KR20080072496A - 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈 및 이를 이용한고순도 말토올리고당의 제조방법 - Google Patents

노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈 및 이를 이용한고순도 말토올리고당의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 노스탁속 균주 PCC73102(Nostoc sp PCC73102) 유래 아밀로플루란네이즈(amylopullulanase) 및 이를 이용하여 녹말로부터 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 노스탁속 균주 PCC73102(Nostoc sp PCC73102)에서 분리된 신규 아밀로플루란네이즈(amylopullulanase)를 이용하여 녹말을 포함하는 기질로부터 글루코오스 분자수 7 내지 11개인 고순도의 말토올리고당을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
노스탁, 아밀로플루란네이즈, 녹말, 말토옥타오스

Description

노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈 및 이를 이용한 고순도 말토올리고당의 제조방법{NOSTOC SP-DERIVED AMYLOPULLULANASE AND PREPARATION METHOD OF MALTOOLIGOSACCHARIDE WITH THE SAME}
본원 발명은 노스탁속 균주 PCC73102(Nostoc sp PCC73102) 유래 아밀로플루란네이즈(amylopullulanase) 및 이를 이용하여 녹말로부터 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
녹말로부터 말토헥사오스(G6, maltohexaose) 이상의 긴 길이를 가지는 말토올리고당을 생산하는 방법으로는 산 가수분해 방법과 효소를 이용한 방법이 주로 이용되고 있다.
효소를 이용한 방법으로는 미생물에서 유래한 알파-아밀레이즈를 녹말에 작용시켜 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 제조하는 방법이 있다(미국 특허 제 5739024호; E. Ben Messaoud et al. Enzyme Microb. Technol. 34:662-666. 2004). 그러나 상기 제조방법의 경우 말토헥사오스와 말토헵타오스가 주산물을 이루며, 글루코오스, 말토오스, 말토트라이오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스 등 사슬의 길이가 짧은 말토올리고당이 다량으로 생성되어 이를 제거하기 위한 분리 및 정제 공정이 요구됨으로써 생산경비가 과다하게 소요되는 문제점이 있다.
또한, 효소를 이용한 말토옥타오스 제조방법으로 감마-사이클로덱스트린에 사이클로말토덱스트리네이즈(Cyclomaltodextrinase, CDase)를 작용시켜 효소적으로 합성하는 방법이 보고 되어 있다(Uchida et al. Carbohydr. Res. 287:271-274. 1996). 그러나 반응과정에서 말토오스, 말토트라이오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스가 다량으로 생성되기 때문에, 상기 방법의 경우에도 생산 수율이 저조하고 또한 부산물을 제거하는 정제과정이 요구되는 문제점이 있으며, 제조 원료로 사용되는 감마-사이클로덱스트린의 가격이 매우 높기 때문에 산업적 생산시 생산 경비의 증가가 불가피 하다.
본원발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 노스탁속 균주에서 유래한 아밀로플루란네이즈를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본원 발명은 상기 아밀로플루란네이즈를 생산하는 생산방법 및 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본원 발명은 녹말을 포함하는 기질에 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈(amylopullulanase)를 반응시켜 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원 발명자는 노스탁속 균주 PCC73102(Nostoc sp. PCC73102)에서 유래한 아밀로플루란네이즈(amylopullulanase)의 알파-1,4 글루코시드 결합의 가수분해 속도가 사슬길이에 대해 선택적이어서, 녹말을 기질로 하여 가수분해반응을 진행시키는 경우 글로코오스 분자수 7 내지 9인 말토헵타오스(maltoheptaose, G7), 말토옥타오스(maltooctaose, G8) 및 말토노나오스(maltononaose, G9)를 주요 산물로 하는 말토올리고당(maltooligosaccharide) 혼합물, 특히 말토옥타오스를 주요 산물로 하는 말토올리고당 혼합물을 제조할 수 있으므로, 상기 효소와 기질간의 반응 시간, 반응 조건 및 기질 대비 효소양을 조절함으로써 녹말로부터 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 용이하게 고순도로 제조할 수 있다는 것을 발견하여 본원 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본원발명은 노스탁속 균주(Nostoc sp.)에서 유래한 아밀로플루란네이즈를 제공한다.
본원 발명은 또한, 상기 아밀로플루란네이즈 생산하는 생산방법 및 이를 생산하는 형질전환체를 제공한다.
본원 발명은 또한, 녹말을 포함하는 기질에 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈(amylopullulanase)를 반응시켜 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본원 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본원 발명에서 제공하는 아밀로플루란네이즈는 노스탁속 균주(Nostoc sp.), 바람직하게는 노스탁속 균주 PCC73102(Nostoc sp PCC73102)에서 유래한 것이다. 상기 아밀로플루란네이즈는 25℃에서 최적 활성을 나타내고, 10℃ 내지 40℃에서 최적 활성의 60 % 이상의 활성을 나타내는 효소이다. 또한, 상기 아밀로플루란네이즈는 pH 7.5에서 최적 활성을 나타내고, pH 7.0 내지 pH 8.0에서 최적 활성의 50% 이상의 활성을 나타내는 효소이다. 바람직하게는 상기 아밀로플루란네이즈는 20℃ 내지 30℃ 및 pH 7.0 내지 pH 7.5에서 높은 활성을 나타내는 효소이다.
본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 분자량이 55.2 kDa 내지 55.8 kDa이고, 바람직하게는 약 55.5 kDa이며, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 알파-1,4-글루코시드 결합 및 알파-1,6-글루코시드 결합 가수분해 활성을 가지며, 상세하게는 플루란(pullulan)을 최적 기 질로 하고, 플루란의 알파-1,6-글루코시드 결합을 분해하여 말토트라이오스를 생성하며, 말토올리고당의 알파-1,4-글루코시드 결합에 대해서 가수분해능을 가진다. 또한, 본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 전분을 포함한 녹말이 가지는 알파-1,6 글루코시드 결합을 분해하여 말토올리고당을 생성할 수 있으며, 상기 녹말 또는 전처리된 녹말을 분해하여 말토올리고당을 생성할 수 있고, 말토올리고당을 가수분해할 수 있으나, 사이틀로덱스트린(cyclodextrin)을 가수분해할 수 없다.
본 발명에서 말토올리고당은 글루코오스 분자수 3개 이상이 알파-1,4 결합으로 결합된 당을 의미하며, 구체적으로 글루코오스 분자수 3개 내지 50개인 말토올리고당, 바람직하게는 글루코오스 분자수 3개 내지 30개인 말토올리고당, 더욱 바람직하게는 글루코오스 분자수 3개 내지 20개인 말토올리고당일 수 있으며, 일 예로, 말토테트라오스(G4), 말토펜타오스(G5), 말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7), 말토옥타오스(G8), 말토노나오스(G9), 말토데카오스(G10), 말토언데카오스(G11) 또는 말도토데카오스(G12)일 수 있고, 가장 바람직하게는 말토옥타오스일 수 있다.
특히, 본원 발명의 아밀로플루란네이즈의 알파-1,4 글루코시드 결합에 대한 가수분해능 및 가수분해속도는 사슬길이 즉, 글루코오스 분자수에 대해 선택적인 특징이 있다.
구체적으로, 말토올리고당을 기질로 하는 경우, 말토트라이오스 이하의 기질은 가수분해를 하지 못하나, 글루코오스 4개 이상의 말토올리고당이 가지는 알파-1,4-글루코시드 결합에 대해서 가수분해능을 가진다.
또한, 상기 아밀로플루란네이즈는 글루코오스 분자수에 대한 선택적 가수분 해능에 대한 특징이 있다. 구체적으로, 상기 아밀로플루란네이즈는 25 ℃ 및 pH 7의 조건에서 반응시켜, 글로코오스의 양을 정량하여 측정한 결과, 말토옥타오스의 Km/Kcat 값이 말토헵타오스의 Km/Kcat 값에 비하여 2.5 배 내지 3.5 배, 바람직하게는 3 배이고, 말토노나오스의 Km/Kcat 값이 말토옥타오스의 Km/Kcat 값의 55 배 내지 65 배, 바람직하게는 59 배 내지 63 배, 더욱 바람직하게는 60 배 내지 62배, 가장 바람직하게는 61 배 높은 특징이 있다. 상기한 특징에 의하여, 상기 효소를 이용하여 녹말을 가수분해하여 말토올리고당 혼합물을 제조하는 경우, 상기 말토올리고당 혼합물의 주성분은 글로코오스 분자수 7 내지 11의 말토올리고당, 바람직하게는 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스, 가장 바람직하게는 말토옥타오스일 수 있다.
