucooligosaccharides with a degree of polymerization of glucose of 2 to 5.
  • ⁇ Preparation of recombinant ⁇ -1,2 glucosidase> Place about 3 L of TB medium (available from Invitrogen Co., Ltd.) in a 5 L-capacity jar fermenter, sterilize at 120° C. for 20 minutes, and add 100 mg/mL of ampicillin and 10 mg/mL of chloramphenicol, which have been sterilized by filtration, aseptically. was added to prepare the TB medium used in Experiment 6-3.
  • a 1% (v/v) seed culture solution of the transformant "RSETA/ ⁇ 1,2GDHis" obtained in Experiment 6-2 was aseptically added and cultured at 27°C for 16 hours with aeration and stirring.
  • the culture solution is centrifuged to collect the cells, suspended in about 300 mL of buffer solution, disrupted by a conventional method, and centrifuged to obtain bacteria with an ⁇ -1,2 glucosidase activity of 45 U/mL.
  • the body homogenate supernatant was obtained as a crude enzyme solution.
  • This crude enzyme solution was concentrated about 10-fold with an ultrafiltration membrane according to a conventional method to obtain a concentrated enzyme preparation with a total activity of about 13,200 U.
  • This product can be used as a recombinant ⁇ -1,2 glucosidase agent.
  • the obtained saccharide composition was subjected to conventional chromatographic separation to remove monosaccharide and disaccharide fractions and purified to give 2.7% by mass of Kojitriose, 12.1% by mass of Kojitetraose, Koji A koji-oligosaccharide syrup containing 29.4% by mass of pentaose, 30.4% by mass of kojihexaose, 19.9% by mass of kojiheptaose, 5.1% by mass of kodioctaose, and 0.4% by mass of kojinonaose was obtained. rice field.
  • This product was an indigestible syrup composed of kojioligosaccharides larger than kojibiose digested in the human body, that is, kojioligosaccharides with a degree of glucose polymerization of 3 or more.
  • This product has properties such as indigestibility, low sweetness, osmotic pressure control, shapeability, gloss imparting properties, moisturizing properties, viscosity, sugar crystallization prevention properties, resistance to fermentation, and anti-aging properties for starch. Therefore, it can be advantageously used for various foods and drinks, health foods, feeds, feeds, cosmetics, pharmaceuticals, luxury goods, and the like.
  • the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention is a hitherto unknown novel enzyme. Establishment of the ⁇ -1,2 glucosidase of the present invention and its production method is of great significance not only in terms of academic value, but also in the food, cosmetics and pharmaceutical industries related thereto.
  • M maltooligosaccharide marker
  • G 1 D-glucose
  • G 2 maltose
  • G 3 maltotriose
  • G 4 maltotetraose 1: kojibiose standard
  • kojibiose standard 2 maltose standard 3: isomaltose standard 4: nigerose standard 5: Trehalose reference standard 6: Neotrehalose reference standard 7: A8F5 strain crude enzyme (disintegrated bacterial cell extract) only 8: Reaction mixture in which the A8F5 strain crude enzyme was allowed to act on kojibiose
  • 9 A8F5 strain crude enzyme was allowed to act on maltose Reaction solution 10: reaction solution in which the crude enzyme of the A8F5 strain was allowed to act on isomaltose Reaction solution 11: reaction solution in which the crude enzyme of the A8F5 strain was allowed to act on nigerose 12: reaction solution in which the crude enzyme of the A8F5 strain was allowed to act on trehalose 13:
  • P T7 T7 promoter
  • RBS ribosome binding site
  • ⁇ 1,2-Glucosidase ⁇ -1,2 glucosidase structural gene
  • His-tag histidine (6 residues)
  • f1 ori f1 phage replication origin
  • Ampicillin ampicillin resistance gene
  • pUC ori replication origin of pUC

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Abstract

α－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解する新規酵素とその製造方法を提供することを課題とし、グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖におけるα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコース生成する活性を有するα－１，２グルコシダーゼとその製造方法を提供することにより上記課題を解決する。

Description

α－１，２グルコシダーゼとその製造方法並びに用途
　本発明は、α－１，２グルコシダーゼとその製造方法並びに用途、詳細には、新規α－１，２グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素の産生能を有する微生物、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体に関するものである。
