JP5933321B2 - 新規なα−グルコシダーゼとその製造法並びに用途 - Google Patents
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Description
配糖体の収量が微量であるため、生産性に未だ問題がある。
<1> 下記理化学的性質を有するα−グルコシダーゼ:
(A)酵素活性
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン又はアンモニウムイオンから選ばれる1種又は2種以上のイオン10mmol/Lの存在下において、非存在下に対し、酵素活性が200%以上に活性化される。
(B)基質特異性
マルトース、pNPG、スクロースに作用しグルコースを遊離させるが、イソマルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、可溶性澱粉には実質的に作用しない。
<2> さらに下記理化学的性質を有する、<1>に記載のα−グルコシダーゼ:
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン又はアンモニウムイオンから選ばれる1種又は2種以上のイオン10mmol/Lの存在下において、非存在下に対し、酵素活性が300%以上に活性化される。
<3> さらに下記理化学的性質を有する、<1>又は<2>に記載のα−グルコシダーゼ。
(C)分子量
58000±2000(SDS−PAGEによる)
(D)pH安定性
4℃、24時間の保存において、すくなくともpH5.5〜9.5で安定である。
(E)至適pH
30℃、10分間の反応においてpH5.5〜8.5である。
(F)温度安定性
pH7.0、15分間の保存において、すくなくとも4℃〜40℃で安定である。
(G)至適温度
pH7.0、10分間の反応において15℃〜35℃であり、pH7.0、10分間、10mmol/Lアンモニウムイオン存在下の反応において15℃〜45℃である。
<4> ハロモナス(Halomonas)属細菌由来である、<1>〜<3>のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
<5> ハロモナス属細菌が、ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A8株、ハロモナス・エスピー A10株又はハロモナス・エスピー H11株である、<4>に記載のα−グルコシダーゼ。
<6> 下記のa)〜c)のいずれか1つに記載のタンパク質であるα−グルコシダーゼ:
a)配列表の配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質;
b)配列表の配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質;
c)配列表の配列番号2又は4に記載のタンパク質と60%以上のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
<7> 下記a)〜d)のいずれか1つに記載のDNA:
a)配列表の配列番号1又は3のヌクレオチド番号1〜1617に示されるヌクレオチド配列を含むDNA;
b)上記a)に記載のDNAと70%以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;c)上記a)に記載のDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;
d)配列表の配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
<8> ハロモナス属細菌を培養し、得られた培養物からα−グルコシダーゼを精製する工程を含む、<1>〜<6>のいずれかに記載のα−グルコシダーゼの製造方法。
<9> 糖受容体と糖供与体に、<1>〜<6>のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
<10> 糖供与体がマルトースである、<9>に記載の配糖体の製造方法。
<11> 糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物又はフェノール性水酸基を有する化合物である、<9>又は<10>に記載の配糖体の製造方法。
<12> 糖受容体が、グリセロール、エタノール、アスコルビン酸、1−プロパノール、2−プロパノール、L−メントール、プロピレングリコール又はハイドロキノンから選ばれる1種又は2種以上の化合物である、<9>〜<11>のいずれかに記載の配糖体の製造方法。
<13> ナトリウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン又はセシウムイオンから選ばれる1種類又は2種以上のα−グルコシダーゼ活性化剤存在下で酵素反応を行う、<9>〜<12>のいずれかに記載の配糖体の製造方法。
<14> α−グルコシダーゼ活性化剤の濃度が、0.001mmol/L〜100mmol/Lである、<13>記載の配糖体の製造方法。
<15> <1>〜<6>のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌。
<16> <1>〜<6>のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A8株(受託番号:NITE P−1096)。
<17> <1>〜<6>のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A10株(受託番号:NITE P−1097)。
<18> <1>〜<6>のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) H11株(受託番号:NITE P−1098)。