또한, 상기한 특징에 의해 녹말을 기질로 하여 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 반응시키는 경우 효소양, 반응 시간 및 반응 조건을 조절함으로써 녹말로부터 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당, 바람직하게는 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고, 말토헵타오스, 말토노나오스 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하는 말토올리고당, 보다 바람직하게는 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고 글루코오스 분자수 7, 및 글루코오스 분자수 9 내지 11개의 말토올리고당으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 더욱 포함하는 말토올리고당, 가장 바람직하게는 말토옥타오스를 용이하게 고순도로 수득할 수 있다.
본원 발명의 아밀로플루란네이즈의 유전자는 서열번호 4의 단백질을 암호하 는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 상기 서열번호 4의 단백질을 암호하는 핵산 서열의 예로는 서열번호 3으로 기재한 핵산 서열이 있다. 상기 서열번호 3의 유전자 서열은 도 2에 나타내었다.
본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 노스탁속 균주로부터 분리하거나 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있다. 상기 유전공학적인 방법은 통상의 공지된 방법일 수 있고, 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포를 이용하여 단백질을 생산하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 제조하는 방법은 미생물 발현 생산시스템을 통하여 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예로, 아밀로플루란네이즈의 생산방법은 (a) 노스탁속 균주에서 분리된 아밀로플루란네이즈를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 아밀로플루란네이즈를 생산하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (a) 단계에서, 상기 재조합 벡터는 상기 아밀로플루란네이즈를 코딩하는 유전자가 발현가능하도록 공지의 벡터에 삽입된 재조합 벡터일 수 있다. 상기 공지의 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적절하게 선택하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 미생물, 더욱 바람직하게는 효모, 대장균 또는 곰팡이에서 이종 단백질을 발현하기 위해 제안된 모든 종류의 벡터일 수 있다. 또한 상기 벡터는 통상의 선별마커, 리포터 유전자 또는 재조합 단백질의 분리를 용이하게 하기 위한 수단을 더욱 포함할 수 있다. 상기 선별마커는 항생제 내성 유전자 또는 옥소트로피에 관련된 유전자일 수 있다.
상기 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다. 일 예로, T7 프로모터, T7 전사종결인자 및 선별마커로 가나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자를 가지는 pET-29b(+)벡터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터는 바람직하게는 서열번호 4의 아밀로플루란네이즈를 코딩하는 DNA와 pET-29b(+)를 결합하여 제조한 pETNPul6xH일 수 있다. 상기 재조합 벡터 pETNPul6xH의 개열지도는 도 5에 나타내었다.
상기 (b) 단계는 형질전환체를 제조하는 단계로, 상기 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 바람직하게는 대장균, 유산균, 효모 또는 곰팡이일 수 있다. 형질전환체를 제조하는 방법은 통상의 방법일 수 있으며, 바람직하게는 CaCl2 및 열충격(heat-shock)을 이용하여 형질전환체를 제조하는 방법일 수 있다.
상기 (c) 단계는 형질전환체를 배양하여 아밀로플루란네이즈를 생산하는 단계로 형질전환체를 배양하는 배지는 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 적합한 조건을 선택할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 형질전체인 Escherichia coli(E. coli) BL21(DE3)/pETNPul6xH는 2007년 1월 2일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였으며, 2007년 1월 2일자에 기탁번호 KCTC 11059BP를 부여받았다.
구체적으로, 상기 형질전환체인 Escherichia coli BL21(DE3)/pETNPul6xH(KCTC 11059BP)는 노스탁속 균주(Nostoc sp.)에서 유래되고, 25 ℃ 및 pH 7의 조건에서 반응시켜, 글로코오스의 양을 정량하여 측정한 말토옥타오스의 Km/Kcat 값이 말토헵타오스의 Km/Kcat 값에 비하여 2.5 배 내지 3.5 배이고, 말토노나오스의 Km/Kcat 값이 말토옥타오스의 Km/Kcat 값의 55 배 내지 65배인 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 아밀로플루란네이즈를 생산할 수 있는 것이다.
상기 형질전화체인 E. coli BL21(DE3)/pETNPul6xH(KCTC 11059BP)를 배양하여 아밀로플루란네이즈를 생산하는 단계는 상기 형질전환체를 단백질 생산을 위한 재조합 단백질이 형질전환된 형질전환체를 이용하여 단백질을 생산하는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 상세하게는 상기 형질전환체를 카나마이신이 첨가된 LB배지에서 30℃ 내지 37℃의 조건으로 600nm에서 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양한 후, 배지의 온도를 15℃ 내지 30℃로, 바람직하게는 20℃ 내지 25℃로 낮추고, IPTG를 최종농도 0.1 내지 10 mM로 첨가하여 15℃ 내지 30℃, 바람직하게는 20℃ 내지 25℃에서 4 내지 10시간 배양하고, 상기 배양된 세포내 발현된 아밀로플루란네이즈를 분리 또는 정제, 상세하게는 균체수득, 균체 파쇄 또는 용혈(lysis), 상청액 분리 및 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다.
일 예로, 상기 형질전환체의 배양은 카나마이신이 첨가된 LB배지에서 30 내 지 37℃에서 배양하여 600nm에서 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양한 후, 배지의 온도를 15 내지 25℃로 낮추고, IPTG를 최종농도 0.1 내지 10 mM로 첨가하여 15 내지 25℃에서 4 내지 10시간 배양하는 방법으로 수행할 수 있다.
또한, 상기 아밀로플루란네이즈를 생산하는 단계는 상기 형질전환체를 배양한 후에, 상기 형질전환체를 배양한 배양액으로부터 아밀로플루란네이즈를 분리 또는 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 배양액에 존재하는 상기 형질전환체를 파쇄하는 단계, 상기 형질전환체를 파쇄한 배양액을 원심분리한 후에 상등액을 취하는 단계, 상기 상등액을 열처리하는 단계 및 상기 열처리한 상등액에 대해 니켈 친화성 크로마토그래피를 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 상세하게는 또는 니켈 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA 친화성 크로마토그래피), DEAE-toyopearl 크로마토그래피 또는 GPC(gel permeation chromatography)순으로 실시하는 이온교환 크로마토그래피일 수 있으며, 바람직하게는 니켈 친화성 크로마토그래피일 수 있다.
또한, 본원 발명은 녹말을 포함하는 기질에 노스탁속 균주에서 유래하는 아밀로플루란네이즈를 반응시켜 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 제조하는 방법을 제공한다.
보다 상세하게는, 상기 제조방법은 녹말을 포함하는 기질에 노스탁속 균주에서 유래되고, 알파-1,4-글루코시드 결합 및 알파-1,6-글루코시드 결합 가수분해 활성을 가지며, 플루란의 알파-1,6-글루코시드 결합을 가수분해할 수 있고, 녹말을 기질로 하여 말토옥타오스를 주산물로 포함하는 말토올리고당 혼합물을 생성할 수 있는 아밀로플루란네이즈, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 아밀로플루란네이즈를 0℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 30℃ 및 pH 7.0 내지 pH 8.0, 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 7.5에서 반응시켜 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 제조하는 방법일 수 있다.
상기 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈는 알파-1,4-글루코시드 결합 및 알파-1,6-글루코시드 결합 가수분해 활성을 가지며, 상세하게는 플루란(pullulan)을 최적 기질로 하고, 플루란의 알파-1,6-글루코시드 결합을 분해하여 말토트라이오스를 생성하며, 말토올리고당의 알파-1,4-글루코시드 결합에 대해서 가수분해능을 가지고, 전분을 포함한 녹말이 가지는 알파-1,6 글루코시드 결합을 분해하여 말토올리고당을 생성할 수 있으며, 상기 녹말의 분해에 의해 생성된 긴 사슬 길이의 말토올리고당을 가수분해할 수 있으나, 사이틀로덱스트린(cyclodextrin)을 가수분해할 수 없는 효소일 수 있다. 바람직하게는 상기 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 말토올리고당은 말토옥타오스를 주성분으로 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고, 말토헵타오스, 말토노나오스 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고, 글루코오스 분자수 7, 및 글루코오스 분자수 9 내지 11개의 말토올리고당으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 더욱 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 말토옥타오스일 수 있다.
본 발명에 있어서, 주성분이라 함은 말토올리고당이 두 종류의 말토올리고당으로 이루어진 경우에는 전체 말토올리고당을 기준으로 51 중량% 이상, 세 종류의 말토올리고당으로 이루어진 경우에는 전체 말토올리고당을 기준으로 40 중량 % 이상, 네 종류의 말토올리고당으로 이루어진 경우에는 전체 말토올리고당을 기준으로 30 중량% 이상인 성분을 의미하며, 바람직하게는 30 중량% 내지 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 40 중량% 내지 90 중량%인 것을 의미한다.