　Ｄ－グルコース二分子がα－グルコシド結合を介して結合した二糖には、Ｄ－グルコースがその１位アルデヒド基同士でα，α－１，１結合したトレハロース、Ｄ－グルコースがその１位アルデヒド基同士でα，β－１，１結合したネオトレハロース、Ｄ－グルコースが他のＤ－グルコースの２位水酸基とα－グルコシド結合したコージビオース、Ｄ－グルコースが他のＤ－グルコースの３位水酸基とα－グルコシド結合したニゲロース、Ｄ－グルコースが他のＤ－グルコースの４位水酸基とα－グルコシド結合したマルトース、Ｄ－グルコースが他のＤ－グルコースの６位水酸基とα－グルコシド結合したイソマルトースの６種類が存在する。これらのα－グルコシド結合を加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する反応を触媒する酵素は、「α－Ｄ－グルコシダーゼ（又はα－グルコシダーゼ）」と総称されるものの、主にマルトオリゴ糖の非還元末端グルコースが結合したα－１，４グルコシド結合を加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する酵素が、一般にα－グルコシダーゼ（マルターゼ）と呼ばれている。
　一部のα－グルコシダーゼは糖転移活性が強く、マルトースやマルトオリゴ糖を基質として非還元末端グルコースが結合したα－１，４グルコシド結合を加水分解するとともに、切り出したＤ－グルコースを他の糖質の非還元末端グルコースの６位水酸基に転移することにより、Ｄ－グルコースがα－１，６グルコシド結合を介して連結した構造を有するイソマルトオリゴ糖を生成することが知られており、このような酵素は「トランスグルコシダーゼ」とも呼ばれている。黒麹カビであるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）起源のものが汎用されている。アスペルギルス・ニガー起源のα－グルコシダーゼは、α－１，４グルコシド結合を優先的に加水分解するものの、上記転移作用によりイソマルトースや、僅かながらニゲロース、コージビオースをも生成し、その逆反応として、わずかにイソマルトース、ニゲロース、コージビオースの加水分解をも触媒することが知られている（非特許文献１）。
　一方、α－１，４グルコシド結合には殆ど作用せず、α－１，６グルコシド結合を特異的に加水分解する酵素として、イソマルトオリゴ糖の非還元末端グルコースが結合したα－１，６グルコシド結合を加水分解するオリゴ－１，６グルコシダーゼが知られている（非特許文献２）。また、アスペルギルス・ニガー起源の別のα－グルコシダーゼは、α－１，４グルコシド結合とともにニゲロースやニゲロオリゴ糖のα－１，３グルコシド結合を優先的に加水分解することが報告されている（非特許文献３）。
　２０２０年に静岡大学の中村らは、グラム陰性の好気性桿菌であるフラボバクテリウム・ジョンソニアエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）　ＮＢＲＣ　１４９４２株のゲノムＤＮＡから未知蛋白（Ｆｊｏｈ４４２８）遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として発現させ、産生されたＦｊｏｈ４４２８を精製し、その酵素活性を解析したところ、コージビオースとコージトリオースを分解しＤ－グルコースを生成する新規なα－１，２グルコシダーゼであったことを報告している（非特許文献４）。
　しかしながら、上記フラボバクテリウム属微生物由来酵素を除けば、α－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、コージビオース又はコージオリゴ糖からＤ－グルコースを生成するα－１，２グルコシダーゼは知られていない。
千葉ら、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），第５５巻、２３２７－２３３５頁（１９９１） 鈴木ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），第１５８巻、７７－８３頁（１９８６） 木村ら、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．），第６７巻、３３８０－３３８８頁（２０１９） 応用糖質科学、第１０巻、第４号（２０２０）　２０２０年度大会講演要旨集　一般講演番号Ｃ－０６
　本発明は、コージビオース又はコージオリゴ糖のα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する新規酵素とその製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者等は、Ｄ－グルコースがα－１，２グルコシド結合を介して連結したα－１，２グルコオリゴ糖（コージオリゴ糖）を特異的に加水分解するα－１，２グルコシダーゼがこれまで殆ど知られていなかったことに着目し、α－１，２グルコオリゴ糖の最小単位であるコージビオース（２－Ｏ－α－Ｄ－グルコシル－Ｄ－グルコース）を基質とし、コージビオースを特異的に加水分解しＤ－グルコースを生成する活性を指標としてα－１，２グルコシダーゼ産生能を有する微生物のスクリーニングを鋭意行った。その結果、グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖、すなわち、コージビオースからコージペンタオースまでのコージオリゴ糖のα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する酵素であって、且つ、非特許文献４記載の酵素よりも耐熱性（温度安定性）が顕著に高い全く新規なα－１，２グルコシダーゼを産生する細菌Ａ８Ｆ５株を見出した。そして、この新規なα－１，２グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素の産生能を有する微生物、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立して本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する活性を有するα－１，２グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素の産生能を有する微生物、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を提供することにより上記課題を解決するものである。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼは、グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖（コージオリゴ糖）、すなわち、コージビオース、コージトリオース、コージテトラオース及びコージペンタオースのα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、他のα－グルコシド結合をほとんど加水分解しない。従って、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、その基質特異性の厳密さから、未知糖質の構造解析を行う学術的な研究において、α－１，２グルコシド結合したグルコース残基を有するか否かを調べるための酵素試薬として有用である。また、非特許文献４で報告された酵素は、その温度安定性が４５℃までであるのに対し、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、５５℃まで安定であり、より安定性に優れるという利点を有する。さらに、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、公知のコージオリゴ糖に作用させるとコージビオースを優先的に加水分解することから、コージオリゴ糖に作用させコージオリゴ糖中のヒト体内で消化されやすいコージビオースを分解除去すれば、難消化性のコージオリゴ糖組成物を製造することができる。
土壌より分離したＡ８Ｆ５株の菌体破砕抽出液上清を各種グルコ二糖（コージビオース、マルトース、イソマルトース、ニゲロース、トレハロース及びネオトレハロース）にそれぞれ作用させた反応液のＴＬＣクロマトグラムである。 組換え型α－１，２グルコシダーゼの発現用の組換えＤＮＡを示す図である。 α－１，２グルコシダーゼの至適ｐＨを示す図である。 α－１，２グルコシダーゼの至適温度を示す図である。 α－１，２グルコシダーゼのｐＨ安定性を示す図である。 α－１，２グルコシダーゼの温度安定性を示す図である。
　本発明は、グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖のα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する活性を有するα－１，２グルコシダーゼに係るものである。
　本発明でいう「グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖」とは、２分子のＤ－グルコースがα－１，２グルコシド結合を介して結合したコージビオース、３乃至５分子のＤ－グルコースがα－１，２グルコシド結合を介して連結したコージトリオース、コージテトラオース、コージペンタオースを意味する。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼの酵素活性は、次のようにして測定することができる。基質としてのコージビオースを濃度０．１％（ｗ／ｖ）となるように濃度２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させて基質溶液とし、その基質溶液１．０ｍＬに同緩衝液で希釈、調製した酵素液０．１ｍＬを加えて４０℃で反応を開始し、反応０．５分と反応３０．５分の時点で反応液を０．３ｍＬずつサンプリングし、それぞれ１００℃の湯浴で１０分間加熱することにより酵素を失活させ反応を停止させた後、それぞれの液中のＤ－グルコース量を、常法のグルコースオキシダーゼ－パーオキシダーゼ法（ＧＯＤ法）で定量する。３０．５分の時点でのＤ－グルコース量から０．５分の時点のそれを減算することにより反応３０分間で生成したＤ－グルコース量を算出する。α－１，２グルコシダーゼの活性１単位（Ｕ）は、上記の条件下で１分間に１μモルのコージビオースを加水分解し、２μモルのＤ－グルコースを生成する酵素量と定義する。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼの具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するα－１，２グルコシダーゼが挙げられる。
