WO1998038315A1 - GENE CODANT LA β-GALACTOSIDE α-2,6-SIALYLTRANSFERASE - Google Patents

GENE CODANT LA β-GALACTOSIDE α-2,6-SIALYLTRANSFERASE Download PDF

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WO1998038315A1
WO1998038315A1 PCT/JP1998/000850 JP9800850W WO9838315A1 WO 1998038315 A1 WO1998038315 A1 WO 1998038315A1 JP 9800850 W JP9800850 W JP 9800850W WO 9838315 A1 WO9838315 A1 WO 9838315A1
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WO
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sequence
gene
dna
protein
sialyltransferase
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Application number
PCT/JP1998/000850
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Yamamoto
Motoko Nakashizuka
Ichiro Terada
Original Assignee
Japan Tobacco Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)

Definitions

  • the present invention relates to a novel gene encoding / 3-galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase.
  • the invention further relates to genes encoding novel signal peptides.
  • glycoconjugates such as glycoproteins and glycolipids in animal cells have been revealed one after another, and the importance of sugar chains in glycoconjugates has been recognized.
  • Sialic acid is often present at the non-reducing end of the sugar chain of glycoconjugates, but this sialic acid is important given the importance of the physiological functions and biological consciousness of the sugar chain. It is thought that it has many functions.
  • its chemical synthesis especially the reaction of adding sialic acid to oligosaccharides and complex carbohydrate sugar chains, is difficult, so the method is very simple and high yield without side reactions.
  • An enzymatic method that enables synthesis at a high rate has attracted attention.
  • sialyltransferase is an enzyme obtained from organs such as the submandibular gland and liver of animals such as rat, bushu, and human (Poulson et al. J. Biol. Chem. 252 , 2356-2362 (1977), Weinste et al. J. Biol. Chem. 257_, 13835-13844 (1982), Miyagi et al. Eur. J. Biochem. 126 253-261 (1982)). Enzymes derived from these animals are very expensive because they are difficult to purify and cannot be obtained in large quantities, and have the problem of poor stability as enzymes.
  • the present inventors first searched for a bacterium having sialyltransferase activity for the purpose of developing a sialyltransferase that can be supplied in large quantities.
  • the marine bacterium Photobacterium having the desired activity was obtained.
  • Photo damter sera Photobacterium damsel a
  • JTO1660 JT0160
  • sialyltransferase 0160 produced by JT0160 hereinafter referred to as "ST0160”
  • ST0160 sialyltransferase 0160 produced by JT0160
  • An object of the present invention is to provide a novel gene encoding / 3-galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector for -galactoside ⁇ 2,6-sialyltransferase protein comprising the gene.
  • the present invention further provides recombinant / 3-galactosid ⁇ 2 using the expression vector. , 6-Sialyltransferase protein production method.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant / 3-galactoside 2,6-sialyltransferase protein produced by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding a novel signal peptide.
  • FIG. 1 shows the structure of pAQI.
  • FIG. 2 shows the structure of pAQN.
  • FIG. 3 shows the construction steps from p AQN to p AQN-EHX.
  • FIG. 4 shows the construction steps from pBSTC to pEBSTC.
  • FIG. 5 shows the construction steps from pBSTN to pEBST.
  • FIG. 6 shows the structure of the expression vector pEBST.
  • FIG. 7 shows the first half of the base sequence of the b st gene together with the deduced amino acid sequence.
  • FIG. 8 shows the latter half of the base sequence of the b st gene together with the deduced amino acid sequence.
  • FIG. 9 shows the growth of the E. coli MV1184 transformant (A2, B2, C2) containing the expression vector of the present invention.
  • Figure 10 shows the enzyme reaction using CMP-NeuAc as a sugar donor substrate to confirm that the crude enzymes obtained from the six transformants in Example 211 (2) have the same activity as ST0160.
  • 3 shows the retention time of the reaction product when the reaction was performed.
  • the present inventors have worked diligently and as a result, by using Nutriens Broth (manufactured by Oxoid) instead of marine broth 2216 (manufactured by Defico) as a growth medium for JTO160, We succeeded in extracting gene DNA from J TO 160 for the first time. Furthermore, an attempt was made to isolate a gene encoding the STO160 protein (hereinafter referred to as “bst gene”) from the DNA thus extracted. Although the ST0160 protein had various difficulties such as being considered to be toxic to general host cells, it was finally successfully isolated. . As a result of determining the nucleotide sequence of the gene and estimating the amino acid sequence, it was found that the ST0160 protein had the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described later.
  • the present inventors have further made an expression vector containing the obtained gene, and made it possible to express the recombinant ST0160 protein.
  • 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase refers to sialic acid from cytidine monophosphate-sialic acid, a galactose residue in a complex carbohydrate sugar chain or a free sugar chain.
  • the optimal ⁇ of this enzyme is in the range of 5-6, the optimal temperature is 30 and the molecular weight is 64,000 soil 5,000 according to the gel filtration method.
  • the monosaccharide capable of forming a glycoconjugate and having a hydroxyl group at the carbon at the 6-position means, for example, galactosamine, mannose, peracetylgalactosamine mannose and the like.
  • the / 3-galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase encoded by the gene of the present invention was found in Photobacterium damsela J TO160. However, the same enzymes have been found to be present in Photopacterium damcella ATCC 33359 and Photobacterium damcella ATCC 35083. It is expected that other microorganisms and organisms will exist.
  • the nucleotide sequence of the bst gene determined according to the present invention is shown in SEQ ID NO: 2 and the deduced amino acid sequence encoded by it in FIGS.
  • the gene DNA consists of 2028 base pairs in total from base numbers 1 to 2028.
  • Nucleotide numbers 1 to 3 correspond to the translation initiation genetic code
  • nucleotide numbers 2026 to 2028 correspond to the translation termination genetic code.
  • the sequence (*) of base numbers 2026 to 2028 is TAA, but may be TGA or TAG. Sa
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acids of the STO 160 protein.
  • the ST0160 protein is composed of a total of 675 amino acid residues, including a signal sequence consisting of 15 amino acid residues (1-15 of SEQ ID NO: 1) and an extracellular region (16-498 of SEQ ID NO: 1). You.
  • the molecular weight of the protein having the amino acid sequence deduced from the b st gene is 76.5 kDa, and the molecular weight excluding the signal sequence is 74.8 kDa. Since the molecular weight of the completely purified ST0160 protein on SDS electrophoresis is about 61 kDa (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the STO160 protein is processed to become an active form, Alternatively, it is considered that the protease is affected by protease in the cells during purification.
  • the C-terminal region of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (497-6675 of SEQ ID NO: 1) has a very high homology of 60% or more with the E. coli phosphate transport system control protein. It is presumed that there are two long ⁇ -helical structures with a short turn structure in the middle between 539 residues and 594 residues in this region. Normally, the ⁇ -helix constitutes one unit with 18 amino acid residues, but in the case of the STO 160 protein, all four amino acid residues constituting one face are composed of highly hydrophobic amino acids.
  • the ⁇ -helix continues for two units, and a region where highly hydrophobic amino acid residues are biased exists on the C-terminal side. No region other than this region and the signal sequence region present at the ⁇ end is likely to be bound to the membrane, and therefore, this portion is presumed to be the membrane-bound region of STO160. At present, it is thought that the membrane-bound region of cloned animal-derived sialyltransferase is a transmembrane region located on the N-terminal side. It is thought to be completely different from that of sialyltransferase.
  • the present invention relates to the membrane-bound region and / or signal of STO 160. It is clear that proteins from which at least part of the null sequence region has been deleted also have enzymatic activity, and such proteins, including the gene encoding them, are within the scope of the present invention. In particular, / 3-galactosidase ⁇ 2,6-sialyltransferase which has been made soluble by removing the membrane-bound region of the ST0160 protein is a preferred embodiment of the present invention and will be described in detail later.
  • the gene of the present invention can be obtained, for example, from a gene library prepared using genomic DNA of JTO160 cultured in eutrient broth (manufactured by Oxoid), for example, from a plaque hybridizer. It can also be obtained by using the licensing method. Alternatively, it can be easily prepared by a PCR method using a gene library derived from a microorganism or the like as a ⁇ type based on the DNA base sequence determined by the present invention. The i3-galactosid ⁇ 2,6 monosialyltransferase gene thus prepared can also be prepared in a mutant by the method described below.
  • any DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an enzyme active portion thereof is included in the scope of the present invention.
  • a variant may include conservatively substituted sequences, meaning that a particular amino acid residue may be replaced by a residue having similar physicochemical characteristics. I have.
  • conservative substitutions include substitutions between aliphatic group-containing amino acid residues, such as Ie, Va1, 611 or 81a mutual substitution, or Lys and A Substitutions between polar group-containing amino acid residues such as between rg are included.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the enzyme-active portion thereof is modified as described above and has the biological activity of J3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase.
  • Mutants of the tosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase are also within the scope of the present invention.
  • DN ⁇ encoding the mutant protein is also included in the scope of the present invention.
  • Mutants resulting from the addition, deletion or substitution of amino acids can be used, for example, in the DNA encoding the same, for example, by site-directed mutagenesis, which is well known in the art (eg, Nucleic Acid Research, Vol. -6500, 1982).
  • the term "one or more amino acids” refers to a number of amino acids that can be added, deleted or substituted by site-directed mutagenesis.
  • Site-directed mutagenesis is performed, for example, using a synthetic oligonucleotide primer that is complementary to the single-stranded phage DNA to be mutated, except for the specific mismatch that is the desired mutation, as follows: be able to. That is, a strand complementary to a phage is synthesized using the above-mentioned synthetic oligonucleotide as a primer, and a host cell is transformed with the obtained double-stranded DNA. The transformed bacterial culture is plated on agar and plaques are formed from single cells containing the phage. Then, theoretically, 50% of the new colonies contain the phage having the mutation as a single strand, and the remaining 50% have the original sequence.
  • substitution, deletion or insertion of one or more amino acids that do not cause loss of the activity in the amino acid sequence of a biologically active peptide such as an enzyme in addition to the above-described site-directed mutagenesis,
  • Other methods include treatment with a mutagen and selective cleavage of the gene, followed by removal, addition or substitution of the selected nucleotide, followed by ligation.
  • nucleotide sequences that fall within the scope of the present invention include, under mild or severe stringency conditions, the 3 / 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialic acid transferase nucleotide sequence disclosed herein. Also included are isolated DNA and RNA encoding hybridized and biologically active i3-galactoside-a2,6-sialyltransferases. Conditions for mild stringency hybridization are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 1. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Note the conditions described in To taste.
  • Mild stringency conditions included a pre-cleaning solution of 5XSSC, 0.5% SDS, 1. OmMEDTA (pH 8.0) and approximately 55,5 XS SC, —Includes the use of evening hybridization conditions. Harsh stringency conditions include higher temperature hybridizations and washes. At that time, the temperature and the salt concentration of the washing solution are appropriately adjusted according to various factors such as the length of the probe. Preferably, conditions in the range of 5 XS SC or less and 20 or more are preferred.