일 예로, 말토올리고당이 글루코오스 분자수 7 내지 11개인 말토올리고당으로 이루어진 경우에는 전체함량을 기준으로 주성분인 상기 말토옥타오스가 30 중량% 내지 80 중량%, 더욱 바람직하게는 40 중량% 내지 70 중량% 포함될 수 있다. 또한, 말토올리고당이 글로코오스 분자수 7 내지 9개인 말토올리고당으로 이루어진 경우에는 전체함량을 기준으로 주성분인 상기 말토옥타오스가 40 중량% 내지 90 중량%, 더욱 바람직하게는 45 중량% 내지 80 중량% 포함될 수 있다.
또한, 상기 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고, 말토헵타오스, 말토노나오스 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하는 말토올리고당은 바람직하게는 말토올리고당 혼합물 중, 말토헵타오스와 말토옥타오스의 함량이 중량기준으로 1:3 내지 1:5(말토헵타오스:말토옥타오스)이고, 말토노나오스와 말토옥타오스의 함량이 중량기준으로 1:2 내지 1:4(말토노나오스:말토옥타오스)인 혼합물인 것일 수 있다.
상기 말토헵타오스와 말토옥타오스의 함량은 중량기준으로 1:3 내지 1:5(말토헵타오스:말토옥타오스), 바람직하게는 1:3.5 내지 1:4.75, 더욱 바람직하게는 1:3.75 내지 1:4.5일 수 있고, 상기 말토노나오스와 말토옥타오스의 함량은 중량기준으로 1:2 내지 1:4(말토노나오스:말토옥타오스), 바람직하게는 1:2.25 내지 1:3.5, 더욱 바람직하게는 1:2.5 내지 1:3.25일 수 있다.
상기 녹말은 포도당(D-글루코오스)이 축합반응을 일으키면서 길게 연결되어 만들어지는 다당류를 의미하며, 전분이라고 명칭될 수 있다. 상기 녹말은 바람직하게는 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 녹말, 쌀 전분, 옥수수 전분, 감자 전분 및 밀 전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 녹말을 포함하는 기질은 바람직하게는 녹말 수용액일 수 있으나, 생산되는 물질의 종류 및 용도에 따라서 적절하게 선택될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 효소반응은 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 30℃ 및 pH 7.0 내지 pH 8.0, 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 7.5일 수 있다.
또한, 상기 효소반응에서 효소의 첨가량 및 반응시간은 기질 5 mg을 기준으로 상기 아밀로플루란네이즈를 1.5 mg 내지 14.6 mg, 바람직하게는 2.9 mg 내지 5.8 mg 첨가하여 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2시간 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 3시간 내지 15시간을 반응시켜 수행하는 것일 수 있다.
상기 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 제조하는 제조방법은 상기 녹말을 포함하는 기질에 디브랜칭 효소(debranching enzyme)를 첨가하여 전처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 전처리 단계는 상기 아밀로플루란네이즈를 상기 기질에 반응시키기 전에, 상기 녹말의 알파-1,6 글루코시드 결합을 가수분해하여, 알파-1,6 글루코시드 결합을 제거함으로써, 상기 녹말을 선형 말토올리고당 으로 제조하는 단계일 수 있다.
상기 디브랜칭 효소는 알파-1,6 글루코시드 결합을 선택적으로 가수분해하는 효소를 의미하며, 바람직하게는 아이소아밀레이즈(isoamylase)일 수 있다.
상기 전처리 단계는 40℃ 내지 70℃, 바람직하게는 60℃ 내지 65℃ 및 pH 4 내지 pH 5, 바람직하게는 pH 4.3 내지 pH 4.5에서, 기질 5 mg을 기준으로 상기 디브랜칭 효소를 0.2 mg 내지 0.4 mg, 바람직하게는 0.3 mg 내지 0.4 mg 첨가하여 10시간 내지 80시간, 바람직하게는 30시간 내지 70시간을 반응시켜 수행할 수 있다.
또한, 상기 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 제조하는 제조방법은 말토올리고당 농축 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상세하게는, 녹말에 아밀로플루란네이즈를 첨가하고 반응을 시켜 제조된 반응액 즉, 상기 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당에 유기용매를 가하여 불순물을 제거하고, 상기 불순물을 제거한 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당에서 말토옥타오스의 함량을 높이는 농축 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 유기용매는 알콜일 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알콜일 수 있고, 더욱 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
상기 유미용매를 가하여 불순물을 제거하는 농축 단계는
상기 녹말을 포함하는 기질에 아밀로플루란네이즈를 첨가하고 반응을 시켜 제조된 말토올리고당에 유기용매를 가하고 원심분리를 수행하는 단계; 및 상기 원심분리에 의해 얻어진 상등액만을 수거하여 침전물을 제거하는 단계일 수 있다. 상기 농축 단계에 의해, 글루코오스 분자수 12개 이상인 말토올리고당이 제거될 수 있다.
또한, 상기 상등액에 유기용매를 가하고 원심분리를 수행하는 단계 및 상기 원심분리에 의해 얻어진 상등액을 제거하여 침전물을 얻는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 상등액을 제거하여 글루코오스 분자수 6개 이하인 말토올리고당이 제거됨으로써, 글루코오스 분자수 7 내지 11개의 말토올리고당, 바람직하게는 글루코오스 분자수 7 내지 9개의 말토올리고당, 더욱 바람직하게는 말토옥타오스의 함량이 더욱 높아질 수 있다.
일 예로, 상기 농축단계는 녹말에 아밀로플루란네이즈를 첨가하고 반응시켜 제조된 반응액에 에탄올을 상기 반응액 부피의 5배를 첨가한 후, 원심분리를 수행하고 상등액을 얻는다. 상기 원심분리에 의해 침전된 침전물의 제거를 통하여 글루코오스 분자수 12개 이상인 말토올리고당을 제거할 수 있다. 또한, 상기 원심분리를 수행하고 얻은 상등액에 다시 동일한 부피 즉, 상기 녹말에 아밀로플루란네이즈를 첨가하고 반응시켜 제조된 반응액 부피의 5배의 에탄올을 추가적으로 가한 후, 원심분리를 수행하고 상등액을 제거한다. 상기 원심분리에 의해 침전된 침전물에는 글루코오스 분자수 6 내지 12개인 말토올리고당, 바람직하게는 글루코오스 분자수 7 내지 11개인 말토올리고당이 포함되어 있으므로, 상기 상등액을 제거하여 글루코오스 분자수 5개 이하인 말토올리고당 등의 불순물을 제거할 수 있다.
한편, 상기 최초의 원심분리 후 제거한 침전물 즉, 글루코오스 분자수 12개 이상인 말토올리고당으로 이루어진 침전물은 70℃ 내지 100℃, 바람직하게는 90℃ 내지 100℃의 증류수를 이용하여 수용화시킨 후, 상기의 아밀로플루란네이즈를 이 용하는 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당을 제조하는 말토올리고당 제조단계를 수행할 수 있다.
즉, 글루코오스 분자수 12개 이상인 말토올리고당으로 이루어진 침전물은 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기의 아밀로플루란네이즈를 이용하는 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당 제조단계의 기질로 재사용될 수 있다.
또한, 상기 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당 제조방법은 추가로 정제과정을 수행할 수 있다. 상기 정제과정은 크로마토그래피, 바람직하게는 액체 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 과정일 수 있다. 일예로, 상기 액체크로마토그래피는 젤투과컬럼을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피를 이용한 정제과정은 상기 농축과정 후에 수행할 수 있다.
상기 제조방법은 상기 정제과정을 통하여, 고순도의 글루코오스 분자수 7 내지 11개인 말토올리고당, 바람직하게는 고순도의 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스의 혼합물, 더욱 바람직하게는 고순도의 말토옥타오스를 제조할 수 있다.
본원 발명에 따른 녹말로부터 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당 제조방법은, 말토옥타오스를 주산물로 하는 말토올리고당을 손쉽게 제조할 수 있으며, 상기 방법에 의해 제조된 말토옥타오스를 주산물로 하는 말토올리고당, 바람직하게는 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고, 글루코오스 분자수 7 및 9 내지 11개인 말토올리고당으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 더욱 포함하는 것인 말토올리고당, 더욱 바람직하게는 말토옥타오스는 저감미 신소재로서 식품에 널리 이용이 가능하 다. 또한 이로부터 분리정제를 통해 얻어지는 고순도 말토옥타오스 농축액은 혈중 아밀레이즈 활성 측정에 이용될 수 있어, 진단 시약의 원료용으로 널리 활용될 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본원 발명은 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 말토올리고당의 사슬 길이에 따른 가수분해 속도 차이를 이용하여, 녹말로부터 손쉽게 말토옥타오스를 반응액에 축적시켜, 말토옥타오스를 주산물로 하는 말토올리고당 혼합 농축액을 제조함으로써, 의약분야, 화학시약분야 또는 식품분야 등 다양한 분야에 사용되는 고순도의 말토옥타오스를 쉽고 간단하게 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 기술이 이용하던 값비싼 원료인 감마-싸이클로덱스트린을 경제적인 원료인 녹말로 대체함으로써 저가의 비용으로 말토옥타오스 농축액을 제조할 수 있어 산업적으로 그 이용가치가 매우 높다.