（ａ）分子量
　ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、６８，０００±５，０００ダルトンを示す；
（ｂ）至適ｐＨ
　４０℃、３０分反応の条件下で、ｐＨ６．０乃至６．５；
（ｃ）至適温度
　ｐＨ６．５、３０分反応の条件下で３５乃至４５℃；
（ｄ）ｐＨ安定性
　４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０．５の範囲で安定；及び
（ｅ）温度安定性
　ｐＨ６．５、１時間保持の条件下、５５℃まで安定。
　また、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖のα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する酵素活性を保持する範囲で、配列番号８で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、通常、７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、またさらに望ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。なお、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列は、α－１，２グルコシダーゼの構造遺伝子にコードされるアミノ酸配列（配列表における配列番号７で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列）から翻訳開始コドンがコードするメチオニン残基１残基が除去されたものである。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼはその給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した微生物Ａ８Ｆ５株若しくはその変異株が好適に用いられる。ここでいう変異株としては、例えば、人為的に変異を導入することにより、親株としてのＡ８Ｆ５株よりも培養性状が改善された変異株、α－１，２グルコシダーゼの産生能が親株としてのＡ８Ｆ５株よりも向上した酵素高生産変異株、より活性の高いα－１，２グルコシダーゼを産生する変異株などが挙げられる。
　前述したとおり、α－１，２グルコシダーゼの産生能を有する微生物Ａ８Ｆ５株は、本発明者らが土壌から新たに単離した微生物であるが、後述する実験２に記載のとおり、１６Ｓ　ｒＲＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列に基づいて、公知菌のそれとの相同性を検討することにより菌種の同定を行ったところ、微生物Ａ８Ｆ５株は、細菌であり、アルスロバクター・フミコーラ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｕｍｉｃｏｌａ）と同定された。これらの結果に基づき、本発明者等は、微生物Ａ８Ｆ５株を新規微生物アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５と命名し、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、令和３年３月１６日付で受領番号　ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４４６として受領され、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４４６が付与されている。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼ産生能を有する微生物には、上記菌はもとより、その変異株、更には、本明細書において用いた、基質コージビオースに培養液を粗酵素液として作用させ、Ｄ－グルコースの生成を調べるスクリーニング方法により、自然界から単離、選抜される他の属、種に属するα－１，２グルコシダーゼ産生能を有する微生物、及び、それらの変異株なども包含される。
　本発明は、前述した本発明に係るα－１，２グルコシダーゼをコードする塩基配列、及び当該塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡに係るものでもある。本発明のＤＮＡは、本発明のα－１，２グルコシダーゼをコードする塩基配列を有するものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株を含むアルスロバクター属の微生物などが挙げられ、これらの培養物からゲノムＤＮＡを調製し、本発明に係るα－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡをクローニングすることができる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号８に示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含むＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
　本発明に係るＤＮＡの一例としては、配列表における配列番号７で示される塩基配列、又はそれらに相同的な塩基配列、さらには、それらの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。配列表における配列番号７で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有するＤＮＡとしては、コードするα－１，２グルコシダーゼの活性を保持する範囲で、配列表における配列番号７で示される塩基配列において１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列表における配列番号７で示される塩基配列に対し、通常、７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、またさらに望ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）を有する塩基配列を有するものが好適である。また、これらα－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡにおいて、遺伝子コードの縮重に基づき、それぞれがコードするα－１，２グルコシダーゼのアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したもの、それらに相補的な塩基配列を有するものも本発明のＤＮＡに包含される。
　本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、プラスミド、ファージ又はコスミド等を用いることができ、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択できる。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。宿主細胞の種類に応じて、確実に上記遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターとしては、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウィルスベクター、レトロウィルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター及びウィルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント及びウィルス（例えば、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、トリポックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス及びレトロウィルス））並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利用可能である。
　細菌における使用に好ましいベクターとしては、例えば、ｐＲＳＥＴ　Ａ、ｐＱＥ－７０、ｐＱＥ－６０、ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ６ａ、ｐＮＨ１８Ａ及びｐＮＨ４６Ａ；並びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０及びｐＲＩＴ５などが挙げられる。また、真核生物における使用に好ましいベクターとしては、ｐＰＩＣＺαＡ、ｐＷＬＮＥ０、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；並びにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬなどが挙げられる。