また、用語「実質的に生成しない」とは、酵素反応溶液の最終生成物において、生成産物が反応系内の固形分全体の5%以下であること、好ましくは3%以下であること、より好ましくは1%以下であることをいう。
本発明のα−グルコシダーゼは、下記理化学的性質を有するα−グルコシダーゼである。
(A)酵素活性
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン又はアンモニウムイオンから選ばれる1種又は2種以上のイオン10mmol/Lの存在下において、非存在下に対し、酵素活性が200%以上に活性化される。
(B)基質特異性
マルトース、pNPG、スクロースに作用しグルコースを遊離させるが、イソマルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、可溶性澱粉には実質的に作用しない。
本発明において、α−グルコシダーゼの酵素力価の測定は、例えば、0.2w/v%マ
ルトースを基質として、pH7、30℃、100μlの系で、特定量の酵素から生じたグルコース量を測定することにより行うことができる。
具体的には、例えば、上記系にて10分間の酵素反応後、2mol/LのTris−HCl(pH7)を200μl添加することにより酵素反応を終了させ、そこに、グルコーステストワコーC II(和光純薬製)を100μl添加し37℃で30分間インキュベートする。波長490nmの吸光度を測定することにより、生じたグルコース量を算出する。上記条件にて1分間に1μmolのマルトースを加水分解する酵素量を1Uと定義する。また、pNPGから生ずるp−ニトロフェノールの定量は、酵素反応溶液に炭酸ナトリウム溶液を添加して酵素反応を終了させ、波長405nmの吸光度を測定することにより行うことができる。
本発明のα−グルコシダーゼの具体例としては、例えば、以下の理化学的性質を有するものが挙げられる。
<作用> マルトースを加水分解しグルコースを生じる
<分子量> 58000±2000(SDS−PAGE)
<pH安定性> 4℃、24時間の保存において、すくなくともpH5.5〜9.5で安定(65%以上)
<至適pH> 30℃、10分間の反応において、pH5.5〜8.5
<最適温度> pH7、10分間の反応において、15〜35℃
pH7、10mmol/Lアンモニウムイオン、10分間の反応において、15〜45℃
<温度安定性> pH7、15分間の保存において、すくなくとも4〜40℃で安定である。
<基質特異性> 4mmol/Lのマルトース、イソマルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、1w/v%の可溶性澱粉および2mmol/LのpNPGを基質とし、pH7、30℃の条件で反応させたとき、マルトースに対する加水分解活性を100%としたときのpNPGおよびスクロース以外の基質に対する加水分解活性が10%以下である。すなわち、重合度3以上のα−グルカンおよびマルトース以外のグルコ二糖を実質的に基質としない。
<イオンによる活性化>
リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンおよびアンモニウムイオンにより選ばれる1種または2種以上のイオンにより酵素活性が活性化される。
<イオンによる活性化>
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンおよびアンモニウムイオンにより選ばれる1種または2種以上のイオン10mmol/Lの存在下において、非存在下に対し、200%以上、好ましくは200〜3500%、より好ましくは300〜3500%、さらに好ましくは300〜2000%、最も好ましくは300〜1500%に酵素活性が活性化される。
ルコシダーゼの活性化剤とすることができる。活性化剤の濃度は、本酵素が活性化される範囲で特に限定されず、0.001mol/L〜1000mmol/L、好ましくは0.01mol/L〜100mmol/Lのカチオンを添加して反応を行うことができる。また、配糖体の精製におけるイオン負荷ならびに資材コストを考慮すると、本酵素が十分に活性化される濃度2〜200mmol/Lが好ましく、より好ましくは5〜200mmol/Lであり、さらにより好ましくは10〜200mmol/Lである。
本発明のα−グルコシダーゼの一例として、例えば、配列表における配列番号2または配列番号4で示されるアミノ酸配列またはそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、マルトース、pNPG、スクロースに作用し、その他のα結合様式の二糖および重合度3以上のα−グルカンを実質的に基質とせず、特定一価カチオンにより、カチオン非存在下に対し、200%以上活性化されるという酵素活性を保持する範囲で、配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列において1個または数個(数個とは、通常、2〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜5個を示す)のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有するものや、配列表における配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列に対し、通常、60%以上、望ましくは70%以上、さらに望ましくは80%以上、よりさらに望ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ここで相同性とは、2つのアミノ酸配列をアラインメントしたときの全アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の割合(同一性)を示す。
本発明のDNAは、グルコース重合度2のα−1,4結合を有する糖に作用し、その他のα結合様式の二糖および重合度3以上のα−1,4結合のα−グルカンを実質的に基質とせず、特定一価カチオンにより、非存在下に対し、200%以上活性化されるという酵素活性を保持するα−グルコシダーゼをコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。