이하 본원 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본원 발명을 보다 명확하게 나타내기 위하여 본원 발명의 일예를 기재한 것일 뿐, 본원 발명의 보호범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈 유전자 클로닝 및 아밀로플루란네이즈 생산
1-1 아밀로플루란네이즈 유전자 클로닝
노스탁속 균주 PCC73102(Nostoc sp. PCC73102, ATCC, USA)를 ATCC medium 819 Blue-Green Nitrogen-fixing medium[0.04 g K2HPO4, 0.075 g MgSO4·7H2O, 0.036 g CaCl2··2H2O, 6.0 mg Citric acid, 6.0 mg Ferric ammonium citrate, 1.0 mg EDTA, 0.02 g Na2CO3, 1 mL Trace metal Mix A5(2.86 g H3BO3, 1.81 g MnCl2·4H2O, 0.222 g ZnSO4·7H2O, 0.39 g Na2MoO4·2H2O, 0.079 g CuSO4··5H2O, 49.4 mg Co(NO3)2·6H2O] 50ml에 접종하여 25℃에서 배양하고 원심분리하여 균체를 회수하고 염색체 DNA를 분리하였다(Dubnau, D. and R. D. Abenson, 1971, J. Mol. Biol., 56, 209-221)
즉, 회수된 균체에 라이소자임을 처리하여 원형질체 세포로 만든 다음 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 넣어 세포를 완전히 파괴한 후 전체 반응액에 대해 농도가 1몰이 되도록 소디움 클로라이드를 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 이것을 원심분리하여 상등액만을 취하고, 페놀:클로로포름:아이소아밀알콜의 혼합액(각 용액의 부피의 비 = 25:24:1)을 상등액과 동일한 부피로 첨가하여 액 중의 단백질 등 불순물을 제거하였다. 이 과정을 수회 반복하였다. 두 배 부피의 99%의 에탄올을 첨가하여 침전시키고, 이것을 유리막대로 감아서 분리하여 1/10xSSC 완충용액(3M 소디움 클로라이드, 0.3M 소디움 시트레이트)에 녹였다.
상기 아밀로플루란네이즈 유전자는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여, 하기 표 2의 방법으로 PCR을 수행하여 아밀로플루란네이즈 유전자를 분리하였다.
상기 아밀로플루란네이즈 유전자를 분리하기 위하여 정방향 프라이머 Nos-NdeI(5'-AAA AAG TTA CAT ATG CAA ATT CAA ACA CCA-3', 서열번호 1) 및 역방향 프라이머 Nos-XhoI(5'-AAA GTC CTC GAG GTC CCC AGT CCC CAG GAT-3', 서열번호 2)를 각각 제작하였으며, 상기 프라이머는 하기 표 1과 같다.
서열 서열번호
정방향 프라이머 Nos-Ndd I 5'-AAA AAG TTA CAT ATG CAA ATT CAA ACA CCA-3' 1
역방향 프라이머 Nos-Xho I 5'-AAA GTC CTC GAG GTC CCC AGT CCC CAG GAT-3' 2
노스탁속 균주 염색체 DNA에 대해 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 PCR 산물을 TNERM하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 약 1.5 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
단계(STEP) 온도 반응시간
First(1st) denaturation 95 ℃ 5 min
Second(2st) denaturation 95 ℃ 1 min
Annealing 55 ℃ 30 sec
Extension 72 ℃ 1min 30sec
Cycle go to denaturation 33 cycles
Final extension 72 ℃ 7 min
상기 PCR 산물을 37℃에서 6시간 동안 제한효소 NdeI과 XhoI로 처리하고, 이를 동일한 제한 효소로 처리한 pET-29b 발현벡터(Novagen, 독일)와 라이게이션하여 pETNPul6xH를 제조하였다. 상기 라이게이션을 통하여 제조한 재조합 벡터 pETNPul6xH의 벡터의 개열지도를 도 3에 나타내었다. 상기 pETNPul6xH 벡터는 아밀로플루란네이즈 유전자를 포함하며, 상기 아밀로플루란네이즈 유전자의 3' 말단에 8개의 부가적인 아미노산 잔기(Leu-Glu-6His)를 포함하고 있다.
형질전환을 위하여, 5 ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1016(New England Biolab(NEB), USA)를 접종하여 37℃ 에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ml을 새로운 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다.
상기 흡광도를 확인한 배양액 1.5 ml를 4℃에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75 ml의 형질전환용액I(50 mM CaCl2)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 4℃에서 6000 x g의 조건으로 2분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 0.15 ml의 형질전환용액II(100 mM CaCl2)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다.
현탁액 0.15 ml와 500 ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1시간 방치한 후 42℃에서 2분간 열 충격을 주었다. 상기 열 충격을 준 혼합액에 0.8 ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 카나마이신(최종농도 20℃ g/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.
1차 선별된 균주를 카나마이신이 포함된 LB 액체 배지 5 ml에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리키트(Qiagen, USA)로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 상기와 동일한 NdeI과 XhoI제한 효소를 이용하여 상기와 동일한 조건에서 절단하여, 약 1.5 kb의 크기의 아밀로플루란네이즈 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다.
1-2 형질전환체의 배양 및 아밀로플루란네이즈의 생산
상기에서 제조한 pETNPul6xH 벡터를 E. coli BL21(DE3)에 상기와 동일한 방법으로 형질전환시킨 후 카나마이신 내성여부를 확인하여 상기 벡터가 형질전환된 균주 즉, 형질전환체를 선별하였다 선별한 형질전환체는 카나마이신이 함유된 LB 액체 배지 2.5 L에 접종하고 37℃에서 배양하여 600 nm에서 흡광도가 0.6이 될 때 IPTG를 최종농도 0.5 mM로 첨가하여 25 내지 37℃에서 5시간 배양하였다. 상기 IPTG 첨가 후, 온도에 따른 아밀로플루란네이즈의 발현양을 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타난 바와 같이, 배양 온도에 따른 아밀로플루란네이즈의 발현양은 측정한 결과 30℃이상의 온도에서는 플루란네이즈의 발현양이 극히 적었으며, 25℃에서의 발현율이 제일 우수함을 알 수 있었다.
1-3 정제
상기에서 선별한 형질전환주를 배양한 후, 4℃에서 7,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 300 mM NaCl과 10 mM 이미다졸이 함유된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)으로 현탁한 후, 상기 현탁한 균체를 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파 분쇄를 수행한 배양액을 10,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 수득된 상등액은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 정제하였다.
재조합 벡터 pETNPul6xH로 형질전환 시킨 E. coli BL21(DE3)에서 생산된 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 정제단계별 시료의 전기영동 사진을 도 5에 나타내었다. 상기 도 5의 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 E. coli BL21(DE3)/pETNPul6xH 형질전환체를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, 레인 2는 상기 초음파 분쇄 후 수득한 상득액의 시료를 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제한 아밀로플루란네이즈이다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 아밀로플루란네이즈(레인 2)는 Ni-NTA 친화 크로마토그래피 과정을 통하여 효율적으로 정제된 것을 확인할 수 있으며, SDS-PAGE상에서 상기 아밀로플루란네이즈의 크기는 약 55,000 Da의 분자량을 나타내어 상기 아밀로플루란네이즈의 아미노산 서열로부터 유추된 이론적 분자량과 유사한 값을 나타내었다.
상기 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제한 아밀로플루란네이즈의 분자량을 확인하기 위하여 MALDI-TOF MS 분석을 수행하였으며, 상기 MALDI-TOF MS 분석결과를 도 6에 나타내었다(Maldi-T of Mass Spcetrometry of Synthetic polymers, Harald Pasch and Wolfgang Schrepp, Springer-Verlag(2003)).
상기 도 6에 나타낸 아밀로플루란네이즈의 MALDI-TOF MS 분석 결과는 56584.39로 나타났으며, 상기 분석결과는 아밀로플루란네이즈에 Histidine tag이 결합된 것에 해당되므로, 상기 MALDI-TOF MS 분석 결과는 아미노산 서열로부터 유추된 이론적 분자량인 56,512 Da과 거의 동일한 값을 나타내었다.