　本発明のＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、目的とするＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製することができる。
　このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、α－１，２グルコシダーゼを産生するものを選択すればよい。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼ産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、α－１，２グルコシダーゼを産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、澱粉やその部分分解物、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノールなどのアルコールも使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーンスティープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
　培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は本発明のα－１，２グルコシダーゼ産生能を有する微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
　このようにして微生物を培養した後、本発明の酵素を含む培養物を回収する。α－１，２グルコシダーゼ活性は、主に培養菌体に認められ、菌体破砕抽出液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を回収するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。菌体破砕抽出液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫酸アンモニウム（硫安）塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
　更に、α－１，２グルコシダーゼ活性を有する菌体破砕抽出液及びその濃縮液を用いて、α－１，２グルコシダーゼを公知の方法により固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
　上記のように本発明のα－１，２グルコシダーゼは菌体破砕抽出液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに分離、精製して利用することもできる。例えば、菌体破砕抽出液上清を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、『ＤＥＡＥ－トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）　６５０Ｓ』ゲル（東ソ－株式会社製）などを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、『フェニル－トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）　６５０Ｍ』ゲル（東ソ－株式会社製）などを用いた疎水クロマトグラフィー、『Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ』ゲル（ＧＥヘルスサイエンス社製）などを用いたゲルろ過クロマトグラフィーなどを用いて精製することにより、本発明のα－１，２グルコシダーゼを電気泳動的に単一なレベルにまで精製された精製酵素として得ることができる。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼは、糖質にα－１，２グルコシド結合を介して結合したグルコース残基を特異的に遊離させることから、構造未知の糖質に作用させ、Ｄ－グルコースが遊離するか否かを調べることにより、当該未知糖質がα－１，２グルコシル基を有する糖質か否かを明らかにすることができる。
　また、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、コージビオース、コージトリオースを効率よく分解できるものの、コージテトラオース、コージペンタオースの分解速度は比較的遅いことから、酵素作用量を調整しつつコージオリゴ糖に作用させてコージビオース、コージトリオースを分解し、得られる分解物からＤ－グルコースを除去することにより、コージトリオースよりも大きいコージオリゴ糖、すなわち、グルコース重合度４以上のコージオリゴ糖（コージテトラオース、コージペンタオース、コージヘキサオース、コージヘプタオース、コージオクタオースなど）を主成分とする、難消化性のコージオリゴ糖組成物を製造することができる。
　以下、実験により本発明を詳細に説明する。なお、以下の実験におけるα－１，２グルコシダーゼの活性は、基質コージビオースを加水分解しＤ－グルコースを生成する活性として、前述した活性測定法により求めた。
＜実験１：α－１，２グルコシダーゼ生産菌のスクリーニング＞
　土壌より単離した微生物菌株９２８株をそれぞれ、コージビオース（純度：９７．０質量％、（株）林原調製品）１５ｇ／Ｌ、酵母エキス（商品名『酵母エキス　ＳＨ』、日本製薬株式会社販売）１．０ｇ／Ｌ、ペプトン（商品名『ハイポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）５．０ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸一ナトリウム・７水和物０．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・５水和物０．０１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３．０ｇ／Ｌ、及び水からなる液体培地（ｐＨ６．８）（各試験管に３ｍＬずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌したもの）に植菌し、２７℃、２４０ｒｐｍで振トウしながら３日間培養した。得られた培養液３００μＬにそれぞれ６ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液１０μＬと３％界面活性剤（商品名『Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００』）溶液１０μＬを添加し２７℃で１時間振トウして溶菌させ、粗酵素液とした。次いで、得られた粗酵素液を、コージビオースを４％（ｗ／ｖ）、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、及び防腐剤を含有する基質溶液に等量混合し、４０℃で４８時間反応させ、得られた反応液を下記条件によるＴＬＣ分析に供し、コージビオースの加水分解の有無を調べた。
＜ＴＬＣ分析条件＞
　ＴＬＣプレート：シリカゲルアルミニウムプレート（商品名『シリカゲル
　　　　　　　　　６０Ｆ２５４』、１０×２０ｃｍ、メルク社製）
　展開溶媒：ｎ－ブタノール：ピリジン：水（容量比６：４：１）混液
　展開方法：上昇法、１回展開
　検出方法：硫酸－メタノール法
　基質コージビオースに作用させた場合に、ＴＬＣ分析においてＤ－グルコースが生成物として明確に認められる酵素を産生する微生物は試験した９２８株中７６株認められた。これら７６株の微生物由来の粗酵素液を、コージビオースに作用させたと同様にマルトース、イソマルトース、ニゲロースにそれぞれ作用させたところ、７６株中７４株は、コージビオースよりもマルトースやイソマルトースを優先的に分解する酵素を産生していることが判明した。残る２株は、マルトース、イソマルトース、ニゲロースをほとんど加水分解せず、コージビオースを特異的に加水分解する酵素を産生していることが判明した。当該２株はコロニー形態、培養性状がほぼ同じであり、同属の微生物と推定されたことから、より酵素産生能が高いＡ８Ｆ５株を選択した。Ａ８Ｆ５株の粗酵素液を再度調製し、コ－ジビオース、マルトース、イソマルトース、ニゲロース、トレハロース又はネオトレハロース（いずれも（株）林原調製品）にそれぞれ作用させ、各グルコ二糖への作用性を確認した。反応液のＴＬＣクロマトグラムを図１に示した。図１に見られるとおり、Ａ８Ｆ５株の粗酵素液は、コージビオースを完全に加水分解しＤ－グルコースを生成した（図１の符号「８」）ものの、他のグルコ二糖、すなわち、マルトース、イソマルトース、ニゲロース、トレハロース及びネオトレハロースにはほとんど作用しないことが判明した（図１において、符号「９」乃至「１３」で示すレーンがＡ８Ｆ５株の粗酵素液を、それぞれマルトース、イソマルトース、ニゲロース、トレハロース、及びネオトレハロースに作用させた反応液のクロマトグラムであり、符号「２」乃至「６」で示すレーンがマルトース、イソマルトース、ニゲロース、トレハロース、及びネオトレハロースの標準品のクロマトグラムである）。Ａ８Ｆ５株由来の酵素は、コージビオースを特異的に加水分解する新規なα－１，２グルコシダーゼであることが判明した。
＜実験２：α－１，２グルコシダーゼ生産菌Ａ８Ｆ５株の同定＞
　本実験では、土壌スクリーニングにおいて単離したα－１，２グルコシダーゼ生産菌Ａ８Ｆ５株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列を決定し、この塩基配列情報に基づき微生物Ａ８Ｆ５株の菌種同定を行った。
＜実験２－１：Ａ８Ｆ５株からの１６Ｓ　ｒＤＮＡの調製＞