  • the present invention provides an expression vector containing a gene encoding J3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase, and culturing host cells containing these expression vectors under conditions suitable for expression of the gene.
  • the present invention also provides a method for producing a recombinant 3-galactosidio 2,6-sialyltransferase protein by recovering the expressed recombinant protein.
  • 3-galactoside ⁇ 2,6-sialyltransferase protein of the present invention a mammal, a microorganism, a virus, or an expression vector selected according to a host cell to be used is used. Insert a gene sequence of / 3-galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase linked to an appropriate transcription or translation regulatory nucleotide sequence derived from an insect gene or the like.
  • regulatory sequences include a transcriptional promoter, an operator or enhancer, an mRNA ribosome binding site, and appropriate sequences that control the initiation and termination of transcription and translation.
  • Suitable host cells for expression of 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein include prokaryotic cells, yeast or higher eukaryotic cells.
  • Suitable cloning and expression vectors for use in bacterial, fungal, yeast, and mammalian cell hosts are described, for example, in Pouwels II, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985).
  • Prokaryotes include gram negative or gram positive bacteria, for example, E. coli or Bacillus subtilis.
  • E. coli gram negative or gram positive bacteria
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis.
  • the / 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein is used to facilitate expression of the recombinant polypeptide in prokaryotic cells. It may include a terminal methionine residue. This The N-terminal Met of E. coli can be cleaved from recombinant / 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein after expression.
  • Expression vectors used in prokaryotic host cells generally contain one or more phenotypic selectable marker genes.
  • a phenotype selectable marker gene is, for example, a gene that confers antibiotic resistance or auxotrophy.
  • suitable expression vectors for prokaryotic host cells include commercially available plasmids such as pBR322 (ATCC 370 17) or those derived therefrom. Since pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, it is easy to identify transformed cells. The appropriate promoter and the DNA sequence of the) 3-galactosido 2,6-sialyltransferase gene are inserted into this pBR322 vector.
  • Other commercially available vectors include, for example, PKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA).
  • Promoter sequences commonly used in expression vectors for prokaryotic host cells include the tac promoter,; 3-lactamase ( ⁇ nicillinase), lac! ⁇ Promoters (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979). Particularly useful prokaryotic host cell expression system, phage AP L promoter - used evening first and c I 8 57 ts thermolabile repressor one sequence.
  • Plasmid vectors available from the American Type 'Culture Collection that incorporate derivatives of the ⁇ ⁇ _ promoter include plasmid PHUB2 (located in E. coli strain J ⁇ B9 (ATCC 37092)) and pPL c28 (E. coli). RPI (located in ATCC 53082).
  • the present inventors have also found that the presence of the tac promoter at a position slightly away from the translation initiation codon of the bst gene (eg, several bases) weakens the control of expression.
  • the distance between the promoter and the translation start codon can be appropriately changed by conventional means.
  • the recombinant) 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein may be expressed in an yeast host cell.
  • Saccharomyces eg, S. cerepiche
  • yeast vector contains a replication origin sequence from two yeast plasmids, an autonomously replicating sequence (ARS), a promoter region, a sequence for polyadenylation, a sequence for termination of transcription, and a selectable marker gene. Often do.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • yeast ⁇ -factor leader sequence secretion of recombinant 31-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein can also be carried out.
  • Other leader sequences suitable for promoting secretion of recombinant polypeptides from yeast hosts are also known. Methods for transforming yeast are described, for example, in Hinnen et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978.
  • Mammalian or insect host cell culture systems can also be used to express recombinant / 3-galactoside- ⁇ 2,61-sialyltransferase protein.
  • Cell lines of mammalian origin can also be used.
  • Transcription and translation control sequences for mammalian host cell expression vectors can be obtained from the viral genome. Commonly used promoter and enhancer sequences are derived from poliovirus, adenovirus 2 and the like.
  • promoter and enhancer sequences are derived from poliovirus, adenovirus 2 and the like.
  • expression of structural gene sequences in mammalian host cells using SV40 viral genomes e.g., DN ⁇ sequences derived from SV40 origin, early and late promoters, enhancers, splice sites, and polyadenylation sites May be provided.
  • Expression vectors for use in mammalian host cells can be constructed, for example, according to the method of Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol
  • One method of producing the / 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein of the present invention is to use the / 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein. This involves culturing a host cell transformed with the expression vector containing the encoding DNA sequence under conditions in which the protein is expressed. Next, depending on the expression system used, the / 3-galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase protein is recovered from the culture medium or cell extract.
  • the present invention provides a soluble / 3-galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase protein and a gene encoding the protein.
  • Soluble] 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein contains all or part of the extracellular domain of the natural / 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein, It lacks a membrane-bound region that allows the polypeptide to remain on the cell membrane.
  • a part or all of the amino acid residue 4999-675 can be deleted to make it soluble.
  • the soluble] 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein may contain a naturally occurring or heterologous signal peptide to promote secretion initially when synthesized, but this signal peptide ) 3-Galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase is released from cells as soon as the protein is secreted.
  • the present invention relates to a soluble protein from which all or a part of the membrane-binding region and / or the signal peptide region has been deleted, as long as it retains the activity of / 3-galactosidase ⁇ 2,6-sialyltransferase. include.
  • the soluble 3-galactosid-2,6-sialyltransferase protein may include a part of the membrane-bound region or a part of the cytoplasmic region or another sequence, provided that the protein is secreted. .
  • the signal peptide that secretes the protein may be derived from the host or of a heterologous origin.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a truncated form of / 3-galactosidase ⁇ 2,6-sialic acid containing soluble protein, one of the more preferred signal peptides.
  • Transferase proteins can be prepared using any desired conventional technique.
  • a full-length cloned DNA fragment of SEQ ID NO: 2 can be digested with a restriction endonuclease to produce a shortened DNA fragment, which can be isolated by electrophoresis on an agarose gel.
  • digestion with a restriction endonuclease may be performed at a naturally occurring cleavage site, or may be performed on a DNA fragment of SEQ ID NO: 2 to which a linker having a predetermined restriction endonuclease cleavage site has been connected in advance.
  • the DNA sequence encoding the predetermined truncated protein fragment thus isolated can be amplified using the well-known polymerase chain reaction.
  • a stop codon may be inserted at a predetermined location using known mutagenesis techniques, for example, immediately downstream of the last amino acid codon in the extracellular region.
  • the terminal nucleotides can be removed from the DNA fragment using an enzymatic treatment (eg, Ba131 exonuclease) and replaced with a fragment having the desired specific end.
  • an enzymatic treatment eg, Ba131 exonuclease
  • a linker to be used there is a commercially available linker which can be ligated to a blunt end generated by digestion with Ba131 and contains a restriction endonuclease cleavage site.
  • an oligonucleotide that reconstructs the N-terminus or C-terminus at a predetermined point on the recombinant protein can be synthesized and ligated to the DNA fragment.
  • This oligonucleotide may have a restriction end nuclease cleavage site upstream of the coding sequence for convenience in genetic engineering, and an initiation codon (ATG) at the N-terminus for expression in specific hosts. May be.
  • Soluble protein can be obtained by culturing host cells transformed with the obtained gene and purifying the supernatant, but it is desirable to destroy the cells to increase the yield .
  • the following examples are provided to illustrate specific embodiments of the present invention and are not intended to limit the technical scope of the present invention. The following methods were employed in each step of the following examples.
  • a region containing a large number of corresponding amino acids with a small number of codons was selected from a predetermined amino acid sequence, and was prepared based on the nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence. The synthesis was commissioned to Japan Bioservice.
  • JTO160 was cultured in nutrient broth (manufactured by Oxoid) at 30 V for 16 hours. The culture was centrifuged (4: ⁇ 10 minutes ⁇ 8,000 rpm), and 3 g of the obtained cells were subjected to the Saito-Miura method (Preparetion of transforming).
  • Genomic DNA was purified according to deoxyribonucleic acid by Phenol treatment. Biochem. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963)). 50 g of the purified genomic DNA was partially digested with Sau3AI, and the obtained gene fragment was ligated to ⁇ DASH II / BainHI Vetor Kit (Stratagene). This was packaged using Gigapakll Packing Extracts (Stratagene) to prepare a gene library.
  • Escherichia coli XL-1 Blue MRA (P2) was used as a host to amplify the prepared gene library, and the cells were cultured at 37 t: and 150 rpm in an LB medium. After completion of the culture, the culture was diluted with 1 OmM magnesium chloride solution so that ⁇ D o became 0.5. To the diluted solution 60 ⁇ ⁇ , 1 Owl of the gene library prepared as described above was added, and the mixture was shaken with 37 ⁇ for 15 minutes. After adding 10 ml of LB-topagarose pre-warmed to 48 and stirring, the mixture was overlaid on the LB-plate pre-warmed to 37. After solidification at room temperature, the cells were cultured at 37 for 8 hours.
  • Probe fluorescence The synthesized probe was fluorescently labeled using a 3′-oligolabeling kit (Amersham).
  • An agarose gel replica for Southern hybridization was prepared by the following method.
  • the DNA digested with the restriction enzyme was electrophoresed on a 0.8% agarose gel using TAE buffer. After the electrophoresis, the agarose gel was immersed in a denaturing solution (0.5 M Na ⁇ H> 1.5 M NaC 1) for 15 minutes to denature the DNA in the gel with alkali. Next, the rice gel was immersed in a neutralization solution (0.5 MT ris—HC1 (pH 7.5), 1.5 M NaCl) for 5 minutes to neutralize the alkali. This gel was cut with HybondN + cut to the same size as the gel, and sandwiched between Kim Yuoru and left at room temperature to transfer DNA to HybondN + to prepare a replica of the gel. The obtained replica was washed with 2XSSC buffer and left on a filter paper until it was dried at room temperature. After drying, the replica was baked at 8 for 2 hours.
  • a denaturing solution 0.5 M Na ⁇ H> 1.5 M NaC 1
  • a neutralization solution 0.5 MT ris—HC1 (
  • a colony hybridization and a colony for plaque hybridization and a replica of plaque were prepared by the following method.
  • HybondN + cut to the same size as the plate was placed on a plate on which colonies or plaques were formed at an appropriate frequency, and the colonies or plaques were copied to make replicas.
  • the plate for the mass after the replica was stored at 4.
  • the prepared replica was left on a filter paper immersed in a denaturing solution (0.5 M Na ⁇ H> 1.5 M NaCl) for 5 minutes to alkali-denature the colonies or phages.
  • This replica was neutralized by leaving it on a filter paper immersed in a neutralizing solution (0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 1.5 M NaCl 1) for 3 minutes, and further washed with 2XSSC buffer.
  • the treated replica was left on the filter paper until it dried at room temperature. After drying, replicas were baked at 80 for 2 hours.
  • the hybridization was carried out according to the manual of the 3 ′ oligo labeling kit (Amsham) by the following method.