遺伝子DNAを得ることができる。すなわち、微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で半日至3日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞膜溶解酵素や超音波で処理することにより当該DNAを含む遺伝子DNAを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどのタンパク質分解酵素を併用したり、SDSなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの定法を適用すれば目的の遺伝子DNAが得られる。本発明のDNAを人為的に合成するには、例えば、当該遺伝子DNAを含むDNAを鋳型として、例えば、配列表における配列番号1又は3で示されるDNA配列に基づく適当なプライマーとなる化学合成DNAを用いてPCR合成することで、本発明のDNAを人為的に合成することができる。
また、配列表における配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列に基づいて、公知の遺伝子工学的手法により、化学合成することも有利に実施できる。
斯かるベクターの例としては、pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7などのプラスミドベクターやλgt・λC、λgt・λB、ρ11、φ1、
φ105などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のDNAを大腸菌で発現させるには、pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、λgt・λC及びλgt・λBが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1及びφ105が好適である。pHV14、TRp7、YEp7及びpBS7は、組換えDNAを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。
DNAを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、DNAを含む遺伝子DNAと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び/又は超音波により切断し、次に、生成したDNA断片とベクター断片とを連結する。遺伝子DNA及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけII型の制限酵素、詳細には、Sau 3AI、Eco RI、Hind III、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst Iなどを使用すれば、DNA断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でDNAリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えDNAは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
本発明のα−グルコシダーゼはその供給源によって制限されないものの、好ましい供給源として微生物が挙げられ、Halomonas属細菌、とりわけ、本発明者らが海洋より単離した微生物Halomonas sp.H11株、Halomoans sp.A8株またはHalomoans sp.A10株が好適に用いられる。以下、本発明におけるα−グルコシダーゼの産生能を有する微生物の同定結果を示す。なお、16S rRNA塩基配列解析、形態観察および生理・生化学試験の結果から帰属分類群を推定した。
培地 : マリンブロス2216(ベクトン・ディッキンソン製)
培養温度 : 30℃
培養時間 : 24時間
taとその生理および16S rRNA配列が若干異なっていた。よって、帰属種の特定が困難であった。以上より、A10株をHalomonas sp. A10株と命名した。
Halomonas sp. A10株は、平成23年5月2日付けで、受託番号NITE P−1097で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている。
Halomonas sp. H11株は、平成23年5月2日付けで、受託番号NITE P−1098で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている。
本発明のα−グルコシダーゼの製造方法は、本発明のα−グルコシダーゼ産生能を有する微生物、例えばハロモナス属細菌を培養し、得られた培養物からα−グルコシダーゼを精製する工程を含む、α−グルコシダーゼの製造方法である。
本発明のα−グルコシダーゼによる配糖体の製造方法は、糖受容体と糖供与体に、本発明のα−グルコシダーゼを作用させる工程を含む、配糖体の製造方法である。なお、糖受容体と糖供与体に本発明のα−グルコシダーゼを発現する微生物を作用させてもよい。
糖供与体としては、本発明のα−グルコシダーゼにより加水分解され、α−グルコースを生成するものであれば、いずれでもよい。より具体的には、前述の通り好ましくはマルトース、スクロースおよびpNPGが挙げられ、より好ましくはマルトースが挙げられる。
、反応条件を適宜選択すれば良い。反応に用いる緩衝液は特に制限されず、例えば、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、McIlvaine緩衝液等が挙げられ、適宜選択すればよい。