　市販のデキストリン（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社販売）１．５ｇ／Ｌ、酵母エキス（商品名『酵母エキスＳＨ』、日本製薬株式会社販売）０．２ｇ／Ｌ、ポリペプトン（商品名『ハイポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）１．０ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸一ナトリウム・７水和物０．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・５水和物０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０．０ｇ／Ｌ及び水からなる培地（ｐＨ６．８）を、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した後、シャーレに分注し冷却して寒天平板培地を調製した。次いで、Ａ８Ｆ５株をこの平板培地に接種し、それぞれ２７℃で５日間静置培養し、単コロニー化した。
　上記で単コロニー化したＡ８Ｆ５株を釣菌し、市販のＤＮＡ簡易抽出試薬（商品名『ＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　ＤＮＡ』、タカラバイオ株式会社販売）５０μＬに懸濁し、９５℃で１０分間処理した後、１５，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離することによりゲノムＤＮＡを含む上清を回収した。回収したＡ８Ｆ５株のゲノムＤＮＡに対して、配列表における配列番号１で示される塩基配列を有するセンスプライマー８Ｆ、及び、配列表における配列番号２で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー１５１２Ｒを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物についてアガロース電気泳動を行ったところ、約１．５ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物が認められたため、エタノール沈殿により回収し、１６Ｓ　ｒＤＮＡとした。
＜実験２－２：１６Ｓ　ｒＤＮＡ塩基配列の決定＞
　実験２－１で得たＡ８Ｆ５株の１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列を常法により決定したところ、配列表における配列番号３で示される塩基配列（１，２６３ｂｐ）を有していることが判明した。
＜実験２－３：微生物Ａ８Ｆ５株の同定＞
　実験２－２で決定した１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列を、塩基配列の相同性検索プログラム『ＢＬＡＳＴＮ』により塩基配列データベースから相同性検索を行った。
　Ａ８Ｆ５株の１６Ｓ　ｒＤＮＡについて行った相同性検索において、高い相同性を示した上位５種の結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に見られるとおり、Ａ８Ｆ５株の１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列は、アルスロバクター・フミコーラ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｕｍｉｃｏｌａ）と１００％の相同性（同一性）を示した。一般的に、１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列での菌の分類は９９％以上の相同性があれば同種である可能性が高いと言われている。１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列に基づき、Ａ８Ｆ５株をアルスロバクター・フミコーラと同定し、アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株と命名した。
　アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、令和３年３月１６日付で受領番号　ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４４６として受領され、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４４６が付与されている。
＜実験３：アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株の培養によるα－１，２グルコシダーゼ粗酵素液の調製＞
　マルトース（商品名『サンマルト　Ｓ』、株式会社林原販売）４２ｇ／Ｌ、酵母エキス（商品名『酵母エキス　ミーストＳ』、アサヒグループ食品株式会社販売）０．９２ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー（商品名『ソルリス０９５Ｅ』、オリエンタル酵母工業株式会社販売）１．４４ｇ／Ｌ、クエン酸二アンモニウム１２ｇ／Ｌ、リン酸アンモニウム３．６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．６ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物０．０６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．６ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．００１２ｇ／Ｌ及び水からなる液体培地（ｐＨ６．５）を、５００ｍＬ容三角フラスコに５０ｍＬ入れたものを４３本調製し、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した後、予め種培養培地で培養したアルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株の種培養液１．０％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、２４０ｒｐｍで撹拌しながら２７℃で７２時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られた菌体約１２０ｇを回収した。次いで、得られた菌体を２１５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁後、リゾチームを終濃度０．０６％になるよう添加し、室温で４時間処理することにより溶菌させた。リゾチーム処理した菌体懸濁液を遠心分離（１８０００ｒｐｍ，１０分）し、上清を回収して粗酵素液とした。粗酵素液におけるα－１，２グルコシダーゼの全活性は、３７．８Ｕであった。
＜実験４：α－１，２グルコシダーゼの精製＞
　実験３で得た粗酵素液２００ｍＬに終濃度１．５Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加溶解し、一晩放置して塩析し、生じた沈澱を遠心分離にて回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、全活性２２．０Ｕの透析酵素液２８ｍＬを得た。透析酵素液を予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換体（商品名『ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｓ』、株式会社東ソー製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７ｍＬ）に供したところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は陰イオン交換体に吸着した。カラムを同緩衝液で洗浄した後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は食塩濃度約０．２Ｍで溶出した。溶出画分からα－１，２グルコシダーゼ活性画分を回収し、終濃度１．０Ｍになるよう硫安を溶解させ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１．０Ｍ硫安で予め平衡化した疎水クロマト担体（商品名『Ｐｈｅｎｙｌ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍ』、株式会社東ソー製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍＬ）に供したところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は疎水クロマト担体に吸着した。カラムを同緩衝液で洗浄した後、硫安濃度１．０Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は硫安濃度約０．３Ｍで溶出した。溶出画分からα－１，２グルコシダーゼ活性画分を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した陰イオン交換クロマト担体（商品名『Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｑ』、ＧＥヘルスケア社製）を用いた陰イオンカラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍＬ）に供したところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は陰イオン交換体に吸着した。