  • the replica was placed in a Hypli bag, and 30 ml of the hybridization solution was placed in the bag and shaken at 43 for 1 hour in a thermostatic water bath to equilibrate. next, A fluorescently labeled probe was added to this solution so that the concentration became 1 OngZml, and the mixture was shaken for 43 hours in a constant temperature water bath and annealed. The following operations were performed in the bat. After annealing, the replica was washed with 5 ⁇ SSC containing 0.1% TritonX-100 for 5 minutes at room temperature. This operation was repeated twice. Bow I Continuing Washed in 1XSSC containing l% TritonX-100 for 15 minutes at 43 :. This operation was repeated twice.
  • the replica was further washed with buffer solution 1 (0.1 MT ris -HC 1 (pH 7.5), 1.5 MNa C 1) for 1 minute.
  • buffer solution 1 0.1 MT ris -HC 1 (pH 7.5), 1.5 MNa C 1
  • the replica was immersed in a blocking solution, shaken at room temperature for 3 D minutes, and blocked. After blocking was completed, the plate was washed with buffer solution 1 for 1 minute. After washing, the plate was immersed in the antibody solution and shaken at room temperature for 30 minutes to bind the antibody. Next, this was washed with buffer solution 2 (0.1 MT ris -HC 1 (H7.5), 0.4 M NaCl) for 5 minutes. This operation was repeated four times. After the washing was completed, the detection solution was added, and the mixture was shaken for 1 minute to emit fluorescence.
  • This replica was sandwiched between Kim towels, lightly dehydrated, and placed in a film cassette.
  • the Saran wrap was placed on top of it, and an X-ray film was placed on top of it and left for 15 minutes to expose.
  • the X-ray film was developed using Fuji Medical Film Processor (Fuji Film).
  • the plaques of interest were isolated from the plate, suspended in SM buffer (501) and stored at 4.
  • the phage extracted with the SM buffer was amplified according to the gene library amplification method described above.
  • the phage DNA was purified from the amplified phage solution using a ⁇ -prep DNA purification kit (Promega) by the following method.
  • a DNA purification solution was added to denature the proteins constituting the phage particles to extract the phage DNA, and at the same time, the DNA extracted in the DNA purification solution was adsorbed to the resin.
  • This solution was added to the column for DNA purification using a syringe, and only the resin was packed in the column.
  • the column was washed with 2 ml of 80% isopropyl alcohol and then centrifuged (12,000 rpm for 20 seconds at 4) to dry the resin in the column.
  • 100 w 1 of TE buffer kept at 80 was added, and the mixture was centrifuged (12,000 rpm for 20 seconds at 4) to elute phage DNA from the resin. Insertion of gene fragment into vector
  • pUC19 was cut with HindII I37 for 1 hour. This was then treated with bacterial phosphatase (BAP) for 65 hours, 1 hour, and precipitated with ethanol. The obtained precipitate was washed with 70% ethanol, dried with a speed bag to remove ethanol, and dissolved in sterilized water.
  • BAP bacterial phosphatase
  • the phage DNA (5 g) was cut with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, a gel fragment containing the target gene fragment to be hybridized with the probe was cut out by Southern hybridization. DNA was extracted from the cut gel fragment using Gene-I-clean (Funakoshi), and ethanol was precipitated. The resulting precipitate was purified with 70% ethanol, dried on a speed vac to remove ethanol, and dissolved in> 10 il of sterile water.
  • the excised DNA (91) was mixed with pUC19 (1 ⁇ . ⁇ ) Digested with Hind III and BAP-treated, and the mixture was added with evening ligation kit solution I (10 1). For overnight.
  • Transformation of E. coli MV1184 was performed by the following method.
  • the E. coli MV1184 competent cells (1001) stored in 1-80 were thawed in ice, plasmid DNA (10 u ⁇ ) was added thereto, and the mixture was left on ice for 30 minutes. This was treated at 42 °: for 1 minute and then left on ice for 3 minutes. To this, 900 t1 of LB medium kept at 37 was added, and the mixture was shaken at 37 for 1 hour. After completion of shaking, this solution was applied to LB-ampicillin, IPTG, and X-Ga1 agar medium, and cultured at 37 t: for 16 hours. Preparation of plasmid DNA
  • the target colony was picked from the agar medium, inoculated on LB-ampicillin liquid medium, and cultured with shaking at 37 for 16 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged (15,000 rpm for 10 minutes at 4) to recover the cells. Plasmid DNA was purified from the obtained cells using a QIAGEN mini-preparation kit.
  • the nucleotide sequences of the plasmid and the gene fragment inserted into the phage were analyzed.
  • a sample for nucleotide sequence analysis was prepared according to the protocol attached to the cy5-type sequencing kit (Pharmacia). The analysis of the base sequence
  • test was performed using an automated dosing kit.
  • phage a sample for base sequence analysis was prepared according to the protocol attached to the Auto Cycle Sequencing Kit (Pharmacia). The nucleotide sequence was determined using an auto cycle sequencing kit.
  • a 0.5 wort long ranger gel was used as a gel for electrophoresis for nucleotide sequence analysis.
  • the electrophoresis was performed under electrophoresis conditions for a 0.5 band long ranger gel attached to the sequencer.
  • Photobacterium Dam Cella J TO 160 has been deposited as FERMBP-4900 on January 24, 1994 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • Example 1 Isolation of b st gene
  • the amino acid sequence of the ST0160 protein was analyzed, and the JTO160 gene library was searched using a probe prepared based on the amino acid sequence, and the bst gene was cloned.
  • Fully purified ST0160 1.5 s siliconized 5 s (lml) The mixture was collected in a volume tube, and 150 ⁇ l of a 100% TCA solution was added. This was left on ice for 20 minutes to precipitate the enzyme, and then centrifuged (15 for 15 minutes at 15,00 Orpm) to collect the precipitate. The obtained precipitate was washed twice with cold acetone, and dried with a speed bag. To this, 8 M urea + 0.4 M ammonium bicarbonate solution 251 was added, and then 45 mM dithiosyl 1 solution 2.5 w 1 was added, and the mixture was incubated at 5 O: for 15 minutes to cut disulfide bonds in the protein. did.
  • the solution was returned to room temperature, lO OmM lodoacetamide solution 2.51 was added, and the resulting SH group was modified by leaving at room temperature for 15 minutes.
  • ultrapure water 701 and calcium chloride were added to a final concentration of 5 mM, a trypsin solution 101 containing 5 U of trypsin was added, and the mixture was left at 37 for 24 hours to perform a trypsin digestion reaction. .
  • the peptide obtained by digesting ST0160 with trypsin was fractionated by the following method.
  • a peptide separation system Smart System (Pharmacia) was used.
  • the peptide separation column used was RPCC 2 ZCSC 2.1-10 (Pharmacia). After adding the STO 160 trypsin digestion solution to the column, use Solution 1 (0.06% TFA, 2% acetonitrile) and Solution 2 (0.052% TFA, 100% acetonitrile) to give a solution 1: 100%
  • Solution 1 0.06% TFA, 2% acetonitrile
  • Solution 2 0.052% TFA, 100% acetonitrile
  • N-terminal amino acid sequence of ST0160 and peptide amino acid sequence obtained by trypsin digestion of this enzyme that is, 9 putative internal amino acid sequences of this enzyme, a total of 10 partial amino acid sequences of ST0160 Revealed.
  • the obtained amino acid sequence is shown in Table 1 below.
  • sequence (d) corresponding to amino acid residues 258-270 of SEQ ID NO: 1:
  • Probe A having 5′-GCIAAITAIITIGCIGGIACIIIICCIGAIGCICCIAA-3 ′ (SEQ ID NO: 3) was prepared. It should be noted that I is inosine, which can recognize adenine, peracid and cytosine to form a pair.
  • genomic DNA was digested with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis to cut out a gel fragment containing a 2.8 kbp DNA fragment, and DNA was extracted from this fragment.
  • the extracted DNA was ligated with pUC19 which had been digested with HindIII and treated with BAP.
  • E. coli MV 1184 was transformed with the obtained plasmid. A colony hybridization of the resulting colony was performed, but surprisingly, no Koguchi 21 hybridized with probe A was obtained.
  • plaque hybridization was performed using a probe for the gene library of genomic DNA of P. dams ela JT0160. Daisysion Done. As a result, seven strains of phages thought to contain the bst gene fragment were obtained. Each of these phages was amplified to prepare a phage DNA, and the resulting phage DNA digested with HindIII was subjected to Southern hybridization using probe A. DNA fragments of about 1.6 kbp size hybridized very strongly in all phages.
  • One strain was selected from 7 strains of phage, 5 / g of the phage DNA was digested with HindIII, and agarose gel electrophoresis was performed. After the electrophoresis, a gel fragment containing a DNA fragment of about 1.6 kbp in agarose gel was cut out, and DNA was extracted from the gel fragment. The extracted DNA was combined with pUC19 that had been digested with HindIII and then BAP-treated. E.coli iMV1184 was transformed with the obtained plasmid. Colony hybridization of the resulting colonies was performed using probe A, and as a result, three strongly hybridizing colonies were obtained.
  • Each of the three strains was picked from an agar medium, inoculated into an LB-ampicillin liquid medium, and cultured with shaking at 37 for 16 hours. Cells were collected from the resulting culture by centrifugation, and plasmid DNA was prepared from the cells. The obtained plasmid DNA was digested with HindiII and subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that a DNA fragment of about 1.6 kbp was inserted into the plasmid purified from each strain. In addition, as a result of performing the Southern hybridization of the electrophoresed gel using the probe A, the DNA fragment of about 1.6 kbp was strongly hybridized. From the above results, it was considered that the bst gene fragment was included in the DNA fragment of about 1.6 kbp inserted into these plasmids.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment of about 1.6 kbp inserted into the plasmid obtained in the above g was analyzed using an ALF red DNA sequencer (the nucleotide sequence in FIGS. 7 and 8 minus 361 to 1244).
  • ALF red DNA sequencer the nucleotide sequence in FIGS. 7 and 8 minus 361 to 1244.
  • the sequence starting from the second Asn residue in the N-terminal amino acid sequence of ST0160 matches the sequence from the 17th position of the obtained ORF, and as estimated in c, the N-terminal amino acid of STO160 The sequence was found to start at the Cys residue.
  • the hydrophobicity and hydrophilicity of the obtained QRF were analyzed, a region with extremely high hydrophobicity was present on the N-terminal side of the ORF.
  • two positively charged Lys residues were present immediately after the first Met residue of this ORF. Since this was a typical signal sequence structure, the sequence consisting of 15 amino acid residues from this Met residue to the 16th Cys residue is the STO 160 signal sequence. It was estimated.
  • Two types of sequence primers having the following were prepared. Using these primers, the phage DNA considered to contain the bst gene fragment obtained in If was sequenced. As a result, it was possible to determine the nucleotide sequence up to about 150 bp downstream of the HindIII of pBSTN on the 3 ′ side.
  • Probe B having The phage DNA was digested with HindIII, subjected to agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern hybridization using a fluorescently labeled probe B. As a result, a gene fragment of about 1.2 kbp hybridized very strongly with probe B.