まず、0.5w/v%マルトース水溶液40μlと0.1mol/LのHEPES緩衝液(pH7)40μlを含む溶液に、酵素試料20μlを添加して、30℃で10分間酵素反応させた。この反応液に2mol/LのTris−HCl溶液(pH7)を添加して
反応を停止した。前記反応液に、グルコーステストワコーC II溶液(和光純薬製)を100μl添加し、37℃で30分間インキュベートし発色させた。このうち200μlを96ウェルマイクロプレートに移液し、マイクロプレートリーダー(『Model 680』Bio Rad社製)にて波長490nmの吸光度を測定することにより生じたグルコースを定量した。グルコースの標準曲線は、0〜0.01w/v%グルコース水溶液を用いて作成した。酵素単位1Uは、前記条件で、1分間に1μmolのマルトースを分解させる酵素量と定義した。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。
タンパク質の定量は、DC protein assay kit(Bio Rad社製)を使用して、添付のプロトコルに従って行った。タンパク質の標準曲線は0〜1mg/mlのbovine serum albumin(Bio Rad社製)を用いて作成した。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。
タンパク質の純度は、SDS−PAGE(Sodium dodecyl sulfate Poly−Acrylamide Gel Electrophoresis)により評価した。ポリアクリルアミドゲル(12.5%)は、アトー社製の商品名『e−PAGEL』を使用した。サイズマーカーはインビトロジェン社製の『Mark12 Unstained Standard』を使用した。電気泳動は、25mAの定電流で行った。タンパク質の染色は、関東化学社製の商品名『ラピッド CBB Kanto』を使用して、添付のプロトコルに従って行った。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。
可溶性澱粉(関東化学製)10g/L、酵母抽出物(商品名『ポリペプトン』、和光純薬製)5g/L、酵母抽出物(商品名『イーストエキストラクト』、ベクトン・ディッキンソン製)5g/L、塩化ナトリウム(和光純薬製)35g/L、リン酸二水素カリウム(関東化学製)1g/L、硫酸マグネシウム七水和物(関東化学製)0.2g/L、および水からなるpH7の液体培地2Lを5Lのバッフル付きフラスコに調製し、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し冷却した。
0mlに懸濁し、超音波破砕機(microsom(商標) ultrasonic cell disruptor)にて細胞を破砕した(出力:4ワット、全出力時間: 2
0分間)。細胞破砕液を遠心分離し(4℃,5,800xg,30分間)、回収した上清を菌体内粗酵素液とした。なお、全ての操作は氷上で行った。本粗酵素液について、タンパク質量とα−グルコシダーゼ活性を測定したところ、833mgのタンパク質、19.4Uの酵素活性が含まれており、比活性は0.023U/mgであった。
カラム : TOYOPEARL(登録商標) DEAE−650M(東ソー株式会社製)
カラムサイズ: φ15mm×170mm
ゲル量 : 30mL
溶出液 : 20mmol/L 酢酸ナトリウム(pH 5)
塩化ナトリウム濃度0mol/L〜0.5mol/Lのリニアグラジエント
流速 : 2mL/min
溶出液量 : 120mL
カラム : TOYOPEARL(登録商標) BUTHYL−650M(東ソー株式会社製)
カラムサイズ : φ15mm×200mm
ゲル量 : 35mL
溶出液 : 20mmol/L HEPES緩衝液(pH7)
硫酸アンモニウム濃度1.5mol/L〜0mol/Lのリニアグラジエント
流速 : 2mL/min
溶出液量 : 120mL
カラム : resource Q(GEヘルスケア社製)
カラムサイズ : φ6.4mm×30mm
ゲル量 : 1mL
溶出液 : 20mmol/L HEPES緩衝液(pH7)
塩化ナトリウム濃度0mmol/L〜1mol/Lのリニアグラジエント
流速 : 3mL/min
溶出液量 : 30mL
実施例1の方法で得た精製α−グルコシダーゼをSDS−PAGEに供し、サイズマーカーと比較して分子量を測定したところ、本発明のα−グルコシダーゼは分子量58,000±2000ダルトンであった(図1)。
実施例1の方法で得た精製α−グルコシダーゼを用いて、酵素活性および酵素安定性におよぼすpHの影響を調べた。本酵素の活性測定時に用いる反応緩衝液を40mmol/Lのブリトン・ロビンソン緩衝液(pH3〜12)に置き換えることにより、至適pHを求めた。最も高い活性を示したpHにおける活性を100(%)とし、各pHにおける相対活性を算出した。pH安定性は、10mmol/Lのブリトン・ロビンソン緩衝液(pH3〜12)および0.36mg/mlの精製酵素からなる溶液を4℃にて24時間インキュベートした後、活性測定を行った。最も高い活性を示したpHにおける活性を100(%)とし、各処理pHにおける残存活性(%)を算出した。
実施例1で得た精製α−グルコシダーゼを用いて至適温度および温度安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液を4〜60℃の各温度に15分間保持した後、活性測定を行うことにより求めた。最も高い活性を示した温度における活性を100(%)とし、各保管温度における残存活性(%)を算出した。至適温度は、4〜60℃の各温度で活性測定を行うことにより求めた。最も高い活性を示した温度における活性を100(%)とし、各温度における相対活性を算出した。
各基質溶液(4mmol/L)としてα−結合からなる各種グルコオリゴ糖(マルトース、イソマルトース(東京化成工業製)、トレハロース(日本食品化工製)、ニゲロース(和光純薬工業製)、コージビオース(和光純薬製)、マルトトリオース(日本食品化工製)、マルトテトラオース(生化学工業製)、マルトペンタオース(生化学工業製)およびマルトヘキサオース(生化学工業製))、スクロース(関東化学製)、メチル−α−D−グルコシド(田岡化学製)、pNPG(シグマ社製)及び可溶化澱粉(ナカライテスク製)を基質とし、酵素添加量0.72μgにて通常の活性測定法と同様に活性測定を行っ