カラムを同緩衝液で洗浄した後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は硫安濃度約０．２５Ｍで溶出した。溶出画分からα－１，２グルコシダーゼ活性画分を回収し、終濃度０．８Ｍになるよう硫安を溶解させ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．８Ｍ硫安で予め平衡化した疎水クロマト担体（商品名『Ｂｕｔｙｌ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍ』、株式会社東ソー製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍＬ）に供したところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は疎水クロマト担体に吸着した。カラムを同緩衝液で洗浄した後、硫安濃度０．８Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α－１，２グルコシダーゼ活性は硫安濃度約０．４Ｍで溶出した。溶出画分からα－１，２グルコシダーゼ活性画分を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したヒドロキシアパタイトを用いたヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍＬ）に供し、カラムを同緩衝液で洗浄したところ、α－１，２グルコシダーゼ活性はヒドロキシアパタイトに吸着することなく溶出した。溶出画分からα－１，２グルコシダーゼ活性画分を回収し、２ｍＬまで膜濃縮した後、食塩濃度０．４Ｍの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したゲルろ過担体（商品名『Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ』、ＧＬヘルスケアライフサイエンス社製）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１２０ｍＬ）に供し、同緩衝液で溶出し、溶出画分からα－１，２グルコシダーゼ活性画分を回収した。
　なお、本精製においては、精製工程の中盤から酵素蛋白が微量となったことから、精製の各工程におけるα－１，２グルコシダーゼ活性は、定性的に確認するにとどめ、定量的な活性測定及び蛋白定量は省略した。精製の最終工程であるゲルろ過カラムクロマトグラフィーで得られたα－１，２グルコシダーゼ精製標品の純度を５乃至２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ゲルを用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により検定したところ、精製標品はほぼ単一な蛋白バンドを示す純度の高いものであることが分った。
＜実験５：α－１，２グルコシダーゼの分子量とＮ末端アミノ酸配列＞
　実験４で得たα－１，２グルコシダーゼ精製標品について、分子量とＮ末端アミノ酸配列を分析した。
＜実験５－１：分子量＞
　実験４の方法で得たα－１，２グルコシダーゼ精製標品をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、５乃至２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（バイオ・ラッド・ラボラトリー社製）の移動度と比較することにより分子量を測定したところ、当該α－１，２グルコシダーゼの分子量は６８，０００±５，０００ダルトンであることが判明した。
＜実験５－２：Ｎ末端アミノ酸配列＞
　実験４の方法で得たα－１，２グルコシダーゼ精製標品を常法のエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列分析に供したところ、Ｎ末端から７残基までのアミノ酸配列として、配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列、すなわち、Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓが判明した。
　実験４の精製においては、Ｎ末端アミノ酸配列を分析するに足る精製酵素標品が得られたものの、酵素学的な諸性質の解析に十分な量の精製酵素標品が得られなかったことから、本発明のα－１，２グルコシダーゼの酵素的性質、基質特異性などの調査は、アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株から当該酵素遺伝子をクローニングし、組換え体で発現させた組換え型酵素を用いて行うこととした。
＜実験６：α－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
　本発明のα－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡをアルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、α－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び、形質転換体の調製を行った。
＜実験６－１：α－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定＞
　実験３で用いた液体培地で７２時間培養して得たアルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株の菌体をリゾチームで溶菌させた後、ＤＮＡ抽出キット（商品名『ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　ＨＭＷ　ＤＮＡ』(タカラバイオ株式会社販売)を用いて処理しゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡをアガロース（０．７％）電気泳動に供し、ｒＲＮＡのバンドを確認することで精製度を確認した。ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサー（商品名『ＭｉｎＩＯＮ』，オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ社製）を用いて全ゲノム配列を解析した。得られた全ゲノム配列について、実験５－２で明らかにしたＮ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する配列候補を推定した。開始コドン、終止コドンとそれぞれ推定される塩基配列の外側に配列表における配列番号５及び配列番号６で示される塩基配列を有するプライマーを設計し、目的の領域を増幅した後、α－１，２グルコシダーゼ推定遺伝子の塩基配列をＤＮＡシーケンサーで決定した。
　解読した１，９５９ｂｐの塩基配列には、メチオニンで始まり、実験５－２で明らかにしたα－１，２グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームが認められ、本ＤＮＡ中に目的とするα－１，２グルコシダーゼ遺伝子の全長が存在していることが判明した。この結果から、得られたＤＮＡは目的とするα－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡと推察された。この知見に基づきα－１，２グルコシダーゼ遺伝子の塩基配列及びこれにコードされるα－１，２グルコシダーゼのアミノ酸配列を決定した。その結果、アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株由来α－１，２グルコシダーゼの構造遺伝子は、配列表における配列番号７で示される鎖長１，９５６ｂｐの塩基配列を有しており、当該塩基配列に併記した６５２残基からなるアミノ酸配列をコードしていることが判明した。
　上記で明らかにした配列表における配列番号７で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列と、配列表における配列番号４で示されるα－１，２グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列から、α－１，２グルコシダーゼは、配列表における配列番号８で示される６５１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有していることが判明した。なお、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列からアルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株由来α－１，２グルコシダーゼの分子量は６８，６５０ダルトンと算出された。この値は実験５－１においてＳＤＳ－ＰＡＧＥで求めた分子量６８，０００±５，０００ダルトンとよく一致していた。
＜実験６－２：組換え型α－１，２グルコシダーゼ発現用ベクターの構築と形質転換体の調製＞
　アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株から調製したＤＮＡを鋳型にし、α－１，２グルコシダーゼの遺伝子配列を増幅した。また、発現用プラスミドベクター『ｐＲＳＥＴ　Ａ』を鋳型にしてＰＣＲを行い、目的遺伝子配列を増幅した。次いで、Ｉｎ　Ｆｕｓｉｏｎ反応、大腸菌ＸＬ１０　Ｇｏｌｄへの形質転換、コロニーＰＣＲ、プラスミド抽出を行った。取得したプラスミドを制限酵素で線状化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、各プラスミドのサイズが正しいことを確認した。取得した発現用組換えＤＮＡ『ｐＲＳＥＴＡ／α１，２ＧＤＨｉｓ』を図２に示す。なお、図２に見られるとおり、当該発現用組換えＤＮＡにおいて、α－１，２グルコシダーゼの遺伝子はＴ７プロモーターを利用して発現され、組換え型α－１，２グルコシダーゼはそのＣ末端にヒスチジン残基６残基からなるＨｉｓタグを有する形態で産生されるよう設計されている。次いで、『ｐＲＳＥＴＡ／α１，２ＧＤＨｉｓ』を、宿主としてコンピテントセル化した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳに導入して形質転換し、形質転換体『ＲＳＥＴＡ／α１，２ＧＤＨｉｓ』を得た。