  • the phage DNA5 was digested with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, a portion containing the 1.2 kbp DNA fragment in the agarose gel was cut out, and DNA was extracted from the gel. The extracted DNA was ligated with pUC19 that had been digested with HindIII and treated with BAP, and E.coli MV1184 was transformed with the obtained DNA. When colony hybridization of the resulting colony was performed using probe B, five strongly hybridized colonies were obtained.
  • Each of the obtained colonies was picked from an agar medium, inoculated into an LB-ampicillin liquid medium, and cultured at 37 with shaking for 16 hours.
  • the cells were collected from the obtained culture by centrifugation (4, 15,000 rpm for 30 seconds), and plasmid DNA was purified from the cells.
  • the resulting plasmid DNA was digested with Hind III and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the plasmid DNA purified from all colonies showed that the DNA fragment of about 1.2 kbp was inserted. It could be confirmed.
  • Southern hybridization of this agarose gel was performed using Probe B. As a result, all of the DNA fragments of about 1.2 kbp hybridized strongly with Probe B.
  • the nucleotide sequence of the approximately 1.2 kbp DNA fragment obtained in a) above was analyzed using an ALF red DNA sequencer.
  • a long ORF consisting of 262 amino acid residues from one Hind III was present.
  • a stem-and-loop structure consisting of a 10-bp stem and a 7-bp loop was present at the 3 'downstream of this ORF. From the above results, it was considered that the ⁇ RF of this gene fragment was located at the C-terminal side of the structural gene of the bst gene (base sequence 1239-1348 in FIGS. 7 and 8), and this plasmid was named pBSTC.
  • the sequence of HindIII present inside the bst gene was GA AG CT: LC including the outer base, and had a palindromic structure. Most of the sequences of the restriction enzyme site and the methylase site were palindromic, and the 8 bp sequence of GAAGCTTC was presumed to be a recognition sequence of DNA methylase in JTO160.
  • the sequences of the Hind III portions present at both ends of the bst gene are AAGCTT A and A AAGCTT, and these sites are not methylated and cut at Hind II because they are not palindromic sequences.
  • restriction enzymes that recognize a 6 bp nucleotide sequence
  • they are frequently used in genetic engineering research.
  • a restriction enzyme that recognizes an 8 bp sequence has been demanded.
  • the only restriction enzyme that recognizes the 8 bp sequence currently on the market is Not I.
  • many bacteria have both a DNA methylase and a restriction enzyme that recognize the same sequence as a host defense mechanism. JTO160 was considered to have a DNA methylase that recognizes an 8 bp sequence, and it was therefore presumed that this bacterium might also have a restriction enzyme that cuts this sequence.
  • JTO160 was considered to have a DNA methylase that recognizes an 8 bp sequence, and it was therefore presumed that this bacterium might also have a restriction enzyme that cuts this sequence.
  • the development of a novel restriction enzyme that recognizes this 8 bp sequence is extremely beneficial Is expected.
  • sialyltransferases mainly from animals, have been purified and cloned.
  • sialyl motifs There are two highly homologous regions in the amino acid sequence of animal-derived sialyltransferases, regardless of their origin or type, and are called sialyl motifs.
  • No highly homologous region was found in the deduced amino acid sequence of STO16 obtained this time and the amino acid sequence of rat-derived / 3-galactoside ⁇ -2,3 sialyltransferase.
  • a region having high homology with the sequence of the above-mentioned serial motif was not found.
  • the long open reading frame (ORF) contained in the cloned gene fragment divided into pBSTN and pBSTC contains a sialyltransferase derived from Phot ob act ter i ui m d am s e la J T 0160.
  • Encoding 0 proves to be a gene, that is, a b st gene.
  • the gene is inserted into an expression vector, expressed in E. coli, and the gene product is analyzed.
  • the function of the region presumed to be involved in membrane binding at the C-terminus of the present structural gene will be analyzed.
  • PAQN modified from pAQI was used as a vector on which to construct an expression vector.
  • the structure of pAQI is shown in FIG. 1, and the structure of pAQN is shown in FIG.
  • This plasmid has a gene encoding aqualysin I (aquI gene) between EcoRI immediately after the tac promoter and HindIII immediately before rrnBTlT2.
  • the aqu I gene has 10 unique restriction enzyme sites in this plasmid, including EcoRI and HindiII, which are advantageous for genetic manipulation.
  • the plasmid is the 1 ac I q which controls the tac promoter one has in plasmid, for holding down the tac promoter evening one more strongly than normal system was considered to be suitable for purposes of this example.
  • the EcoRI-Xbal site of pMBALlAXH was excised, and inserted into the EcoRI-Xbal site of the plasmid excised from the EcoRI-Xbal site of the aqualysin gene of pAQI ⁇ ⁇ ⁇ .
  • PAQN The construction of the bst gene expression plasmid pEBST was based on the fact that the gene fragments contained in pBSTN and pBSTC were both HindIII fragments. The tac promotion was introduced downstream of Yuichi. At this time, the original promotion of the bst gene was completely removed.
  • restriction enzyme sites of pAQN are listed in order from EcoR I, Bgl II, Xba I, and Hind III immediately after the tac promoter. II and XbaI were modified in this order.
  • HpaI site base sequence 2201-2206 in FIGS. 7 and 8 downstream of the ORF contained in pBSTC was modified to Xbal, and the RF containing the C-terminal portion was replaced with modified pAQN XbaI-HindIII.
  • an EcoR I site was inserted upstream of the Met present at the N-terminus of the ORF contained in pBSTN, and the ORF containing the N-terminal portion was inserted into pAQN into which the ORF containing the C-terminal portion was inserted.
  • the plasmid was inserted with EcoRI-HindIII to complete the expression plasmid pEBST.
  • a mutant lacking the C-terminal region was also prepared in the same manner.
  • pAQNAXH was cut with BglII and smoothed by treatment with Klenow fragment. Subsequently, a Hind I I I linker was added for ligation. This treatment replaces the Bg1II site with the HindIII site (pAQN-EHX in FIG. 3).
  • pMBSTC was cut with HpaI, blunted by treatment with Kleno fragment, and ligated by adding XbaI linker.
  • HpaI becomes Xba I (pMBSTC—HX in Figure 4).
  • pMB STC—HX was cut with XbaI and ligated as it was. By this treatment, an extra XbaI fragment (including the HindIII site) was excised (pMBSTCAX in FIG. 4).
  • Hindlll-Xbal fragment of pMBSTCAX was inserted into the HindIII-XbaI site of pAQN-EHX to create pEBSTC.
  • a region presumed to be a membrane-binding region of ST0160 (hereinafter referred to as “M”) and a region having high homology to phoU (hereinafter , "P"), for the purpose of analyzing the effects on the function and expression of these regions.
  • M membrane-binding region of ST0160
  • P region having high homology to phoU
  • ⁇ ⁇ leucine at amino acid residue 539 (using primer BST03) and aspartic acid at position 498 (primer (Using BNST04) was modified to a stop codon.
  • the resulting plasmids are pMBST CAC 137 and pMB STCAC 178, respectively.
  • three types of termination codons were inserted to completely terminate the translation, and restriction enzyme sites were also inserted for easy confirmation of the modification (PshB I and pMBS TCAC 178 were added to pMBSTCAC137). Bg 1 1 1).
  • pMBSTCAC 137 and pMBSTCAC 178 insert the HindII-XbaI fragment into the HindIII-XbaI site of pAQN-EHX in the same manner as in the case of pMBSTCAX, pEBST was generated (pEBSTCAC 137 and pEBSTCAC 178, respectively).
  • Ec o upstream of the ORF start site of pBSTN An RI site was inserted.
  • the base between the EcoR I site and the codon ATC encoding methionine was made 0 base (using primer BST02: pMBSTN-E0) and 7 bases (using primer BST01: pMBSTN— E7) were prepared.
  • pMBSTN-E0 is inserted into pAQN
  • the distance from the SD sequence to ATG is 9 bases
  • pMBSTN-E7 is 16 bases.
  • the distance from the SD sequence to ATG was set to 9 bases, because it is believed that the expression efficiency would be the best in that case.
  • the bst gene was thought to be a lethal gene for E. coli as described above, so the distance from the SD sequence to ATG was slightly increased to obtain a slightly reduced expression level. did.
  • pMBSTN-E0 and pMBSTN-E7 were each cut with EcoRI and ligated as they were. By this treatment, extra EcoRI fragments (including HindiII) were cut (pMBSTN-E0 ⁇ and pMBSTN-E7 ⁇ E in FIG. 5).
  • pEBST- ⁇ -pBSTN- ⁇ + pBSTNC C178 C2 series
  • the resulting transformants (six types) were cultured with shaking at 30, 150 rpm in LB-ampicillin-IPTG liquid medium, respectively, and the growth of the cells and sialyltransferase activity were measured.
  • the inoculation of the cells was carried out by adding 0.5% of the glycerol stock prepared by the method (1) to the medium.
  • the ampicillin concentration in the culture was 100 mg / l, and the IPTG concentration was 0.02 mM.
  • the growth of the cells was monitored by sampling the culture solution over time and measuring the absorbance at 66 Onm.
  • FIG. 9 shows the growth of each of the cells (A2, B2, C2). As shown in Fig. 9, the growth was fast in the order of C series> B series> A series.
  • the crude enzyme from the cells collect the cells from the culture by centrifugation, suspend the cells in 20 mM cacodylate buffer (pH 5.0) containing 0.2% Triton X-100, and sonicate the cells. Then, the cells were disrupted to obtain a crude enzyme. As shown in Table 3, the enzyme production was also in the order of OB> A.
  • Xia Lil trans Blow Ichize activity is the supply substrate CMP- [4, 5, 6, 7, 8, 9- 14 C ] has metastasized from a Ne UAC lactose is receptive substrates, [ 4, 5, 6, 7, was determined by measuring the 8, 9 one 14 C] -N e UAC. Standard reaction mixture, CMP-of 70nmol [4, 5, 6, 7, 8, 9 one '4 C] - Ne u Ac (642cmp / nmol ), 1. 25 / zmol Lactobacillus Ichisu, and 0.02 2 OmM sodium cacodylate buffer containing% Triton X-100 (pH 5.0)
  • the crude enzyme prepared by the method described in (2) above was partially purified using an ion-exchange column (Q-Sepharose, Pharmacia) or hydroxyapatite (manufactured by Koken Co., Ltd.), and pyridylamination was performed as a sugar acceptor substrate.
  • An enzymatic reaction was performed using lactose and CMP-NeuAc as a sugar donor substrate (30 t: 6 hours). After the reaction was completed, the enzyme was lost by treating with 100 at 2 minutes. I was alive. Thereafter, the reaction product was analyzed by HPLC.
  • the pyridylaminoglycans were eluted sequentially using the linear gradient method (0-35 min) of 100% eluate B (0-35 min) and 100% eluate B (35-50 min) using Pyridylamino glycans were detected by detecting fluorescence (Ex: 320 nm, Em: 40 Onm) under the conditions of min flow rate and 40 column temperature.