た。ただし、可溶化澱粉に関しては基質濃度を1w/v%とし、pNPGに関しては基質濃度を2mmol/Lとし、1mol/Lの炭酸ナトリウム水溶液を反応容量の2倍量添加することにより反応を停止した。マイクロプレートリーダーにて波長405nmの吸光度を測定することにより遊離のp−ニトロフェノール濃度を求め、1分間に1μmolのpNPGを加水分解する活性を1Uとした。標準曲線の作成には、p−ニトロフェノール(和光純薬製)0〜0.2mmol/Lを使用した。
る分解活性を相対値(%)で示した。表3から明らかなように、本発明におけるα−グルコシダーゼは、イソマルトース、トレハロース、ニゲロース、コージビオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、メチルグルコシドおよび可溶性澱粉を実質的に加水分解しないことが判明した。
一方、スクロースに対して約33%、pNPGに対して約77%の相対活性を示した。
実施例1の方法で得た精製α−グルコシダーゼを用いて、酵素活性におよぼす各種イオンの影響を調べた。LiCl、NaCl、MgCl・6H2O、KCl、CaCl2、MnCl2・2H2O、FeCl2・4H2O、CoCl2・6H2O、CuCl、ZnCl2、R
bCl、AgNO2、CsClおよびNH4Clまたは(NH4)2SO4(全て関東化学製
)をカチオン濃度として200mmol/Lとなるよう純水に溶解し、各種カチオン水溶液を調製した。各種カチオン水溶液を酵素反応液中のカチオン濃度が10mmol/Lとなるよう添加し、pH7、30℃において酵素活性を測定した。カチオン無添加における酵素活性を100(%)とし、各種カチオン10mmol/L存在時の相対酵素活性(%)を算出した。結果を表4に示す。
i+およびNa+の存在下にて相対活性が上昇し、それぞれ592%、564%、503%、319%、151%および116%となった。反対に、Mg2+、Ca2+、Co2+およびZn2+においてはそれぞれ30、20、1および0%に低下した。以上より、本発明におけるα−グルコシダーゼは、一価のアルカリ金属イオンおよびアンモニウムイオンにより活性化されることが判明した。
実施例1の方法で得た精製α−グルコシダーゼを用いて、本酵素のN末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサーモデルProcise 492cLC(アプライドバイオシステムズ製)により解析したところ、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜20、すなわち、MQDNMMWWRGGVIYQIYPRSであることが判明した。
(ゲノムの調製)
実施例1で示した培地10mLに、Halomonas sp.H11株のグリセロールストックを接種し、37℃、150rpmで16時間培養した。培養液を1.5mL容エッペンドルフチューブに1mLずつ分注し遠心分離(4℃、14,000rpm、2分間)し上清を取り除いた。5mg/mLのリゾチーム(生化学工業製)、TE(pH8)溶液をチューブ1本当たり350μL添加し、37℃にて1時間保持した。10%SDS溶液を50μL添加し転倒混和し37℃にて30分間保持した。TE飽和フェノールを400μL添加し穏やかに転倒混和した後遠心分離(室温、14,000rpm、5分間)した。上層を新たなエッペンドルフチューブに移した後、フェノールクロロホルム溶液を400μL添加し穏やかに転倒混和し、上記と同様に遠心分離した。それぞれの上層を一つのエッペンドルフチューブに移し、3mol/L酢酸ナトリウム水溶液および95(v/v%)冷エタノールを、それぞれ溶液の1/10容量および2倍容量添加し遠心分離(4℃、14,000rpm、15分間)した。得られた沈殿物を70%エタノールにてリンス洗浄し風乾した。0.2mg/mlのRNase/TE溶液を400μL添加し、35℃にて30分間保持した。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿法を上記と同様に行い、乾燥させた沈殿物をTE100μLに溶解し、ゲノム溶液とした。
実施例7において示された本発明のα−グルコシダーゼにおけるN末端アミノ酸配列に基づき、第1から8番目のアミノ酸残基に対応する、5´−ATGCARGAYAAYATGATGTGGTGG−3´(以下、「PFG−F1A−8G」と表記する)(配列番号5)、および第5番目から11番目のアミノ酸に対応する5´−ATGATGTGGTGGCGNGGNGG−3´(以下、「PFG−5A−11G(CGN)」と表記する)(配列番号6)で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。なお、塩基配列におけるNはA,T,G,Cの混合塩基を示す。以下同じ。
Takara LA PCRTM in vitro Cloning Kit(タカラバイオ製)を使用し、遺伝子配列を決定した。前記で調製したゲノムを、SalIおよびPstI(いずれもタカラバイオ製)で処理し、キット付属のカセットDNAに連結させた。
2(東洋紡製)またはEx Taq(タカラバイオ製)を用いたこと以外は添付説明書に従い行った。2nd PCRでは、各1st PCRの反応液を水で10倍希釈したもの1μLを鋳型とし、プライマーとしてそれぞれPFG−5A−11G(CGN)とcassette primer C2sのセット、PFG−F´2とcassette primer C2sのセット、およびPFG−R´2とcassette primer
C2sのセットを使用した。この際、DNAポリメラーゼとしてEx Taqを使用したこと以外は添付説明書に従った。