＜実験６－３：形質転換体における組換え型α－１，２グルコシダーゼの発現＞
　アンピシリン１００ｍｇ／ｍＬ，クロラムフェニコール１０ｍｇ／ｍＬを含有するＴＢ培地（インビトロジェン株式会社販売）を５００ｍＬ容三角フラスコに５０ｍＬずつ入れたものを１６本調製し、これに実験６－２で得た形質転換体『ＲＳＥＴＡ／α１，２ＧＤＨｉｓ』を植菌し、２７℃で１６時間、２４０ｒｐｍで振盪培養した。得られた培養液を１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することにより菌体を回収し、生理食塩水にて洗浄した。洗浄した菌体を、プロテアーゼ阻害剤を含有する水１０ｍＬに懸濁し、超音波破砕機（商品名『ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ　ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ　Ｑ７００』、ＱＳＯＮＩＣＡ社製）にて破砕した後、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して上清を回収した。得られた菌体破砕抽出液上清約１０ｍＬに、１０ｍＬの０．５Ｍ食塩、４０ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え粗酵素液とした。得られた粗酵素液における全α－１，２グルコシダーゼ活性は７２４単位であった。
＜実験６－４：組換え型α－１，２グルコシダーゼの精製＞
　実験６－３で得た粗酵素液２０ｍＬを、『Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ』（ＧＬヘルスケアライフサイエンス社製）を充填したカラム（直径０．５×１５ｃｍ、容量：３ｍＬ）にチャージし、Ｈｉｓタグ付きの組換え型α－１，２グルコシダーゼをカラムに吸着させた。次いで、溶離液Ａ（０．５Ｍ食塩、４０ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を５ベッド通液することにより洗浄し、さらに、溶離液Ａと溶離液Ｂ（１５０ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を９５：５の割合で混合した液を５ベッド通液することによりさらに洗浄した。次いで、溶離液Ｂを５ベッド通液することにより、カラムに吸着したＨｉｓタグ付きの組換え型α－１，２グルコシダーゼを溶出させた。α－１，２グルコシダーゼ活性画分を、限外ろ過膜（商品名『アミコンウルトラ０．５　５０Ｋ』、メルクミリポア株式会社販売）を用いて緩衝液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に交換したものを精製酵素標品とした。組換え型α－１，２グルコシダーゼの精製を表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すとおり、組換え型α－１，２グルコシダーゼ精製標品の比活性は５９．２単位／ｍｇ－蛋白、粗酵素液からの収率は３１．１％、精製倍率は３１．２倍であった。なお、本精製酵素標品をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、ほぼ単一な組換え型α－１，２グルコシダーゼ蛋白バンドが認められた。
＜実験７：α－１，２グルコシダーゼの性質＞
　実験６－４の方法で得た組換え型α－１，２グルコシダーゼ精製標品を用いてα－１，２グルコシダーゼの酵素学的性質を調べた。
＜実験７－１：至適ｐＨ及び至適温度＞
　組換え型α－１，２グルコシダーゼの精製標品を用い、α－１，２グルコシダーゼ活性に及ぼすｐＨ及び温度の影響を活性測定法に準じてそれぞれ調べた。これらの結果を図３（至適ｐＨ）及び図４（至適温度）に示す。本発明のα－１，２グルコシダーゼの至適ｐＨは、４０℃、３０分反応の条件下でｐＨ６．０乃至６．５であった。また、至適温度はｐＨ６．５、３０分反応の条件下で３５乃至４５℃であることが判明した。
＜実験７－２：ｐＨ安定性及び温度安定性＞
　組換え型α－１，２グルコシダーゼの精製標品を用い、α－１，２グルコシダーゼ活性のｐＨ安定性及び温度安定性を調べた。ｐＨ安定性は、酵素を各ｐＨの９０ｍＭブリトン－ロビンソン緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．５に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。温度安定性は、０．１％牛血清アルブミンを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、酵素溶液を各温度に１時間保持し、氷冷した後、残存するＤ－グルコース生成活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（ｐＨ安定性）及び図６（温度安定性）に示す。図５から明らかなように、本発明のα－１，２グルコシダーゼの活性はｐＨ４．５乃至１０．５の範囲で安定であることが判明した。また、図６から明らかなように、本発明のα－１，２グルコシダーゼの活性は５５℃まで安定であることが判明した。
＜実験７－３：α－１，２グルコシダーゼの基質特異性＞
　実験６－４の方法で得た組換え型α－１，２グルコシダーゼの精製標品を各種糖質に作用させ、本発明のα－１，２グルコシダーゼの基質特異性を調べた。
　下記の表３に示す２７種の糖質を用いてα－１，２グルコシダーゼの基質特異性を調べた。各糖質を基質として終濃度１％となるように２０ｍＭブリトン－ロビンソン緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、α－１，２グルコシダーゼを基質固形物１グラム当たり１Ｕ又は１０Ｕの２とおりの酵素作用量で、３０℃で２４時間反応させた。反応後、それぞれの基質から生成した反応物を実験１で用いたと同じＴＬＣ分析に供し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無及び生成する糖質を確認した。ＴＬＣにおいて、用いた基質以外に加水分解産物としてのＤ－グルコースのスポットが認められるものを「作用する」（＋）、反応生成物が認められないものを「作用しない」（－）と判定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から明らかなように、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、コージビオースのα－１，２結合を加水分解してＤ－グルコースを生成するのみならず、コージトリオース、コージテトラオース及びコージペンタオースのα－１，２結合を加水分解し、それぞれからＤ－グルコースを生成した。しかしながら、コージペンタオースへの作用は弱く、Ｄ－グルコースの生成速度は遅かった。また、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、ニゲロース（３－Ｏ－α－グルコシルグルコース）にごく僅かに作用し、Ｄ－グルコースを生成することが判明した。その一方で、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、マルトースを含む一連のマルトオリゴ糖、イソマルトースを含む一連のイソマルトオリゴ糖、トレハロース、スクロース、ラクトース、セロビオース、ラミナリビオース、ゲンチビオース、澱粉、デキストラン、プルランなどの、α－１，２グルコシド結合を有さない糖質には全く作用しないことが判明した。
　上記の基質特異性から、本発明のα－１，２グルコシダーゼは、コージビオース、コージトリオース、コージテトラオース、コージペンタオースのα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する活性を有する酵素、すなわち、グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖を特異的に加水分解する作用を有する酵素であることが判明した。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
＜α－１，２グルコシダーゼの調製＞
　実験３で用いた液体培地を３０Ｌ－容ジャーファーメンターに約２０Ｌ入れ、１２０℃、２０分間滅菌した後、アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら２７℃で７２時間培養した。培養液約２０Ｌを遠心分離して菌体を回収し、約２Ｌの緩衝液に懸濁し、常法により菌体破砕処理し遠心分離することにより、α－１，２グルコシダーゼ活性０．２７Ｕ／ｍＬの菌体破砕上清を粗酵素液として得た。この粗酵素液を常法に従い限外ろ過膜で約３０倍に濃縮し、総活性約５２０Ｕの濃縮酵素剤を得た。本品は、α－１，２グルコシダーゼ剤として利用することができる。
＜組換え型α－１，２グルコシダーゼの調製＞