  • centrifugation is performed at 100,000 xg, lhr, and the protein present in the centrifuged supernatant is defined as being solubilized. Therefore, strains of the C2 series were cultured in LB-ampicillin-1 IPTG liquid medium with shaking at 30 t: 15 Orpm. After completion of the culture, the cells were centrifuged, the cells were collected, and a 20 mM cacodylate buffer (pH 5.0 ) Was suspended in the cells, and the cells were sonicated to disrupt the cells to obtain a crude enzyme. The cell lysate was centrifuged at 4,100,000 ⁇ g, lhr, and the supernatant was collected. The sialic acid transfer activity of the supernatant was measured.
  • CM P- is the supply substrates [4, 5, 6, 7, 8, 9- 14 C ] an acceptor substrate from a Ne UAC easy! ⁇ Metastasized to Ichisu was determined by measuring the [4, 5, 6, 7, 8, 9- 14 C ] one Ne UAC. Standard reaction mixture of 70 nmol CMP-[4, 5, 6, 7, 8, 9 one 14 C] -Ne u Ac (642cmp / nmol) , 1. of 25 ⁇ mol lactose, and 0. 02% Tr iton 2 OmM sodium cacodylate buffer containing X-100 (pH 5.0)
  • sialic acid transferase activity was 12.98 UZ1.
  • Organism name Photobacterium damsela Strain name: J T 0160
  • Lys Asp Thr Pro Asn Lys lie Glu Thr Leu Glu Gly Glu Val Ser Leu
  • Thr Arg lie lie Ala Lys Arg Gin Pro Thr Ala Ser Asp Leu Arg Leu
  • Val Ala Glu Ser lie Ala Lys Val Ala Leu Glu Ser Phe Ser Asn Lys 545 550 555 560
  • Ala Ala lie Glu Val Tyr Gin Glu Asp Asp Arg He Asp Gin Glu Tyr
  • Glu Ser lie Val Arg Gin Leu Met Ala His Met Met Met Glu Asp Pro Ser 610 615 620 Ser lie Pro Asn Val Met Lys Val Met Trp Al a Al a Arg Ser lie Glu 625 630 635 640
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Photobacterium damsela Strain: J T 0 16 0
  • AAATTATCT TGAAATGAAT GATAAGGAAG GGGCGATTGA ATTACTTGAA GAGGTAACGG -336 CAAAAGCGGA TGGGGCTGTA AAAGCGGAAG CTGAGGAAGT TATTGAATAA CTAATTTTTC -276 AAATGTTCTG TTTTAAGGCG TAAACGATTG AGTCTCTTAA AGCGTACTAT GTCATCATAA -216 GGCTGGTGTG GCATAGTACG CACTTTTAAT GATCTTCATT ATTTATTACT TATTGGTATG -156 ACAGTTTGTA AATAATAATT TTTCAATTGA TATTTTTATG CTGGTATTGA ACCTGAAATC -96 AAATGAGATA TATCTCACAA AAAGCAAATG TAAACATCAT CTTAAATAGA TGAGGCAATA -36 TACTACTAAG AATTTTTTAT GTGAATGTGC TTAAT ATG AAG AAA ATA CTG ACA 18
  • Met Lys Lys lie Leu Thr
  • GGT AAA GAC TAC GAT CTA TTT TTC AAG GGG CAT CCT GCT GGT GGC GTT 1218 Gly Lys Asp Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ala Gly Gly Val
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • CTCTAGAG 8 SEQ ID NO: 9
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids Sequence: SEQ ID NO: 10
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書
)3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素をコードする遺伝子 発明の属する分野
本発明は、 /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素をコードする新規 遺伝子に関する。
本発明はさらに、 新規シグナルべプチドをコ一ドする遺伝子に関する。 従来の技術
近年、 動物細胞における糖タンパク質、 糖脂質などの複合糖質が有する生物活 性が次々と明らかにされ、 複合糖質における糖鎖の重要性が認識されつつある。 複合糖質の糖鎖の非還元末端に存在することの多い糖としてシアル酸が挙げられ るが、 糖鎖の持つ生理機能、 生物学的意識が重要視される中でこのシアル酸はと りわけ多くの機能を有していると考えられる。 しかしながら、 その化学合成、 特 にシアル酸をオリゴ糖、 複合糖質糖鎖などの糖鎖に付加する反応は困難であるた め、 方法が非常に簡便で、 かつ副反応を生じることなく高収率で合成を可能にす る酵素法が注目されている。
現在市販されているシアル酸転移酵素は、 ラット、 ブ夕、 ヒト等の動物の顎下 腺、 肝臓などの臓器から取得された酵素である (Poul son e t al. J. Bio l. Chem. 252 , 2356-2362 (1977) , Weins te in et al. J. Bio l. Chem. 257_, 13835-13844 (1982) , Miyagi e t al. Eur. J. Biochem. 126 253-261 (1982) ) 。 これらの動物 由来の酵素は精製が困難で大量に得られないため非常に高価であり、 さらには酵 素としての安定性が悪いという問題を有している。
そこで、 本発明者らは大量供給可能なシアル酸転移酵素の開発を目的として、 まずシアル酸転移酵素活性を有する細菌の探索を行った結果、 目的の活性を有す る海洋性細菌フォトバクテリゥム ダムセーラ （Photobac ter ium damsel a) J T 0 1 6 0 (以下、 本明細書中 「 J T O 1 6 0」 と言う） を見いだした。 また J T 0 1 6 0の生産するシアル酸転移酵素 0 1 6 0 (以下、 「S T 0 1 6 0」 と言う ) を電気泳動的に単一にまで精製した。 さらに、 本酵素の結合様式を解析し、 S T O 1 6 0が糖鎖中の非還元末端に存在するガラクト一スの 6位に α 2— 6結合 でシアル酸を転移する /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素であるこ とを明らかにした （特開平 8— 1 5 4 6 7 3号公報） 。 これにより、 S T 0 1 6 0の生産菌である J T O 1 6 0を培養することにより、 シアル酸転移酵素を大量 に生産することが可能となった。 しかしながら、 この方法の場合、 本酵素が膜結 合型酵素であるために精製の際に界面活性剤を添加する必要があり、 精製酵素溶 液に界面活性剤が入つてしまう等の問題がある。
一方、 遺伝子工学技術の発展により、 所定のタンパク質をコードする遺伝子を 組み込んだ発現べクタ一で形質転換した組換え大腸菌を用いて、 当該タンパク質 を大量に発現させることが可能となっている。 この方法を 3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素に応用した場合、 上述したような問題を伴わないばか りでなく、 膜結合に関与する配列を欠失した可溶性の酵素、 あるいは、 基質特異 性を改変した酵素等の天然に存在しない改変体を産生することも可能となる。 さ らに、 例えば、 Τ 7プロモー夕一等の高効率のプロモ一夕一を用いれば、 菌体の 可溶性タンパク質の 5 0 %以上が所望の夕ンパク質となるような非常に生産性の 高い生産系の構築も可能であると期待される。 しかしながら、 生育培地であるマ リンブロスで増殖した J T O 1 6 0からは遺伝子 D N Aを抽出することができな いという問題があつたため、 ）3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素を コードする遺伝子は得られていなかった。 よって本発明前は、 その必要性が高か つたにもかかわらず、 /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素を遺伝子 工学的に利用することはできなかった。 発明の概要
本発明は、 /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素をコードする新規 遺伝子を提供することを目的とする。
本発明は、 また、 前記遺伝子を含む、 —ガラクトシド α 2 , 6—シアル酸 転移酵素タンパク質の発現ベクターを提供すること目的とする。
本発明は、 さらに、 前記発現べクタ一を用いた組換え /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。 本発明はさらにまた、 前記方法を用いて製造された組換え /3—ガラクトシドー 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を提供することを目的とする。
本発明はまた、 新規シグナルペプチドをコードする遺伝子を提供することを目 的とする。 図面の簡単な説明
図 1は、 pAQ Iの構造を示す。
図 2は、 pAQNの構造を示す。
図 3は、 p AQNから p AQN— EHXまでの構築工程を示す。
図 4は、 pBSTCから pEBSTCまでの構築工程を示す。
図 5は、 pBSTNから pEBSTまでの構築工程を示す。
図 6は、 発現ベクター pEBSTの構造を示す。
図 7は、 b s t遺伝子の塩基配列の前半を推定アミノ酸配列と共に示す。 図 8は、 b s t遺伝子の塩基配列の後半を推定アミノ酸配列と共に示す。 図 9は、 本発明の発現べクタ一を含む E. col i MV1184 形質転換株 (A2, B2, C2) の増殖を示す。
図 10は、 実施例 211(2) で 6種類の形質転換体から得た粗酵素が、 ST0160と 同じ活性をもつことを確認するため、 糖供与体基質として CMP-NeuAc を用いて酵 素反応を行った際の、 反応生成物のリテンションタイムを示す。 発明の詳細な説明
本発明者らは、 鋭意研究に勤めた結果、 J TO 160の生育培地として、 典型 的に使用されていたマリンブロス 2216 (デフィコ社製） ではなくニュートリ エンスブロス （ォキソイド社製） を用いることにより、 J TO 160から遺伝子 DNAを抽出することに初めて成功した。 さらにこうして抽出した DNAから S TO 160タンパク質をコードする遺伝子 （以下、 「b s t遺伝子」 と言う） を 単離する試みも行った。 ST0160タンパク質は、 一般の宿主細胞にとって毒 性があると思われること等の種々の困難があつたが、 ついにその単離に成功した 。 当該遺伝子の塩基配列を決定して、 そのアミノ酸配列を推定した結果、 ST0 160タンパク質は、 後述の配列表において配列番号 1で表されるアミノ酸配列 を有することが判明した。