실시예 2: 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 특성
2-1 효소 역가
50mM sodium phosphate (pH7.0) 완충용액에 용해된 1% 풀루란 125㎕ 에 50mM sodium phosphate (pH7.0) 완충용액 100㎕와 효소 30㎕넣어 반응용액을 만들었다. 효소를 넣지 않은 반응용액을 25℃에서 5분간 예열하고 효소를 넣고 10분간 반응시킨다. 750㎕ DNS 용액 (3.5-dinitrosalicylic acid 10.6g, NaOH 19.8g, Na,K-Tartrate 306g, phenol 7.6ml, Na-metabisulfite 8.3g 과 증류수 1,416ml) 을 넣어 반응을 중지시킨다. 효소를 넣지 않은 반응은 대조군으로 사용한다. 반응용액을 5분간 끓인 뒤, 흐르는 찬물로 식힌다. 570 nm 에서 흡광도를 측정한다. 1 unit은 특정 반응조건하에서 1분 동안 생성되는 환원당 1μmol 을 형성하는데 필요한 효소의 양을 말한다.
2-2 pH 특성
본원 발명의 아밀로플루란네이즈의 최적 반응 pH를 결정하기 위해, 다양한 pH 범위의 브리튼 로빈슨 완충액(pH 2.0 내지 11.0) 각각에 파라나이트로 페닐 말토펜타오스를 첨가하여 1%(w/v) 파라나이트로 페닐 말토펜타오스 기질 용액을 제조하고, 용해된 1%(w/v) 파라나이트로 페닐 말토펜다오스 기질 용액 300 ㎕에 실시예 1-3의 아밀로플루란네이즈 30 ㎕을 넣고 25℃에서 4분 동안 반응시킨 후, 에탄올 400 ㎕과 2M 트리스 100 ㎕를 넣어 반응을 중단시켰다. 상기 반응을 중단시킨 반응액을 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 최고 흡광도 값을 기준으로 상대적 활성을 측정하였다.
도 7은 아밀로플루란네이즈의 pH에 따른 효소활성을 나타낸 것으로, 본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 pH 7.5에서 최적의 역가를 가지며 pH 7.0 내지 8.0에서 50 % 이상의 역가를 유지하였다.
2-3. 온도 특성
본원 발명의 아밀로플루란네이즈의 최적 반응 온도를 결정하기 위해, 50 mM 소디움 포스페이트 완충액 (pH 7.0)에 파라나이트로 페닐 말토펜타오스를 첨가하여 1%(w/v) 파라나이트로 페닐 말토펜타오스 기질 용액을 제조하고, 5 내지 60℃의 다양한 온도범위로 기질 용액을 가열시킨 후, 실시예 2-2의 방법에 따라 흡광도를 측정하여 상대적 효소활성을 측정하였다.
도 8은 아밀로플루란네이즈의 온도에 따른 효소활성을 나타낸 것으로, 본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 25℃에서 최적의 역가를 가지며 10 내지 40℃에서 약 60% 이상의 역가를 유지하였다.
2-4 효소 기질 특이성
아밀로플루란네이즈의 효소 기질 특성을 확인하기 위하여, 기질로서 글루코오스(G1, glucose), 말토오스(G2, maltose), 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose), 말토펜타오스(G5, maltopentaose), 말토헥사오스(G6, maltohexaose), 말토헵타오스(G7, maltoheptaose), 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린, 가용성 녹말 및 플루란을 사용하여 아밀로플루란네이즈에 의한 분해 산물을 분석하였다.
상세하게는 50 mM 소디움 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에 각각의 기질을 1%(w/v)의 농도로 용해시켜, 기질 용액 150㎕을 제조하였다. 상기 제조된 각각의 기질용액에 상기 50 mM 소디움 포스페이트 완충용액 120 ㎕을 추가하고 실시예 1-3의 아밀로플루란네이즈 30 ㎕(0.1 unit)를 넣고 25℃에서 12 시간 동안 반응시킨 후, 상기 아밀로플루란네이즈 반응액을 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 상기 반응을 종결시킨 각 시료의 반응액를 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1 ㎕씩 로딩하고, 아이소프로필 알콜, 에틸 아세테이트 및 증류수가 3:1:2(아이소프로필 알콜 : 에틸 아세테이트 : 증류수, v/v/v)로 혼합된 전개액에서 1회 전개시킨 후, 건조시켜 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(w/v) 황산을 함유한 메탄올에 담갔다 꺼낸 후, 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켰으며, 상기 효소의 기질 특이성을 확인하기 위해, 아밀로플루란네이즈에 의한 분해 산물을 박막 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 도 9에서 본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 플루란을 가수분해하여 말토트라이오스를 생성하는 전형적인 플루란네이즈의 특성을 보임을 알 수 있었다. 또한 상기 아밀로플루란네이즈는 사슬의 길이가 3인 즉, 글루코오스가 3개인 말토트라이오스(maltotriose, G3) 이하의 기질은 가수분해를 하지 못하나, 글루코오스가 4개 이상인 말토올리고당이 가지는 알파-1,4-글리코시드 결합에 대해서는 가수분해능을 보임을 알 수 있다. 또한, 상기 아밀로플루란네이즈는 싸이클로덱스트린이 가지는 알파-1,4-글리코시드 결합은 가수분해하지 못하였으나, 가용성 녹말에 대해서는 활성을 보여, 글루코스와 말토오스 그리고 말토옥타오스를 생성함을 알 수 있었다.
2-5 아밀로플루란네이즈의 녹말 분해 경향 분석
아밀로플루란네이즈의 녹말 분해 경향을 분석하기 위하여, 기질로서 아밀로펙틴, 아밀로오스, 가용성 녹말, 왁스 전분, 쌀 전분, 옥수수 전분 및 밀 전분을 사용하여 노스탁속 균주 플루란네이즈에 의한 분해 산물을 분석하였다.
상세하게는 실시예 2-4의 방법에 따라 50 mM 소디움 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에 1%(w/v)의 농도로 용해시킨 각 기질과 아밀로플루란네이즈를 반응시키고, 반응을 종결시킨 뒤, 상기 반응을 종결시킨 각 시료의 반응액을 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1 ㎕씩 로딩하고, 아이소프로필 알콜, 에틸 아세테이트 및 증류수가 6:1:3(아이소프로필 알콜 : 에틸 아세테이트 : 증류수, v/v/v)로 혼합된 전개액에서 1회 전개시킨 후, 건조시켜 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(w/v) 황산을 함유한 메탄올에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켰으며, 상기 효소의 녹말 분해 경향을 분석하기 위하여, 아밀로플루란네이즈에 의한 분해 산물을 박막 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과를 도 10에 나타내었다.
상기 도 10에서 M은 말토올리고당 표준 물질이고, 레인 1은 기질로 아밀로펙틴을 사용한 것이고, 레인 2은 기질로 아밀로오스를 사용한 것이며, 레인 3은 기질로 가용성 녹말을 사용한 것이고, 레인 4는 기질로 왁스 녹말을 사용한 것이고, 레인 5는 기질로 쌀 전분을 사용한 것이며, 레인 6은 기질로 옥수수 전분을 사용한 것이고, 레인 7은 기질로 밀 전분을 사용한 것이다.
상기 도 10에 나타난 바와 같이, 본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 녹말을 가수분해하여 글루코오스, 말토오스 및 말토옥타오스를 주산물로 생성하는 특성을 보임을 알 수 있다.
실시예 3: 아밀로펙틴를 이용하여 말토옥타오스를 주산물로 하는 혼합액의 제조
아밀로플루란네이즈의 아밀로펙틴 분해 경향을 박막크로마토그래피(TLC) 및 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
3-1 박막크로마토그래피를 이용한 아밀로플루란네이즈의 아밀로펙틴 분해 경향 분석
실시예 2-4의 방법에 따라 50 mM 소디움 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에 1%(w/v)의 농도로 용해시킨 아밀로펙틴과 아밀로플루란네이즈를 반응시키고, 반응을 종결시킨 뒤, 상기 실시예2-5와 같은 방법으로, 아밀로플루란네이즈에 의한 분해 산물을 박막 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과를 도 11에 나타내었다.
상기 도 11에서 M은 말토올리고당 표준 물질이고, 레인 1은 기질로 아밀로펙틴을 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 이용하여 분해한 분해 산물의 박막 크로마토그래피 분석 결과이다.
상기 도 11에 나타난 바와 같이, 본원 발명의 아밀로플루란네이즈는 아밀로펙틴을을 가수분해하여 글루코오스, 말토오스 및 말토옥타오스를 주산물로 생성하는 특성을 보임을 알 수 있다.