　ＴＢ培地（インビトロジェン株式会社販売）を５Ｌ－容ジャーファーメンターに約３Ｌ入れ、１２０℃、２０分間滅菌した後、別途、ろ過滅菌したアンピシリン１００ｍｇ／ｍＬ，クロラムフェニコール１０ｍｇ／ｍＬを無菌的に添加して実験６－３で用いたＴＢ培地を調製した。実験６－２で得た形質転換体『ＲＳＥＴＡ／α１，２ＧＤＨｉｓ』の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら２７℃で１６時間培養した。培養液約３Ｌを遠心分離して菌体を回収し、約３００ｍＬの緩衝液に懸濁し、常法により菌体破砕処理し遠心分離することにより、α－１，２グルコシダーゼ活性４５Ｕ／ｍＬの菌体破砕上清を粗酵素液として得た。この粗酵素液を常法に従い限外ろ過膜で約１０倍に濃縮し、総活性約１３，２００Ｕの濃縮酵素剤を得た。本品は、組換え型α－１，２グルコシダーゼ剤として利用することができる。
＜α－１，２グルコシダーゼの難消化性コージオリゴ糖製造への応用＞
　β－グルコース１リン酸（β－Ｇ１Ｐ）を２００ｍＭ、Ｄ－グルコースを５０ｍＭの各濃度で含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）５００ｍＬに対し、８単位／ｇ－β－Ｇ１Ｐのアノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）由来のコージビオースホスホリラーゼ（ＫＰａｓｅ）を添加し、撹拌しつつ６０℃で７２時間反応させ、１００℃で１０分間加熱処理することにより酵素反応を停止させた。この反応液をＨＰＬＣ分析に供し、糖組成を調べたところ、Ｄ－グルコース２．３質量％、コージビオース７．２質量％、コージトリオース２１．７質量％、コージテトラオース１３．６質量％、コージペンタオース１８．７質量％、コージヘキサオース１９．６質量％、コージヘプタオース１３．２質量％、コージオクタオース３．３質量％、コージノナオース０．３質量％であった。
　上記で得たコージオリゴ糖組成物に実施例１の方法で得たα－１，２グルコシダーゼ剤を１．０Ｕ／ｇ－糖質添加し、４０℃で２４時間作用させたところ、糖組成は、Ｄ－グルコース３４．３質量％、コージビオース０．８質量％、コージトリオース１．７質量％、コージテトラオース７．６質量％、コージペンタオース１８．５質量％、コージヘキサオース１９．１質量％、コージヘプタオース１２．５質量％、コージオクタオース３．２質量％、コージノナオース０．３質量％、その他２．１質量％となった。得られた糖組成物を常法のクロマト分離に供し、単糖、二糖画分を除去し、精製することにより、コージトリオース２．７質量％、コージテトラオース１２．１質量％、コージペンタオース２９．４質量％、コージヘキサオース３０．４質量％、コージヘプタオース１９．９質量％、コージオクタオース５．１質量％、コージノナオース０．４質量％を含有するコージオリゴ糖シラップを得た。
　本品は、ヒトの体内で消化されるコージビオースよりも大きいコージオリゴ糖、すなわち、グルコース重合度３以上のコージオリゴ糖からなる難消化性シラップであった。本品は、難消化性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
　本発明のα－１，２グルコシダーゼは従来未知の新規な酵素である。本発明のα－１，２グルコシダーゼとその製造方法の確立は、学術的価値だけでなく、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における意義が極めて大きい。
図１において、
Ｍ：マルトオリゴ糖マーカー
Ｇ１：Ｄ－グルコース
Ｇ２：マルトース
Ｇ３：マルトトリオース
Ｇ４：マルトテトラオース
１：コージビオース標準品
２：マルトース標準品
３：イソマルトース標準品
４：ニゲロース標準品
５：トレハロース標準品
６：ネオトレハロース標準品
７：Ａ８Ｆ５株の粗酵素（菌体破砕抽出物）のみ
８：Ａ８Ｆ５株の粗酵素をコージビオースに作用させた反応液
９：Ａ８Ｆ５株の粗酵素をマルトースに作用させた反応液
１０：Ａ８Ｆ５株の粗酵素をイソマルトースに作用させた反応液
１１：Ａ８Ｆ５株の粗酵素をニゲロースに作用させた反応液
１２：Ａ８Ｆ５株の粗酵素をトレハロースに作用させた反応液
１３：Ａ８Ｆ５株の粗酵素をネオトレハロースに作用させた反応液
図２において、
ＰＴ７：Ｔ７プロモーター
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
α１，２－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ：α－１，２グルコシダーゼ構造遺伝子
Ｈｉｓ－ｔａｇ：ヒスチジン（６残基）－タグ
ｆ１　ｏｒｉ：ｆ１ファージ複製起点
Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ：アンピシリン耐性遺伝子
ｐＵＣ　ｏｒｉ：ｐＵＣの複製起点

Claims (17)

  1. 　グルコース重合度２乃至５のα－１，２グルコオリゴ糖におけるα－１，２グルコシド結合を特異的に加水分解し、Ｄ－グルコースを生成する活性を有するα－１，２グルコシダーゼ。
  2. 　下記（ａ）乃至（ｅ）の理化学的性質を有する請求項１記載のα－１，２グルコシダーゼ：
    （ａ）分子量
    　ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、６８，０００±５，０００ダルトンを示す；
    （ｂ）至適ｐＨ
    　４０℃、３０分反応の条件下で、ｐＨ６．０乃至６．５；
    （ｃ）至適温度
    　ｐＨ６．５、３０分反応の条件下で３５乃至４５℃；
    （ｄ）ｐＨ安定性
    　４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０．５の範囲で安定；及び
    （ｅ）温度安定性
    　ｐＨ６．５、１時間保持の条件下、５５℃まで安定。
  3. 　配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列か、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列において、α－１，２グルコシダーゼ活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項１又は２記載のα－１，２グルコシダーゼ。
  4. 　アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物由来である請求項１乃至３のいずれかに記載のα－１，２グルコシダーゼ。
  5. 　アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物が、アルスロバクター・フミコーラ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｕｍｉｃｏｌａ）である請求項４記載のα－１，２グルコシダーゼ。
  6. 　アルスロバクター・フミコーラが、アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株（独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４４６）又はその変異株である請求項５記載のα－１，２グルコシダーゼ。
  7. 　請求項１乃至３のいずれかに記載のα－１，２グルコシダーゼ産生能を有するアルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株（独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４４６）又はその変異株。
  8. 　請求項３記載のα－１，２グルコシダーゼをコードするＤＮＡ。
  9. 　配列表における配列番号７で示される塩基配列か、又は配列表における配列番号７で示される塩基配列において、コードするα－１，２グルコシダーゼ活性を保持する範囲で１個又は２個以上の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項８記載のＤＮＡ。
  10. 　遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号７で示される塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項８記載のＤＮＡ。
  11. 　請求項８乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡ。
  12. 　請求項１１記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主細胞に導入してなる形質転換体。
  13. 　請求項１乃至３のいずれかに記載のα－１，２グルコシダーゼ産生能を有する微生物を栄養培地で培養して請求項１乃至３のいずれかに記載のα－１，２グルコシダーゼを生成せしめ、これを採取することを特徴とするα－１，２グルコシダーゼの製造方法。
  14. 　前記微生物が、アルスロバクター属微生物である請求項１３記載のα－１，２グルコシダーゼの製造方法。
  15. 　アルスロバクター属微生物が、アルスロバクター・フミコーラである請求項１４記載のα－１，２グルコシダーゼの製造方法。
  16. 　アルスロバクター・フミコーラが、アルスロバクター・フミコーラ　Ａ８Ｆ５株（独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４４６）又はその変異株である請求項１５記載のα－１，２グルコシダーゼの製造方法。
  17. 　請求項１２記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項１乃至３のいずれかに記載のα－１，２グルコシダーゼを採取することを特徴とする組換え型α－１，２グルコシダーゼの製造方法。

     
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