本発明者は、 さらに、 得られた遺伝子を含む発現ベクターを作成し、 組み換え ST0160タンパク質を発現させることを可能にした。
以下、 本発明を詳細に説明する。
ί3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素
本明細書において、 " 3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素" とは 、 シチジン 1リン酸—シアル酸からシアル酸を、 複合糖質糖鎖若しくは遊離の糖 鎖中のガラクトース残基の 6位、 又は複合糖質を構成しうる単糖で 6位の炭素に 水酸基を有する単糖の 6位に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。 限 定するわけではないが、 本酵素の至適 ρΗは 5— 6の範囲にあり、 至適温度は 3 0 で、 分子量はゲル濾過法によると 64, 000土 5, 000である。 ここで 、 複合糖質を構成しうる単糖で 6位の炭素に水酸基を有する単糖とは、 例えばガ ラク卜サミン、 マンノース、 Ν—ァセチルガラクトサミンマンノース等を意味す る。
本発明の遺伝子によってコードされる /3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸 転移酵素は、 フォトバクテリゥム ダムセーラ J TO 160中に発見された。 し かしながら、 同種の酵素が、 フォトパクテリゥム ダムセ一ラ ATCC 3353 9およびフォトバクテリゥム ダムセ一ラ ATCC 35083中にも存在するこ とが判明しており、 さらに、 同種の酵素を生産する他の微生物や生物が存在する ことが予想される。
ί3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移酵素遺伝子
本発明により決定された b s t遺伝子の塩基配列は、 配列番号 2並びに図 7お よび図 8にそれがコードする推定アミノ酸配列とともに示されている。 この配列 から明らかなように、 この遺伝子 DN Aは塩基番号 1から 2028の合計 202 8塩基対からなる。 塩基番号 1から 3は翻訳開始遺伝暗号に相当し、 塩基番号 2 026から 2028までは翻訳停止遺伝暗号に相当する。 この塩基番号 2026 から 2028の配列 （*) は TAAであるが、 TGAまたは TAGでもよい。 さ らに、 図 7および 8に記載された構造遺伝子の 5' 側上流領域には大腸菌のプロ モーター領域 （一 10領域と一 35領域） とリボソーム結合領域 （SD配列） と 相同性の高い配列が、 また、 本構造遺伝子の 3' 側下流にはステムアンドループ 構造という典型的な夕一ミネ一夕一領域が各々確認され、 これらの領域が b s t 遺伝子の発現制御に関わる領域であると推定される。
配列番号 1は S TO 160タンパク質のアミノ酸を示したものである。 ST0 160タンパク質は、 15個のアミノ酸残基 （配列番号 1の 1— 15) からなる シグナル配列、 細胞外領域 （配列番号 1の 16— 498) を含む、 全長 675個 のアミノ酸残基で構成される。 b s t遺伝子から推定されるアミノ酸配列を有す るタンパク質の分子量は 76. 5 kDaであり、 シグナル配列を除いた分子量で も 74. 8 kDaである。 完全に精製した S T 0160タンパク質の S D S電気 泳動上での分子量は約 61 kD aであることから （特開平 8— 1 54673号公 報） 、 STO 160タンパク質はプロセッシングを受けて活性体となるか、 また は、 精製中に菌体内のプロテア一ゼの作用を受けているものと考えられる。 さらに、 配列番号 1のアミノ酸配列の C末端領域 （配列番号 1の 497— 67 5) は、 大腸菌のリン酸輸送システム制御蛋白質と 60%以上という非常に高い 相同性を有する。 この領域のうち 539残基— 594残基の部位に、 途中で短い ターン構造を持つ長い 2つの αヘリックス構造が存在すると推定される。 通常 α ヘリックスは 18個のアミノ酸残基で 1単位を構成するが、 STO 160タンパク 質の場合、 その内の一つの面を構成する 4個のアミノ酸残基がすべて疎水性の高 いアミノ酸で構成される αヘリックスが 2単位続いており、 さらにその C末端側 にも疎水性の高いアミノ酸残基が片寄った領域が存在している。 この領域と Ν末 端に存在するシグナル配列領域以外には膜と結合する可能性のある領域は検出さ れず、 したがって、 この部分が S TO 160の膜結合領域であると推定される。 現在、 クローニングされている動物由来のシアル酸転移酵素の膜結合領域は N末 端側に存在する膜貫通領域であると考えられていることから、 STO 160タン パク質の膜結合様式は動物由来のシアル酸転移酵素のものとはまったく異なるも のであると考えられる。
このような考察から、 本発明は S TO 160の膜結合領域および/またはシグ ナル配列領域の少なくとも一部を削除した夕ンパク質も酵素活性を有することは 明らかであり、 そのようなタンパク質はそれをコードする遺伝子も含めて本発明 の範囲内である。 特に、 S T 0 1 6 0タンパク質の膜結合領域を削除して可溶性 にした /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素は、 本発明の好ましい態 様であり、 後に詳述する。
本発明の遺伝子は下記実施例に記載されているように、 例えば、 二ユートリエ ントブロス （ォキソイド社製） で培養した J T O 1 6 0のゲノム D N Aを用いて 作成した遺伝子ライブラリ一から、 例えばプラークハイブリダィゼ一シヨン法を 利用して得ることもできる。 あるいは、 本発明により決定された D NAの塩基配 列に基づいて、 微生物等由来の遺伝子ライブラリーを铸型とする P C R法により 容易に調製することもできる。 このように調製した i3—ガラクトシドー α 2 , 6 一シアル酸転移酵素遺伝子は、 次に述べる方法により変異体に調製することもで さる。
1つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在する。 従って、 配列番号 1で示 されるアミノ酸配列またはその酵素活性部分をコ一ドするいずれの D N Αも本発 明の範囲に含まれる。
さらに、 一般に生理活性を有するペプチドのアミノ酸配列が多少変更された場 合、 即ち、 該アミノ酸配列の中の 1又は複数のアミノ酸が置換され若しくは欠失 し、 または 1又は複数のァミノ酸が付加された場合でも該ペプチドの生理活性が 維持される場合があることは周知の事実である。 例えば、 変異体は保存的に置換 された配列を含んでいてもよく、 これは、 特定のアミノ酸残基が類似の物理化学 的特徴を有する残基によって置き換えられていてもよいことを意味している。 保 存的置換の非限定的な例には、 I 1 e、 V a 1 , し6 11又は八 1 a相互の置換の 如き脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、 又は L y sと A r g間の如き極性基 含有アミノ酸残基の間の置換が含まれる。 したがって、 配列番号 1で示されるァ ミノ酸配列またはその酵素活性部分において、 このような修飾が加えられ、 かつ J3—ガラクトシド一 α 2 , 6—シアル酸転移酵素の生物活性を有する ]3—ガラク トシドー α 2， 6—シアル酸転移酵素の変異体も本発明の範囲内である。 さらに 、 当該変異体タンパク質をコードする D N Αも本発明の範囲に含まれる。 アミノ酸の付加、 欠失または置換による変異体は、 例えばそれをコードする D NAに例えば、 周知技術である部位特異的変異誘発 （例えば、 Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982 参照） を施すことにより作成で きる。 本明細書において 「1又は複数のアミノ酸」 とは、 部位特異的変異誘発法 により付加、 欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
部位特異的変異誘発法は、 例えば、 所望の変異である特定の不一致の他は、 変 異を受けるべき一本鎖ファージ D N Aに相補的な合成ォリゴヌクレオチドプライ マーを用いて次のように行うことができる。 即ち、 プライマ一として上記合成ォ リゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、 得られた二重鎖 D NAで宿主細胞を形質転換する。 形質転換された細菌の培養物を寒天にプレー卜 し、 ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。 そうすると、 理 論的には 50%の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、 残 りの 50%が元の配列を有する。 上記所望の変異を有する DNAと完全に一致す るものとはハイブリダイズするが、 元の鎖を有するものとはハイブリダイズしな い温度において、 得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブ とハイブリダィズさせる。 次に該プローブとハイブリダィズするプラークを拾い 、 培養し DNAを回収する。
尚、 酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない 1又は複数のアミノ酸の置換、 欠失または挿入を施す方法としては、 上記の部位 特異的変異誘発の他にも、 遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に 開裂し、 次に選択されたヌクレオチドを除去、 付加または置換し、 次いで連結す る方法もある。
さらに、 本発明の範囲内に入る塩基配列には、 温和な又は苛酷なストリンジェ ンシ一の条件下で本明細書に開示した /3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転 移酵素塩基配列にハイブリダィズし、 かつ生物学的に活性な i3—ガラクトシド— a 2, 6—シアル酸転移酵素をコードする単離された DNA及び RNAも含まれ る。 温和なストリンジエンシーによるハイプリダイゼーシヨンの条件は、 例えば 、 Sambrookら， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1, pp. 1. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)に記載された条件を意 味する。 Sambrookらにより定義されているように、 温和なストリンジエンシーの 条件には、 5 XS SC, 0. 5 % S D S , 1. OmMEDTA (pH8. 0) の前洗 浄用溶液と約 5 5 ， 5 X S SC, —晩のハイブリダィゼーシヨン条件の使用が 含まれる。 苛酷なストリンジエンシーの条件には、 より高温のハイブリダィゼー シヨンと洗浄が含まれる。 その際、 プローブの長さ等の各種要因に応じて温度及 び洗浄溶液の塩濃度は適宜調節される。 好ましくは、 5 XS SC以下で 20 以 上の範囲の条件が好ましい。
組換え )3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素の製造
本発明は J3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素をコードする遺伝子 を含む発現ベクター、 並びにこれら発現べクタ一を含有する宿主細胞を前記遺伝 子の発現に適する条件下で培養して、 発現された組換え夕ンパク質を回収するこ とにより組換え 3—ガラクトシドーひ 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を製 造する方法も提供する。
本発明の組換え ]3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を 製造するためには、 使用する宿主細胞に応じて選ばれた発現ベクターに、 哺乳動 物、 微生物、 ウィルス、 又は昆虫遺伝子等から誘導された、 適当な転写又は翻訳 調節ヌクレオチド配列に連結した /3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵 素遺伝子配列を挿入する。 調節配列の例として、 転写プロモーター、 オペレータ 一、 又はェンハンサー、 mRN Αリボソーム結合部位、 及び転写及び翻訳の開始 及び終結を制御する適切な配列が挙げられる。
)3—ガラクトシドー α 2， 6—シアル酸転移酵素タンパク質の発現に適する宿 主細胞には、 原核細胞、 酵母又は高等真核細胞が含まれる。 細菌、 真菌、 酵母、 及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現べクターは、 例えば 、 Pouwels ¾, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。