3-2 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 아밀로플루란네이즈의 아밀로펙틴 분해 경향 분석
상기 실시예 3-2에서 수득한 반응액을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High-Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC)를 이용하여 분석하였다(Determination of saccharides in biological materials by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection, Journal of Chromatography, 546, pp297-309(1991)).
상세하게는, 시료 즉, 상기 반응액은 용출액을 초순수로 3배 희석하여 0.45 ㎛ 박막여과지로 여과하여 20 ㎕를 주입하였고, 유속은 분당 1 ml로 하였다. HPAEC 분석은 GP40 그래디언트 펌프(Dionex사, USA)의 , ED40 전기화학적 검출기(Dionex사, USA) 및 카보팩-컬럼(CarboPac PA1)을 이용하여 시행하였으며, A 용매로는 150 mM의 가성소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐 아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 하여 40분후에 B 용매가 40분 동안 0에서 40%가 되도록 직선적으로 농도구배를 걸어주었다.
상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 실시예 3-1에 의해 제조된 아밀로펙틴을 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 반응시켜 생성된 반응 산물을 분석한 결과를 도 12에 나타내었다.
상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3-1에서 수득한 아밀로펙틴에 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 반응시켜 생성된 반응물의 주된 구성 성분은 글루코오스, 말토오스, 말토옥타오스임을 나타낸다.
또한, 상기 도 12는 상기 반응 산물 중, 전체 말토올리고당에서 글루코오스 분자수 7 내지 9개인 말토올리고당, 특히 말토옥타오스(G8)의 함량이 높은 것을 확인하였으며, 상기 도 12의 분석결과, 말토헵타오스와 말토옥타오스의 함량비가 3:13(말토헵타오스:말토옥타오스)이고, 말토옥타오스와 말토노나오스의 함량비가 13:5(말토옥타오스:말토노나오스)인 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본원발명의 아밀로플루란네이즈의 반응시간, 반응조건 및 기질 대비 효소양을 조절하여, 부산물의 생성을 최소화하여 간단하게 고순도의 말토옥타오스를 고수율로 얻을 수 있음이 확인되었다.
실시예 4: 이소아밀레이즈 (isoamylase)로 전처리된 녹말류를 이용하여 말토옥타오스를 주산물로 하는 혼합액의 제조
4-1 녹말의 전처리
아밀로펙틴과 옥수수 전분을 각각 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 4.3)에 0.5%(w/v)이 되도록 녹인 후, 기질 50mg을 기준으로 아이소아밀레이즈 0.34 mg을 첨가하여 60℃에서 60시간동안 반응시켰다. 반응 후, 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
4-2 말토옥타오스를 주산물로 하는 혼합액의 제조
실시예 4-1에 따라 전처리된 녹말 즉, 선형 말토올리고당의 기질 용액에, 동일 완충용액 500 mM 소디움 페스페이트 완충용액을 이용하여 반응액의 pH를 7.0으로 맞춘 후, 25℃에서 5분간 예열하였다. 상기 각각의 기질 용액 50mg을 기준으로 실시예 1-3의 아밀로플루란네이즈 47.3mU를 넣고 25℃에서 7시간 동안 반응시킨 후, 상기 아밀로플루란네이즈 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
4-3 반응액의 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 분석
상기 실시예 4-2에서 수득한 반응액을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High-Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC)를 이용하여 분석하였다(Determination of saccharides in biological materials by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection, Journal of Chromatography, 546, pp297-309(1991)).
상세하게는, 시료 즉, 상기 반응액은 용출액을 초순수로 3배 희석하여 0.45 ㎛ 박막여과지로 여과하여 20 ㎕를 주입하였고, 유속은 분당 1 ml로 하였다. HPAEC 분석은 GP40 그래디언트 펌프(Dionex사, USA)의 , ED40 전기화학적 검출기(Dionex사, USA) 및 카보팩-컬럼(CarboPac PA1)을 이용하여 시행하였으며, A 용매로는 150 mM의 가성소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐 아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 하여 40분후에 B 용매가 40분 동안 0에서 40%가 되도록 직선적으로 농도구배를 걸어주었다.
상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 실시예 4-1에 의해 제조된 아이소아밀레이즈로 전처리한 기질 즉, 아밀로펙틴과 옥수수 전분에 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 반응시켜 생성된 반응 산물을 분석한 결과를 도 13에 나타내었다. 상기 도 13-1 및 13-2는 아밀로펙틴에 대한 결과이고, 도 13-3 및 13-4는 옥수수전분에 대한 결과이다.
상기 도 13에 나타낸 바와 같이, 도 13-1 및 도 13-3은 실시예 4-1에서 수득한 아밀로펙틴과 옥수수 녹말을 아이소아밀레이즈로 전처리한 녹말 즉, 선형 말토올리고당들은 주로 사슬의 길이가 8이상인 말토올리고당으로 구성되어 있음을 나타낸다. 또한 도 13-2 및 도 13-4는 상기 실시예 3-1에서 수득한 아이소아밀레이즈로 전처리한 녹말에 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 반응시켜 생성된 반응물의 주된 구성 성분은 글루코오스, 말토오스, 말토옥타오스임을 나타낸다.
또한, 상기 도 13은 디브렌칭 효소의 일종인 아이소아밀레이즈를 이용하여 전처리한 녹말 즉, 녹말의 알파-1,6 글리코시드 결합을 제거하여 제조된 선형 말토올리고당을 기질로 하면, 글루코오스 분자수 7 내지 11개인 말토올리고당, 특히 말토옥타오스를 생성하는 반응의 반응시간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 부산물의 생성을 최소화할 수 있도록 반응 조건을 용이하게 조절 할 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기 옥수수 전분에서도 아밀로펙틴과 같은 경향의 결과를 아밀로펙틴 뿐만 아니라 다양한 형태의 전분을 이용하여, 글루코오스 분자수 7 내지 11개인 말토올리고당, 특히 말타옥타오스를 용이하게 생성할 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 5: 말토옥타오스의 분리 및 정제를 통한 고순도 말토옥타오스 농축액 제조
5-1 에탄올을 이용한 말토옥타오스의 분획
실시예 4-2에 따라 제조된 말토옥타오스 농축액에 차가운 에탄올을 상기 농축액 부피의 5배를 첨가한 후, 4 ℃ 및 12,000 rpm의 조건으로 20분간 원심분리한 후에, 상등액만을 얻어 글루코오스 분자수 12개 이상인 말토올리고당을 제거하였다. 상기 상등액에 다시 동일한 부피 즉, 상기 에탄올을 상기 농축액 부피의 5배를 추가적으로 가하고, 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하여 말토옥타오스를 비롯하여 글루코오스 분자수 6 내지 11개인 말토올리고당이 포함된 말토올리고당을 회수하였다.
도 14는 상기 에탄올을 이용하여 글루코오스 분자수 12개 이상인 말토올리고당과 글루코오스 분자수 5개 이하인 말토올리고당을 제거하여 말타옥타오스를 분획한 분획물을 박막 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 에탄올을 이용한 분획에 의하여 제조된 분획물은 주로 말토옥타오스를 비롯하여 글루코오스 분자수 7 내지 11개인 말토올리고당, 보다 구체적으로는 글루코오스 분자수 7 내지 9개인 말토올리고당으로 이루어져있음을 알 수 있었다.
5-2 반응액의 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 분석
상기 실시예 4-1에 의해 제조된 말토올리고당을 실시예 3-3과 동일한 방법으로 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하고, 그 분석결과를 도 15에 나타내었다.
상기 도 15에 나타낸 바와 같이, 사슬의 길이가 4 이하인 올리고당과 사슬의 길이가 12 이상인 말토올리고당이 에탄올을 이용한 분획을 통해 비교적 간단히 제거될 수 있었으며, 전체 말토올리고당에 대한 말토옥타오스의 함량이 50중량%이어서, 상기 방법에 의해 말토옥타오스를 고순도로 분리, 정제할 수 있었다.
하기 표 3은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여 분석한, 상기 실시예 5-1을 통해 제조된 고순도 말토옥타오스 농축액의 조성이다.
조성 중량%
말토헥사오스 (G6) 1
말토헵타오스 (G7) 13
말토옥타오스 (G8) 50
말토노나오스 (G9) 17
말토데카오스 (G10) 10
말토언데카오스(G11) 7
말토도데카오스 (G12) 2
합계 100
5-3 반응시간에 따른 말토옥타오스 함량의 분석
상기 실시예 4-2의 방법으로 수행하되, 아밀로펙틴을 기질로 하고, 상기 기질과 실시예 1-3의 아밀로플루란네이즈의 반응 시간을 30분 내지 24시간동안 반응하여 수행하였다.
상기 반응물을 실시예 4-3과 동일한 방법으로 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하고, 그 분석결과를 도 16에 나타내었다.