M T easy vector』)に連結させた。上記ライゲーション反応液で通常のコンピテントセルDH5αをヒートショック法により形質転換した。それを50μg/mlアンピシリン、0.1mmol/L IPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)および2μg/mL X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドシル−β−D−ガラクトシド)を含むLBプレートに塗布し37℃で静置培養した。得られた白色コロニーを無作為につまようじで一掻きし、減菌水30μLに懸濁し、そのうち1μLをコロニーPCRの鋳型とした。コロニーPCRは、表4に示したプライマーpGEM−up−FおよびpGEM−dn−Rのセットを使用し、DNAポリメラーゼとしてEx Taqを使用し20μLの系で行った。94℃に2分間保持し、94℃に30秒間、55℃に30秒間、72℃に2分間からなるプログラムを30回繰り返し、最後に72℃に3分間保持した。増幅バンドが認められたものに関してPCR反応液を上記と同様にGFXにて精製した。
これを鋳型として表5に示したシーケンシング用プライマー(PFG−F´3〜F´6、PFG−R´1、R´3)で適宜シーケンス反応させ配列解析に供した。シーケンス反応はDTCS with Quick Start Kit(ベックマン・コールター製)を用い、操作は添付のプロトコルに従った。
配列(配列番号2の4〜20番目のアミノ酸配列)であるMMWWRGGVIYQIYPRSと一致した。このことから、本塩基配列が、本発明のα−グルコシダーゼに対応する遺伝子の一部であることが明らかとなった。その塩基配列を基に、表5に示すオリゴヌクレオチドPFG−F´1、PFR−F´2、PFG−F´3、PFG−R´1、PFR−R´2およびPFG−R´3を合成した。
C1sのセットおよびPFG−R´3とcassette primer C1sのセットで1st PCRを行った。そのPCR産物を鋳型として、それぞれPFG−F´2とcassette primer C2sのセットおよびPFG−R´2とcassette primer C2sのセットで2nd PCRを行ったところ、それぞれ約2.5kbpおよび約1.5kbpの増幅断片が認められた。上記方法に従い、これらのDNA断片のシーケンス解析を行ったところ、本発明におけるα−グルコシダーゼ遺伝子のDNA配列は、配列番号1に示す配列であることが明らかとなった。配列番号1に示すDNA配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号2に示す配列である。
実施例8で調製したHalomonas sp. H11株のゲノムDNAを鋳型として、表6に記載のクローニング用オリゴヌクレオチド、PFG−F−NdeIおよびPFG−R−XhoIを用いてα−グルコシダーゼをクローニングした。すなわち、鋳型100ng、10×KOD ver.2 buffer 5μL、2mmol/L dNTPs 5μL、25mmol/L MgSO4 3μL、20mmol/Lのプライマー溶液
各1mL、KOD plus polymerase 1μLを混合し、水で50μLにメスアップした。PCR条件は以下の通りである。94℃に2分間保持した後、94℃に30秒間、55℃に30秒間、72℃に2分間からなるサイクルを30回繰り返し、最後に72℃に3分間保持した。このうち4μlを電気泳動に供し、約1.5 kbの増幅断
片を確認した。当該断片をGFXにて精製した。これを、NdeIおよびXhoI(いずれもタカラバイオ製)で酵素処理し、GFXにて精製した。本DNA断片を、上記と同様にNdeIおよびXhoIで制限酵素処理したpET22b(ノバジェン製)に、通常のライゲーション反応にて連結させ発現用プラスミドを作製した。プラスミドの調製には、DH5αを使用し、表6に示したシーケンス解析用オリゴヌクレオチドにてクローニングが正しく行われていることを確認した。以上のようにして作製したプラスミドを『pET22b−PFG』と命名した。
上記pET22b−PFGで、BL21(DE3) Codon Plus RIL(ノバジェン製)を形質転換した。
50μg/mlアンピシリンを含むLB培地3mLに、上記形質転換体を接種し、37℃で一晩前培養した。このうち1mLを600mLの同培地に接種し、37℃で3時間培養した。それを氷冷し、0.1mol/LのIPTGを600μL添加した。これを16℃で24時間回転振盪培養した。得られた培養物を、定法に従い、遠心分離して菌体を回収した。菌体を20mmol/L HEPES(pH7)約40mLに懸濁して、実施例1に示した方法にて超音波破砕した。これを遠心分離した上清を粗酵素液とした。
20w/v%マルトース、20w/v%グリセロール、5mmol/L硫酸アンモニウムおよび20mmol/L HEPES緩衝液(pH7)を含む溶液において、α−グル
コシダーゼ活性として1.5U/gマルトースとなるように、実施例1の方法にて調製した粗酵素液を添加し反応液量1mLとした。40℃にてインキュベートし、2週間後にサンプリングした。また、対照として、特許文献4(特開平11−222496号公報)に記載された方法に準じてAspergellus niger由来のα−グルコシダーゼを用いた反応を行った。すなわち、30w/v%マルトース、30w/v%グリセロール、20mmol/L酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)を含む溶液に2.5U/gマルトースとなるようにトランスグルコシダーゼアマノ(アマノエンザイム製、以下、「TGアマノ」と表記することがある)を添加し40℃にて2週間反応させた。各反応溶液を熱失活させ、5w/v%程度に希釈し、イオン交換樹脂(アンバーライト MB4、オルガノ製)により脱塩、フィルター(Millex HP φ13mm、膜孔0.45μm、ミリポア製)でろ過した後、以下のHPLC条件にて測定した。なお、得られたHPLCピーク面積比をそのサンプル中の固形分重量比とみなした。