原核生物には、 グラム陰性又はグラム陽性菌、 例えば、 大腸菌又は枯草菌が含 まれる。 大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、 /3—ガラクトシド -α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 原核細胞内での組換えポリべプチ ドの発現を容易にするために Ν末端メチォニン残基を含むようにしてもよい。 こ の N末端 Me tは、 発現後に組換え /3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移 酵素タンパク質から切り離すことができる。
原核宿主細胞内で用いる発現べクタ一は、 一般に 1又は 2以上の表現型選択可 能マーカー遺伝子を含む。 表現型選択可能マーカ一遺伝子は、 例えば、 抗生物質 耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺伝子である。 原核宿主細胞に 適する発現ベクターの例には、 pBR 322 (ATCC 370 1 7) の如き市販 のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。 pBR 322は、 ァ ンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、 形質転換 細胞を同定するのが簡単である。 適切なプロモータ一並びに )3—ガラクトシドー 2, 6—シアル酸転移酵素遺伝子の DN A配列が、 この pBR 322ベクター 内に挿入される。 他の市販のベクターには、 例えば、 PKK223— 3 (スエー デン、 ウプサラの Pharmacia Fine Chemicals ) 及び pGEM l (米国、 ゥイス コンシン州、 マジソンの Promega Biotec ) が含まれる。
原核宿主細胞用の発現べク夕一に普通に用いられるプロモータ一配列には、 t a cプロモーター、 ；3—ラク夕マーゼ （ぺニシリナーゼ） 、 ラク！ ^一スプロモー ター (Chang ら， Nature 275:615, 1978 ；及び Goeddelら， Nature 281:544, 1979) 等が含まれる。 特に有用な原核宿主細胞発現系は、 ファージ A PL プロモ —夕一及び c I 8 57 t s不耐熱性レプレッサ一配列を用いる。 λ Ρι_ プロモ一 ターの誘導体を取り込んでいるアメリカン ·タイプ'カルチャー ·コレクション から入手できるプラスミドベクターには、 プラスミド PHUB 2 (大腸菌株 J Μ B 9 (ATCC 37092) 内に存する） 及び pPL c 28 (大腸菌 R P I (A TCC 53082) 内に存する） が含まれる。
b s t遺伝子の場合は、 後述するように、 本遺伝子全体を含む約 2. 8 kbp の H i nd I I I断片が挿入されたプラスミドを有する大腸菌を得ることができ ず、 約 1. 6 ¾:13と約1. 2 kbの 2つの H i nd I I I断片としてクローニン グされたことから、 本遺伝子から生産する夕ンパク質が大腸菌にとつて致死的で ある可能性がある。 よって、 本遺伝子を発現させる場合、 制御可能なプロモー夕 —を使用し、 宿主が十分に増殖してから b s t遺伝子の発現が生じさせることが 好ましい。 制御可能なプロモーターの典型的な例は t a cプロモーターであるが 、 これに限定されるものではない。 さらに、 本発明者は t a cプロモー夕一を b s t遺伝子の翻訳開始コドンに対して、 少し離れた位置に存在させることにより (例えば数塩基分） 、 発現の制御が弱くなることも見いだしている。 プロモー夕 一と翻訳開始コドンの間の距離を適宜変化させることは慣用手段により行うこと ができる。
また、 組換え )3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を酵 母宿主細胞内で発現させてもよい。 好ましくはサッカロミセス属 （例えば、 S. セレピシェ） を用いるが、 ピキア （Pichia) 又はクルイべ口ミセス
(Kluyveromyces)の如き他の酵母の属を用いてもよい。 酵母ベクターは、 2 酵 母プラスミドからの複製起点の配列、 自律複製配列 （ARS) 、 プロモーター領 域、 ポリアデニル化のための配列、 転写終結のための配列、 及び選択可能なマー 力一遺伝子を含有することが多い。 酵母 α因子リーダ一配列を用いて、 組換え 3 一ガラクトシドー α 2， 6—シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせること もできる。 酵母宿主からの組換えポリぺプチドの分泌を促進するのに適する他の リーダー配列も知られている。 酵母を形質転換する方法は、 例えば Hinnen ら， Pro Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978に記載されている。
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、 組換え /3—ガラクトシド— α 2, 6一シアル酸転移酵素夕ンパク質を発現することもできる。 哺乳動物起源の株化 細胞系も用いることができる。 哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び 翻訳制御配列は、 ウィルスゲノムから得ることができる。 普通に用いられるプロ モーター配列及びェンハンサ一配列は、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス 2 等から誘導される。 SV40ウィルスゲノム、 例えば、 SV40起点、 初期及び 後期プロモーター、 ェンハンサー、 スプライス部位、 及びポリアデニル化部位か ら誘導される DN Α配列を用いて、 哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発 現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。 哺乳動物宿主細胞内で用いるための 発現べクタ一は、 例えば Okayama及び Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) の方法で構築することができる。
本発明の /3—ガラクトシドー α 2， 6—シアル酸転移酵素タンパク質を産生す る 1つの方法は、 /3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を コードする D N A配列を含む発現べク夕一で形質転換した宿主細胞を、 当該タン パク質が発現する条件下で培養することを含む。 次いで、 用いた発現系に応じて /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素タンパク質を培養培地又は細胞 抽出液から回収する。 組換え /3—ガラクトシド _ α 2 , 6—シアル酸転移酵素夕 ンパク質を精製する操作は、 用いた宿主細胞の型及び本発明のタンパク質を培養 培地中に分泌させるかどうかといつた要因に従って適宜選択されるであろう。 可溶性の] 3—ガラクトシド— α 2 , 6—シアル酸転移酵素
さらに、 本発明は一つの態様において、 可溶性 /3—ガラクトシドー α 2 , 6— シアル酸転移酵素タンパク質、 および当該タンパク質をコードする遺伝子を提供 する。 可溶性 ]3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 天 然の /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素タンパク質の細胞外ドメイ ンの全部又は一部を含むが、 そのポリぺプチドを細胞膜上に停留させる膜結合領 域を欠くものである。 例えば、 前述した S T 0 1 6 0タンパク質の場合、 ァミノ 酸残基 4 9 9 - 6 7 5の一部または全部を削除して可溶性にすることができる。 また、 可溶性 ]3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 合 成された当初は分泌を促進するために天然のまたは異種起源のシグナルペプチド を含んでもよいが、 このシグナルペプチドは細胞から )3—ガラクトシド— α 2 , 6 -シアル酸転移酵素夕ンパク質が分泌されるとすぐに切り離される。 膜結合領 域および またはシグナルぺプチド領域の全部または一部のいずれが削除された 可溶性タンパク質であっても、 /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素 活性を保持する限り、 本発明に含まれる。 すなわち、 可溶性 3—ガラクトシドー « 2 , 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 当該タンパク質が分泌されることを 条件として、 膜結合領域の一部又は細胞質領域の一部または他の配列を含んでも よい。 可溶性組換えタンパク質を宿主細胞で発現させる場合、 可溶性タンパク質 は細胞膜に結合しないので、 精製が容易となる。 また、 当該タンパク質を分泌さ せるシグナルペプチドは、 宿主由来あるいは、 異種起源のものでもよい。 配列番 号 1の 1一 1 5のアミノ酸配列は、 より好ましいシグナルペプチドの 1つである 可溶性タンパク質を含む、 短縮形の /3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転 移酵素タンパク質は、 所望の慣用的技術を用いて調製することができる。 例えば 、 配列番号 2の完全長クローン化 D N A断片を制限エンドヌクレアーゼによって 消化して短縮形の D N A断片を作成し、 ァガロースゲルでの電気泳動によって単 離することができる。 このとき、 制限エンドヌクレアーゼによる消化は、 天然に 存在する開裂部位において行ってもよく、 予め所定の制限エンドヌクレアーゼ開 裂部位を有するリンカ一をつないだ配列番号 2の D N A断片に対して行ってもよ い。 こうして単離された、 所定の短縮型タンパク質断片をコードする D N A配列 は、 周知のポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅することができる。 別の方法とし て、 既知の突然変異誘発法を用いて所定の位置に、 例えば細胞外領域の最後のァ ミノ酸のコドンのすぐ下流に、 停止コドンを挿入してもよい。
さらに別の方法では、 酵素処理 （例えば、 B a 1 3 1ェキソヌクレアーゼ） を 用いて D NA断片から末端ヌクレオチドを削除して所望の特定の末端を有する断 片に置き換えることもできる。 その場合使用するリンカ一としては、 市販品とし て、 B a 1 3 1消化により生成する平滑末端に連結することができ、 かつ、 制限 エンドヌクレア一ゼ開裂部位を含有するものがある。
あるいは、 組換えタンパク質の所定の点に N末端又は C末端を再構築するよう なオリゴヌクレオチドを合成して、 D NA断片に結合させることもできる。 この オリゴヌクレオチドは、 遺伝子操作の便宜のためコード配列の上流に制限ェンド ヌクレア一ゼ開裂部位を有してもよく、 また、 特定の宿主での発現のため N末端 に開始コドン （A T G) が存在してもよい。
可溶性夕ンパク質は、 得られた遺伝子により形質転換した宿主細胞を培養して その上澄液精製して得ることができるが、 収率を高めるためには、 菌体を破壊す ることが望ましい。 以下の実施例は、 本発明の特定の態様を説明するために示したものであって、 本発明の技術的範囲を限定するものではない。 以下の実施例の各工程では以下のような方法を採用した。
ペプチドのァミノ酸配歹 ϋの解近 プロテインシーケンサー： Model 476A (パーキンエルマ一社製） を用いて、 得 られたべプチドのアミノ酸配列を解析した。
プローブの合成
プローブは、 所定のアミノ酸配列の内、 対応するコドンの少ないアミノ酸を多 く含む領域を選定し、 そのアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に作製した 。 なお、 合成は日本バイオサービスに依頼した。
J TO 1 60の遺伝子ライブラリ一の作製
J TO 1 60をニュ一トリエントブロス （ォキソィド社製） で 30V, 1 6時 間培養した。 培養液を遠心分離 （4 : · 10分間 · 8, 000 r pm) し、 得ら れた 3 gの菌体から Saito - Miura法 (Preparetion of transforming