상기 도 16에 나타낸 바와 같이, 기질과 아밀로플루란네이즈를 1시간 동안 반응시킨 경우, 말토옥타오스 뿐만 아니라, 말토노나오스를 포함한 글루코오스 분자수 9개 이상인 말토올리고당을 다량으로 포함하는 것으로 나타났다. 반면, 효소반응의 반응시간이 5시간인 경우, 다른 말토올리고당에 비하여 말토옥타오스가 높은 함량을 나타내었으며, 글루코오스 분자수 10개 이상인 말토올리고당의 함량이 매우 낮아지는 것이 확인되었다. 또한, 효소반응의 반응시간이 18시간인 경우, 글루코오스 분자수 9개 이상인 말토올리고당의 함량은 매우 낮아졌으나, 글루코오스 분자수 5개 이하인 말토올리고당의 함량이 높아져, 즉 불순물의 함량이 높아지는 것을 확인하였다.
상기한 결과로부터, 글루코오스 분자수 7개 내지 11개인 말토올리고당을 제조함에 있어서, 반응시간을 조절함으로써 제조 효율을 높이고 불순물의 함량을 낮춰 순도를 높힐 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 키네틱스 자료를 통한 아밀로플루란네이즈의 기질 특이성 확인
본원 발명의 아밀로플루란네이즈가 녹말로부터 말토올리고당을 제조하는 경우, 말토옥타오스를 주산물로 생성한다는 것을 확인하기 위하여, 기질의 종류를 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스로 구분하여 각 반응의 Km 값 및 Km/Kcat 값을 측정하였다.
6-1 기질의 제조
상기한 바와 같이, 아밀로플루란네이즈의 기질 특이성을 확인하기 위하여 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스를 제조하였다.
상세하게는, 말토스를 50mM 소디움 아세테이트(Sodium acetate) 완충용액(pH 7.5)에 5% 가용성전분과 5% 말토스를 녹여 반응용액을 제조하였다.
상기 제조된 반응용액을 70 ℃로 예열한 후에, Thermus aquaticus 유래 알파-글루카노트랜스퍼레이즈(a-Glucanotransferase)를 첨가하고 15 시간 동안 반응시켰다.
상기 반응액을 15분 동안 121 ℃에서 유지시켜 반응을 종결시킨 후에, Preparative recycling HPLC(High performance liquid chromatography, JAI Co., Japan)를 이용하여 상기 반응액으로부터 말토헵타오스(G7), 말토옥타오스(G8) 및 말토노나오스(G9)를 정제하여 반응 기질을 제조하였다.
6-2 아밀로플루란네이즈의 기질에 따른 반응속도 측정
상기 실시예 6-1에서 제조한 각각의 기질에 실시예 1-3의 아밀로플루란네이즈 100 μl를 첨가하고 25 ℃ 및 pH 7 에서 3 분간 반응을 진행하였다.
본 발명의 아밀로플루란네이즈는 도 17에서 보는 바와 같이, 말토헵타오스(G7), 말토옥타오스(G8) 및 말토노나오스(G9)를 글루코오스 단위로 가수분해하기 때문에, 기질 특이성을 확인하기 위한 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토나노오스의 Km 값 및 Km/Kcat 값의 역가 측정은 글루코오스 양을 정량하는 GOD-POD 방법(J. D. FOX and J. F. Robyt, Anal. Chem. 195(1) 93-96(1991))으로 수행하였으며 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Figure 112007053384363-PAT00001
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 각 기질의 Km 값을 비교하면, 말토헵타오스의 값은 말토옥타오스 및 말토노나오스의 값에 비해 7 배 또는 20 배 큰 것으로 확인되었고, Kcat 값을 비교하면, 말토노나오스의 값이 말토헵타오스의 값에 비하여 3배 정도 큰 것으로 확인되었다. 또한, Km/Kcat을 비교하면, 말토옥타오스의 값이 말토헵타오스의 값에 비하여 2.5 배 내지 3.5 배, 바람직하게는 3배 정도 높고, 말토노나오스의 값은 말토헵타오스의 값에 비해 55 배 내지 65배, 바람직하게는 59 배 내지 63 배, 더욱 바람직하게는 60배 내지 62 배 높은 것으로 확인되었다.
상기한 결과로부터, 상기 세 가지 기질 중에서 말토노나오스가 최적의 기질임이 확인되었으며, 이러한 사실로부터 본원 발명의 아밀로플루란네이즈가 전분을 말토옥타오스 단위로 선택적으로 가수분해할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 상기한 결과로부터 전분을 이용하여 말토옥타오스를 제조하는 경우에 본원 발명의 아밀로플루란네이즈를 이용하면, 우수한 수율로 고농도의 말토옥타오스를 생성할 수 있어 본원발명의 아밀로플루란네이즈는 산업적으로 그 효과가 매우 클 것으로 기대되었다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 이용하여 녹말을 포함하는 기질로부터 말토옥타오스가 주산물인 고순도 말토올리고당을 제조하는 공정도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 유전자서열이며,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터인 pETNPul6xH의 개열지도이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 IPTG 첨가 후, 배양 온도에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 발현양을 활성 측정을 통해 나타낸 사진이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터 pETNPul6xH로 형질전환시킨 E. coli BL21(DE3)에서 생산된 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 정제단계별 SDS-PAGE 전기영동 사진이며,
도 6은 정제된 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 MALDI-TOF MS(matrix associated laser desorption ionization - time-of-flight mass spectrometry) 분석 결과이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 pH에 따른 효소활성을 나타낸 것이며,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈의 온도에 따른 활성을 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 글루코오스(G1, glucose), 말토오스 (G2, maltose), 말토트라이오스 (G3, maltotriose), 말토테트라오스 (G4, maltotetraose), 말토펜타오스 (G5, maltopentaose), 말토헥사오스 (G6, hexaose), 말토헵타오스 (G7), 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린, 가용 녹말, 플루란(pullulan)에 작용시킨 후 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)로 분석한 사진이며, 도 9의 -는 플루란네이즈가 없는 대조군을 의미하고, +는 플루란네이즈가 첨가된 실험군을 의미하며,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 다양한 녹말에 반응시킨 결과물을 TLC로 분석한 사진이고,
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 아밀로펙틴에 반응시킨 결과물을 TLC로 분석한 사진이며,
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 아밀로펙틴에 반응시킨 결과물을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High-Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC)로 분석한 결과이고,
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 아이소아밀레이즈 (isoamylase)를 이용하여 전처리한 녹말에 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 작용시킨 반응용액을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피로 분석한 결과이며,
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 아아이소아밀레이즈 (isoamylase)를 이용하여 전처리한 아밀로펙틴에 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 작용시킨 반응용액에 에탄올을 이용하여 말타옥타오스를 분획한 분획물을 박막 크로마토그래피로 분석한 사진이고,
도 15은 본 발명의 일 실시예에 따른 아아이소아밀레이즈 (isoamylase)를 이용하여 전처리한 아밀로펙틴에 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 작용시킨 반응용액에 에탄올을 이용하여 말타옥타오스를 분획한 분획물을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피로 분석한 결과이며,
도 16는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 아아이소아밀레이즈 (isoamylase)를 이용하여 전처리한 아밀로펙틴에 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 시간별로 작용시켜 얻은 반응용액에 에탄올을 이용하여 말토옥타오스를 분획한 분획물을 성능 음이온 교환 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 말토헵타오스, 말토옥타옷, 및 말토노나오스에 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈를 시간별로 작용시켜 얻은 반응용액을 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION <120> NOSTOC SP-DERIVED AMYLOPULLULANASE AND PREPARATION METHOD OF MALTOOLIGOSACCHARIDE WITH THE SAME <130> dpp20071349kr <150> KR10-2007-0010473 <151> 2007-02-01 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nod NddI-For <400> 1 aaaaagttac atatgcaaat tcaaacacca 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nox-XhoI-Rev <400> 2 aaagtcctcg aggtccccag tccccaggat 30 <210> 3 <211> 1467 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amylopullulanase derived Nos sp. <400> 3 atgcaaattc aaacaccaga ttgggtaaag cacgctgttt tctaccaaat tttcccagat 60 cgctttgcca gaagcaaaca gccgcgcaaa cggttattgc aagaagcccg ttgggaagat 120 tgggactcta tgccaaccct ccagggttat aaaggtgggg atttatgggg catcatggag 180 gatttagact acatccagaa tttggggatt