カラム : Ultron PS−80N.L (φ8.0×500 mm)、信和化工製
溶媒 : 純水
流速 : 0.9 ml/min
カラム温度 : 50℃
注入量 : 10μL
検出器 : 示差屈折計
リセロール:(2S)−1−O−α−D−グルコシルグリセロールは10:52:38であった。
度化の実験結果から、これらの重合度2のオリゴ糖(G2)およびG3には分岐糖(イソマルトース、パノースおよびイソマルトトリオース)が含まれていることが示唆された。
配糖体がより容易に高純度化可能であることがわかった。それぞれのその他に占める成分は、酵素溶液および酵母由来の高分子であった。
、上記のような分離手段を用いれば容易に目的配糖体と分離可能である。したがって、本実施例に示したような、グルコシルグリセロールの製造においては、グリセロールを含む画分を回収して、糖転移反応の受容体として繰り返し使用することが可能である。
各種α−グルコシダーゼによるグリセロールの配糖化能を比較した。20w/v%マルトース、20w/v%グリセロール、0または5mmol/L硫酸アンモニウム(硫安)および40mmol/L HEPES緩衝液(pH7)を含む溶液において、α−グルコ
シダーゼ活性として1U/gマルトースとなるように、実施例10の方法にて調製した精製組換え酵素(精製rPfG)を添加し反応液量1mLとした。対照として、トランスグルコシダーゼアマノおよびテイスターゼの反応では上記と同様の基質濃度、0mmol/L硫酸アンモニウムおよび40mmol/Lの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)とし、アクレオニウム・エスピー(Acremonium sp.)由来のα−グルコシダーゼ(テイスターゼ、キリン製)の反応では緩衝液をHEPES(pH7)としたこと以外は上記と同様である。これらを40℃にてインキュベートし、実施例11と同様にHPLC条件で糖組成を分析した。
20w/v%マルトース、10v/v%エタノール、5mmol/L硫酸アンモニウムおよび20mmol/L HEPES緩衝液(pH7)を含む溶液において、α−グルコ
シダーゼ活性として1.0U/gマルトースとなるように、実施例10の方法にて調製した精製rPfGを添加し、純水で反応液量1mLとした。40℃にてインキュベートし、1週間後にサンプリングした。また、対照として、特許文献5(特開2002−1739
5号公報)に記載された方法に準じてAspergellus niger由来のα−グルコシダーゼを用いた反応を行った。すなわち、上記と同様のマルトースおよびエタノール濃度で、20mmol/L酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)を含む溶液に1.0U/g
マルトースとなるようにトランスグルコシダーゼアマノ(アマノエンザイム製)を添加し40℃にてインキュベートした。上記と同様に、1週間後にサンプリングした。各反応溶
液を熱失活させ、水で10倍希釈し、イオン交換樹脂(アンバーライト MB4、オルガノ製)により脱塩、フィルター(Millex HP φ13mm、膜孔0.45μm、ミリポア製)でろ過した後、以下のHPLC条件にて分析した。標品として1w/v%のエチル−α−D−グルコシド(和光純薬製、以下、「エチルグルコシド」と表記する)を同様に分析した。
カラム : Aminex HPX−42A (φ7.8×300 mm)、Bio−Rad製
溶媒 : 純水
流速 : 0.5ml/min
カラム温度 : 75℃
注入量 : 10μL
検出器 : 示差屈折計
一方、トランスグルコシダーゼアマノによる本実施列の対照実験においては、エチルグルコシドのピークは目視において認められたものの、機器の検出限界以下であった。また、G2およびG3(面積(%))は、それぞれ26.8%および29.8%と高かった。
れるようなグルコースオキシダーゼによりG1を除去し、エタノールを適当な蒸留装置により除去することにより、エチルグルコシドをより高純度化可能であることが期待できる。この際、エタノールを含む成分を冷却し回収すれば、それをリサイクルすることが可能である。
各種α−グルコシダーゼによるエタノールの配糖化能を比較した。20w/v%マルトース、10v/v%エタノール、0または5mmol/L硫酸アンモニウムおよび40mmol/L HEPES緩衝液(pH7)を含む溶液において、α−グルコシダーゼ活性
として1U/gマルトースとなるように、実施例10の方法にて調製した精製rPfGを添加し反応液量1mLとした。対照として、トランスグルコシダーゼアマノおよびテイスターゼの反応では上記と同様の基質濃度、0mmol/L硫酸アンモニウムおよび40mmol/Lの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)とし、Acremonium sp.由来のα−グルコシダーゼ(テイスターゼ、キリン製)の反応では緩衝液をHEPES(pH7)としたこと以外は上記と同様である。これらを40℃にてインキュベートし、実施例13と同様にHPLC条件で糖組成を分析した。
48時間後の糖組成を表12に示す。表中の数値はHPLC分析における面積(%)を表し、−は検出限界以下であることを表す。
本発明におけるα−グルコシダーゼが、ハイドロキノン、L−メントール、プロピレングリコール、1−プロパノール、2−プロパノールおよびアスコルビン酸に対して糖転移可能か否かを調べた。すなわち、上記各受容体1〜5w/v%、マルトース10w/v%
、50mmol/L HEPES緩衝液(pH7)および5mmol/L硫酸アンモニウムの系に、実施例10で精製したrPfGを1U/gマルトースとなるよう添加した。コントロールとして、酵素の代わりに水を添加したものを調製した。30〜40℃にて24〜72時間反応させ、アスコルビン酸以外の生成物に関してはTLCにて確認した。TLCは、ハイドロキノンの反応液には1−ブタノール:エタノール:水=5:3:2(v/v)、L−メントールの反応液にはクロロホルム:メタノール:水=6:4:1(v/v)、その他の反応液には1−ブタノール:2−プロパノール:水=2:2:1(v/v)を展開溶媒として使用した。10w/v%硫酸/メタノール溶液を噴霧しオーブンで加熱することにより、糖組成を確認した。アスコルビン酸の生成物は以下のHPLC条件において確認した。