aacgcgattt atttcacacc catctttcaa 240 tccgccagta atcaccgcta tcatacccac gattattatc aagttgaccc gatgttaggg 300 ggcaacgagg cttttaaaga attgcttgat gcagcccatc aacggaatat caaagtcgtt 360 ctggatgggg tgtttaacca ttccagccgt ggctttttct ttttccacga cgttttagaa 420 aatggccccc attcaccttg ggtaaattgg ttcaaaatag aaggctggcc cctttcacct 480 tataacggtg aattccctgc aaactacgtg ggttgggcgg gaaatcgcgc cttgccagaa 540 tttaaccacg ataatccaga agtacgagaa tatattatgg aaattgccga atattggctt 600 aaattcggca tcgacggttg gcgattagat gtcccatttg aaataaaaac tccgggtttt 660 tggcaggaat tccgcgatcg cactaaagcc atcaatcccg aagcatatat tgtgggcgaa 720 gtgtggggag attcccgcca gtggttggat ggaacgcaat ttgacggcgt aatgaattat 780 ttatttgctg ggccgacaat tgcttttgca gctggcgatc gcgtagtctt agaacaagtc 840 caaagccgcg actatcaacc ctacccaccc ttatttgctg ccgagtacgc caccaaaatc 900 caagaagtac tgcaacttta cccttgggaa attcagctaa ctcaactcaa tttgttagca 960 agtcacgata cagcccgatt gatgaccatt gcaggcggtg atatagcgag tgtagaatta 1020 tcgactttac tgttactcac ctttcccggt gcccccagca tttactatgg tgatgaagtc 1080 ggtttacctg gtggcataga tcccgactca aggcgtggct ttcctttaga ggctaactgg 1140 aatcaagaaa ttttcaatac tcatcgtcaa ttaattacca tccgccaaac atacccagcc 1200 ttgcgtacag gtgattacca agtcctctat gctcaagggc aactttatct ctttgcacga 1260 actttaggca cagaagaatt gataattgct ataaacgctg gcacaagttc ggcaaccgca 1320 aatgtagatg tggctagttt gcatactcaa cccaacaagc tgttatatgg tactgctgaa 1380 gctgagtgga atggtgaaga aggaactcag caattgtcat taactcttcc cgcacgcagt 1440 ggctgcatcc tggggactgg ggactag 1467 <210> 4 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amylopullulanase-derived Nos sp. <400> 4 Met Gln Ile Gln Thr Pro Asp Trp Val Lys His Ala Val Phe Tyr Gln 1 5 10 15 Ile Phe Pro Asp Arg Phe Ala Arg Ser Lys Gln Pro Arg Lys Arg Leu 20 25 30 Leu Gln Glu Ala Arg Trp Glu Asp Trp Asp Ser Met Pro Thr Leu Gln 35 40 45 Gly Tyr Lys Gly Gly Asp Leu Trp Gly Ile Met Glu Asp Leu Asp Tyr 50 55 60 Ile Gln Asn Leu Gly Ile Asn Ala Ile Tyr Phe Thr Pro Ile Phe Gln 65 70 75 80 Ser Ala Ser Asn His Arg Tyr His Thr His Asp Tyr Tyr Gln Val Asp 85 90 95 Pro Met Leu Gly Gly Asn Glu Ala Phe Lys Glu Leu Leu Asp Ala Ala 100 105 110 His Gln Arg Asn Ile Lys Val Val Leu Asp Gly Val Phe Asn His Ser 115 120 125 Ser Arg Gly Phe Phe Phe Phe His Asp Val Leu Glu Asn Gly Pro His 130 135 140 Ser Pro Trp Val Asn Trp Phe Lys Ile Glu Gly Trp Pro Leu Ser Pro 145 150 155 160 Tyr Asn Gly Glu Phe Pro Ala Asn Tyr Val Gly Trp Ala Gly Asn Arg 165 170 175 Ala Leu Pro Glu Phe Asn His Asp Asn Pro Glu Val Arg Glu Tyr Ile 180 185 190 Met Glu Ile Ala Glu Tyr Trp Leu Lys Phe Gly Ile Asp Gly Trp Arg 195 200 205 Leu Asp Val Pro Phe Glu Ile Lys Thr Pro Gly Phe Trp Gln Glu Phe 210 215 220 Arg Asp Arg Thr Lys Ala Ile Asn Pro Glu Ala Tyr Ile Val Gly Glu 225 230 235 240 Val Trp Gly Asp Ser Arg Gln Trp Leu Asp Gly Thr Gln Phe Asp Gly 245 250 255 Val Met Asn Tyr Leu Phe Ala Gly Pro Thr Ile Ala Phe Ala Ala Gly 260 265 270 Asp Arg Val Val Leu Glu Gln Val Gln Ser Arg Asp Tyr Gln Pro Tyr 275 280 285 Pro Pro Leu Phe Ala Ala Glu Tyr Ala Thr Lys Ile Gln Glu Val Leu 290 295 300 Gln Leu Tyr Pro Trp Glu Ile Gln Leu Thr Gln Leu Asn Leu Leu Ala 305 310 315 320 Ser His Asp Thr Ala Arg Leu Met Thr Ile Ala Gly Gly Asp Ile Ala 325 330 335 Ser Val Glu Leu Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Phe Pro Gly Ala Pro 340 345 350 Ser Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Val Gly Leu Pro Gly Gly Ile Asp Pro 355 360 365 Asp Ser Arg Arg Gly Phe Pro Leu Glu Ala Asn Trp Asn Gln Glu Ile 370 375 380 Phe Asn Thr His Arg Gln Leu Ile Thr Ile Arg Gln Thr Tyr Pro Ala 385 390 395 400 Leu Arg Thr Gly Asp Tyr Gln Val Leu Tyr Ala Gln Gly Gln Leu Tyr 405 410 415 Leu Phe Ala Arg Thr Leu Gly Thr Glu Glu Leu Ile Ile Ala Ile Asn 420 425 430 Ala Gly Thr Ser Ser Ala Thr Ala Asn Val Asp Val Ala Ser Leu His 435 440 445 Thr Gln Pro Asn Lys Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Glu Ala Glu Trp Asn 450 455 460 Gly Glu Glu Gly Thr Gln Gln Leu Ser Leu Thr Leu Pro Ala Arg Ser 465 470 475 480 Gly Cys Ile Leu Gly Thr Gly Asp 485

Claims (9)

  1. 노스탁속 균주(Nostoc sp.)에서 유래되고,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 아밀로플루란네이즈.
  2. 노스탁속 균주(Nostoc sp.)에서 유래되고,
    25 ℃ 및 pH 7의 조건에서 반응시켜, 글로코오스의 양을 정량하여 측정한 말토옥타오스의 Km/Kcat 값이 말토헵타오스의 Km/Kcat 값에 비하여 2.5 배 내지 3.5 배이고, 말토노나오스의 Km /Kcat 값이 말토옥타오스의 Km /Kcat 값의 55 배 내지 65배인 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 아밀로플루란네이즈.
  3. 노스탁속 균주(Nostoc sp.)에서 유래되고, 25 ℃ 및 pH 7의 조건에서 반응시켜, 글로코오스의 양을 정량하여 측정한 말토옥타오스의 Km /Kcat 값이 말토헵타오스의 Km /Kcat 값에 비하여 2.5 배 내지 3.5 배이고, 말토노나오스의 Km /Kcat 값이 말토옥타오스의 Km/Kcat 값의 55 배 내지 65배인 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 아밀로플루란네이즈를 생산하는 Escherichia coli (KCTC 11059BP).
  4. 녹말을 포함하는 기질에 노스탁속 균주(Nostoc sp.)에서 유래되고, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 아밀로플루란네이즈를 10℃ 내지 40℃ 및 pH 7.0 내지 pH 8.0의 조건에서 반응시켜 말토옥타오스를 포함하는 말토올리고당 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 말토올리고당은 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고, 말토헵타오스, 말토노나오스 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하는 것인 말토올리고당 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 말토올리고당은 말토옥타오스를 주성분으로 포함하고, 글루코오스 분자수 7 및 9 내지 11개인 말토올리고당으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 더욱 포함하는 것인 말토올리고당 제조방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 아밀로펙틴, 아밀로스, 가용성 녹말, 쌀 전분, 옥수수 전분, 감자 전분 및 밀 전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 수용액인 말토올리고당 제조방법.
  8. 제4항 내지 제6항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로플루란네이즈를 반응시키는 단계 전에, 상기 녹말을 포함하는 기질에 디브랜칭 효소를 반응시켜 녹말의 알파-1,6 글루코시드 결합을 가수분해하는 단계를 추가로 포함하는 것인 말토올리고당 제조방법.
  9. 제4항 내지 제6항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말토올리고당 제조방법은 상기 아밀로플루란네이즈를 반응시키는 단계 후에, 상기 아밀로플루란네이즈를 반응시켜 제조한 말토올리고당에 유기용매를 가하여 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 말토올리고당 제조방법.
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