カラム : Wakopak−WT−B−30 (φ10mm×300 mm)、和光純薬製
溶媒 : 70ppm硝酸/水
流速 : 0.5ml/min
カラム温度 : 30℃
検出器 : 示差屈折計およびUV検出器(検出波長238nm)
実施例1と同様の方法にて、Halomonas sp.A8株からα−グルコシダーゼを精製し、実施例7と同様の方法にて精製酵素のN末端アミノ酸配列を決定したところ、Halomonas sp.H11株と同様の配列、すなわち、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜20、MQDNMMWWRGGVIYQIYPRSであることが判明した。そこで、さらに、実施例8と同様の方法により、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子配列を同定したところ、配列表の配列番号3に示すDNA配列であることが明らかとなった。配列番号3に示すDNA配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号4に示す配列である。
実施例9の方法と同様に組換え酵素を大腸菌により調製し、精製した。以後、本精製酵素を用いて、Halomonas sp. A8株のα−グルコシダーゼの諸性質を調べた。
至適温度は、カチオン無添加においては15〜30℃であり(図10:白丸(○))、5mmol/L硫酸アンモニウム存在下においては15〜35℃であった(図11:白三角(△))。また、40℃以下で安定であった(図10:白三角(△))。
Claims (15)
- 下記のa)〜c)のいずれか1つに記載のタンパク質であるα−グルコシダーゼ:a)配列表の配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質;b)配列表の配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質;c)配列表の配列番号2又は4に記載のタンパク質と90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
- ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A8株又はハロモナス・エスピー H11株であるハロモナス(Halomonas)属細菌由来である、請求項1に記載のα−グルコシダーゼ。
- 下記a)〜c)のいずれか1つに記載のDNA:a)配列表の配列番号1又は3のヌクレオチド番号1〜1617に示されるヌクレオチド配列を含むDNA;b)上記a)に記載のDNAと90%以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;c)配列表の配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
- ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A8株又はハロモナス・エスピー H11株であるハロモナス(Halomonas)属細菌由来である、請求項3に記載のDNA。
- ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A8株、ハロモナス・エスピー A10株又はハロモナス・エスピー H11株であるハロモナス属細菌を培養し、得られた培養物からα−グルコシダーゼを精製する工程を含む、α−グルコシダーゼの製造方法。
- 糖受容体と糖供与体に、請求項1又は2に記載のα−グルコシダーゼを作用させる工程
を含む、配糖体の製造方法。 - 糖供与体がマルトースである、請求項6に記載の配糖体の製造方法。
- 糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物又はフェノール性水酸基を有する化合物である、請求項6又は7に記載の配糖体の製造方法。
- 糖受容体が、グリセロール、エタノール、アスコルビン酸、1−プロパノール、2−プロパノール、L−メントール、プロピレングリコール又はハイドロキノンから選ばれる1種又は2種以上の化合物である、請求項6〜8のいずれか1項に記載の配糖体の製造方法。
- ナトリウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン又はセシウムイオンから選ばれる1種類又は2種以上のα−グルコシダーゼ活性化剤存在下で酵素反応を行う、請求項6〜9のいずれか1項に記載の配糖体の製造方法。
- α−グルコシダーゼ活性化剤の濃度が、0.001mmol/L〜1000mmol/Lである、請求項10に記載の配糖体の製造方法。
- 糖受容体と糖供与体に、ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A10株由来のα−グルコシダーゼを作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
- ハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A8株(受託番号:NITE P−1096)。
- ハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) A10株(受託番号:NITE P−1097)。
- ハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.) H11株(受託番号:NITE P−1098)。
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