deoxyribonucleic acid by Phenol treatment. Biochem. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963) ) に従いゲノム DN Aを精製した。 精製したゲノム DNA50 gを S a u 3 A Iで部分消化し、 得られた遺伝子断片を λ DASH II/BainHI Vetor Kit (ストラタジーン社製） に連結した。 これを、 Gigapakll Packging Extracts (ストラタジーン社製） を用いてパッケージングして遺伝子ライブラ リーを調製した。
遺伝子ライブラリ一の増幅
調製した遺伝子ライブラリーを増幅するために宿主として Eschrchia col i XL-1 Blue MRA (P2) を用い， LB培地で 37t：、 1 50 r pmでー晚培養した 。 培養終了後、 培養液を 1 OmM塩化マグネシウム溶液で〇. D. o が 0. 5 となるように希釈した。 この希釈液 60 β \に上記の通り調製した遺伝子ライ ブラリーを 1 O w l加え、 37^で 1 5分間振とうした。 これに予め 48 に保 温した LB- トップァガロース 1 0mlを加えて撹拌した後に、 予め 37 に保温し た LB—プレートに重層した。 これを室温で固めた後に、 37 で 8時間培養し た。 重層した LB- トップァガロース上の宿主が完全に溶菌した後に、 5m lの S M緩衝液を加え 15分間放置した後に、 トップァガロースを S M緩衝液と共にスパ 一テルで回収した。 得られたトップァガロースを遠心分離 （4 ' 1 0分間 ' 8 , 000 r pm) し、 その遠心上清を増幅遺伝子ライブラリ一とした。
プローブの蛍光樓譴 合成したプローブを、 3 '-オリゴラベリングキット （アマシャム社製） を用い て蛍光標識した。
3—シヨン
サザンハイブリダイゼーシヨン用のァガロースゲルのレプリカは以下の方法で 調製した。
制限酵素で消化した DNAを TAE緩衝液を用いた 0. 8%ァガロースゲルで 電気泳動した。 泳動後、 ァガロースゲルを変性溶液 （0. 5MNa〇H> 1. 5 MNaC 1 ) 中に 15分間浸し、 ゲル中の DN Aをアルカリ変性きせた。 次に、 こめゲルを中和溶液 （0. 5MT r i s— HC 1 ( pH7. 5) 、 1. 5MNa C I) に 5分間浸し、 アルカリを中和した。 このゲルをゲルと同じ大きさに切つ た HybondN+ではさみ、 さらにキム夕オルではさんで室温で放置して Hy bondN+ に DNAを転写し、 ゲルのレプリカを調製した。 得られたレプリカ を 2XSSC緩衝液で洗浄し、 濾紙上、 室温で乾燥するまで放置した。 乾燥終了 後、 レプリカを 8 で 2時間べ一キングした。
コロニーハイブリダィゼーシヨン、 およびプラークハイブリダィゼーシヨン用 のコロニー、 およびプラークのレプリカは以下の方法で調製した。
適度な頻度でコロニーまたはプラークを形成させたプレー卜上に、 プレートと 同じ大きさに切った Hy bondN+ を乗せて、 コロニーまたはプラークを写し 取り、 レプリカを作製した。 なお、 レプリカ後のマス夕一プレートは 4でで保存 した。 作製したレプリカを変性溶液 （0. 5MNa〇H> 1. 5MNaC l) に 浸した濾紙上に 5分間放置して、 コロニー、 もしくはファ一ジをアルカリ変性さ せた。 このレプリカを中和溶液 （0. 5MTr i s— HC l ( pH7. 5) , 1 . 5 MNaC 1) に浸した濾紙上に 3分間放置して中和し、 さらに 2XSSC緩 衝液で洗浄した。 処理したレプリカを濾紙上、 室温で乾燥するまで放置した。 乾 燥終了後、 レプリカを 80でで 2時間べ一キングした。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 3' オリゴラベリングキット （アムシャム社製） のマニュアルに従い、 以下の方法で行なった。
レプリカをハイプリバッグに入れ、 このバッグに 30mlのハイブリダィゼ一 シヨン溶液を入れて恒温水槽中で 43で、 1時間振とうし、 平衡化した。 次に、 この溶液に蛍光ラベルしたプローブを 1 OngZmlとなるように加え、 さらに 恒温水槽中で 43 ：、 3時間振とうし、 アニーリングした。 以下の操作はバット 内で行なった。 アニーリング終了後、 レプリカを 0. l%Tr i t onX—10 0を含む 5XSSCで 5分間、 室温で洗浄した。 この操作は 2回繰り返した。 弓 I 続き l%Tr i t onX— 100を含む 1 XSSCで 15分間、 43 :で洗 浄した。 この操作も 2回繰り返した。 洗浄操作終了後、 レプリカを緩衝液 1 (0 . 1MT r i s -HC 1 ( pH7. 5) 、 1. 5 MN a C 1 ) で 1分間、 さらに 洗浄した。 次に、 ブロッキング溶液にレプリカを浸し、 室温で 3 D分間振とうし , ブロッキングした。 ブロッキング終了後、 緩衝液 1で 1分間洗浄した。 洗浄後 、 抗体溶液に浸し、 室温で 30分間振とうし、 抗体を結合させた。 次に、 これを緩 衝液 2 (0. 1 MT r i s -HC 1 ( H 7. 5) , 0. 4MNaC l) で 5分 間洗浄した。 この操作は 4回繰り返した。 洗浄終了後、 ディテクシヨン溶液を加 えて 1分間振とうし、 蛍光を発色させた。 このレプリカをキムタオルにはさみ、 かるく水分を除き、 フィルムカセットに置いた。 その上にサランラップを置いて さらにその上に X線フィルムをのせて 15分間放置して感光した。 X線フィルム は富士メディカルフイルムプロセサー （富士フィルム社製） で現像した。
b s t遺伝子断片を含むファージの単離
目的とするプラークをプレートから単離して SM緩衝液 （50 1) に懸濁し 、 4でで保存した。 SM緩衝液で抽出したファージは、 前述した遺伝子ライブラ リーの増幅方法に従って増幅した。
ファージ DNAの精製
増幅したファージ溶液から、 ファージ DNAを λ—プレップ DNA精製キット (プロメガ社製） を用いて、 以下の方法で精製した。
増幅したファ一ジ溶液 10m 1に、 ヌクレア一ゼミックス 40 1を加えて撹 拌した後に、 37でで 15分間放置し、 溶液中の核酸を分解した。 これにファー ジ沈澱剤 4ml を加えて氷中に 30分間放置し、 ファージ粒子を沈殿させた。 生成 した沈殿を遠心分離 （10, 000 r pm- 10分間 · 4 ） で回収し、 500 X 1のファージ緩衝液を加えて懸濁した。 さらに、 これを遠心分離 （15, 00 0 r pm · 5分間 · 4 ） して不溶解物を除去した。 得られた遠心上清に lm 1 の DN A精製溶液を加え、 ファージ粒子を構成する蛋白質を変性させてファージ DN Aを抽出すると同時に DN A精製溶液中に抽出された DN Aをレジンに吸着 させた。 この溶液をシリンジで DN A精製用カラムに添加し、 レジンのみをカラ ムにつめた。 このカラムを 2m 1の 80%イソプロピルアルコールで洗浄した後 に遠心 （12, 000 r pm · 20秒間 · 4で） してカラム中のレジンを乾燥し た。 このカラムに、 80でに保温した TE緩衝液を 100 w 1加えて遠心 （12, 000 r pm · 20秒間 · 4で） し、 レジンからファージ DNAを溶出した。 遺伝子断片のべク夕一への挿入
pUC 19を H i nd I I Iで 37 、 1時間切断した。 次に、 これを 65 、 1時間、 バクテリアルアルカりフォスファタ一ゼ （BAP) 処理し、 これをェ 夕ノール沈澱した。 得られた沈澱を 70%エタノールで洗浄し、 スピードバック で乾燥してエタノールを除き、 滅菌水に溶解した。
ファージ DNA (5 g) を H i nd i I Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳 動を行なった。 電気泳動後、 サザンハイブリダィゼーシヨンでプローブとハイブ リダィズする目的の遺伝子断片を含むゲル断片を切り出した。 切り出したゲル断 片からジーン一クリーン （フナコシ社製） を用いて DNAを抽出し、 エタノール 沈澱した。 得られた沈澱を 70%エタノールで^ £浄し、 スピードバックで乾燥し てエタノールを除き > 10 il の滅菌水に溶解した。
切り出した DNA (9 1 ) と、 H i n d I I Iで消化後 B A P処理した p U C 19 ( 1 μ. \ ) を混合し、 夕カラライゲーシヨンキット溶液 I (10 1) を 加え撹拌後、 16 :で一晩反応した。
形質転換
E. coli MV1184の形質転換は以下の方法で行なった。
一 80 で保存した E. coli MV1184 コンビテント細胞 （ 100 1) を氷中で 溶かし、 これにプラスミド DNA ( 1 0 u \ ) を添加し、 30分間氷中で放置した 。 これを 42Τ:で 1分間処理し、 その後 3分間氷中に放置した。 これに、 37 に 保温した LB培地を 900 t 1添加し， 1時間、 37 で振とうした。 振とう終 了後、 本溶液を、 LB—アンピシリン、 I PTG、 X— Ga 1寒天培地に塗布し 、 37t：、 16時間培養した。 プラスミド DNAの調製
目的とするコロニーを寒天培地から釣菌し、 LB—アンピシリン液体培地に植 菌して 3 7で、 16 時間振とう培養した。 培養終了後、 培養液を遠心分離 （15 , 000 r pm · 10分間 · 4で） し、 菌体を回収した。 得られた菌体から QIAGENミニプレパレーションキットを用いてプラスミド DNAを精製した。
DN A塩基配列の解析
ALFred DNAシークェンサ一を用いて、 プラスミド、 およびファージに揷 入された遺伝子断片の塩基配列を解析した。 プラスミドの場合、 塩基配列解析用 サンプルは、 c y 5ォ一トリードシークェンシングキット （フアルマシア社製） に添付されているプロトコ一ルに従って調製した。 また、 その塩基配列の解析は
、 ォ一トリ一ドシ一クェンシングキットを用いて行なった。 ファージの場合、 塩 基配列解析用サンプルは、 オートサイクルシークェンシングキット （フアルマシ ァ社製） に添付されているプロトコ一ルに従って調製した。 また、 その塩基配列 はオートサイクルシークェンシングキットを用いて行なった。
塩基配列解析のための電気泳動用ゲルには、 0. 5醒ロングレンジャーゲルを 用いた。 電気泳動は、 シークェンサ一に添付されてきた 0. 5匪ロングレンジャ 一ゲル用の電気泳動条件で行なった。
寄託
フォトバクテリゥムダムセ一ラ J TO 160は、 平成 6年 1 1月 24日付でェ 業技術院生命工学工業技術研究所に FERMBP— 4900として寄託されてい る。 実施例 1 b s t遺伝子の単離
ST0160タンパク質のアミノ酸配列を解析し、 これに基に作製したプロ一 ブを用いて J TO 160遺伝子ライブラリ一を探査し、 b s t遺伝子をクロー二 ングした。
I . b s t遺伝子の 5 ' 末端側断片の単離
a. ST0160タンパク質のトリプシン消化
完全精製した ST0160： 5 s (lml) をシリコン処理した 1. 5ml 容チューブに分取し、 100%TCA溶液 150 μ 1を加えた。 これを、 20分 間氷上で放置して酵素を沈殿した後に、 遠心分離 （4で · 15分間 · 15, 00 O r pm) して沈殿を回収した。 得られた沈殿を冷アセトンで 2回洗浄し、 これ をスピードバックで乾燥した。 これに 8 M尿素 +0. 4 M重炭酸アンモニゥム溶 液 25 1を加え、 さらに 45mMジチオスレィ 1 ル溶液 2. 5 w 1を加えて 5 O :で 15分間保温して蛋白質中のジスルフィド結合を切断した。 次に、 溶液 を室温に戻し、 l O OmMョ- ドアセトアミド溶液 2. 5 1を加え、 室温で 1 5分間放置して切断した SH基を修飾した。 これに超純水 70 1と塩化カルシ ゥムが最終濃度 5 mMとなる様に加え、 5 Uのトリプシンを含むトリプシン溶液 10 1を加えて 37で、 24時間放置し、 トリプシン消化反応を行なった。
b. ペプチドの分離
ST0160をトリプシンで消化して得られたぺプチドを以下の方法で分取し た。
ペプチド分離システムとして、 Sma r t S y s t em (フアルマシア製） を 用いた。 ペプチド分離用カラムは RPCC2 ZC SC 2. 1ノ10 (フアル マシア製） を用いた。 カラムに S TO 160トリプシン消化溶液を添加後、 溶液 1 (0. 06%TFA、 2%ァセトニトリル） と溶液 2 (0. 052 %TFA, 100%ァセトニ卜リル） を用いて、 溶液 1 ： 100%から開始し、 180分で 最終的に溶液 2が 50%となる様な濃度勾配でペプチドを溶出し、 分取した。
c ST0160タンパク質のアミノ酸配列の分析
ST0160の N末端アミノ酸配列と、 本酵素をトリプシン分解して得られた ぺプチドのアミノ酸配列、 すなわち本酵素の内部のアミノ酸配列と推定される 9 個の配列、 計 10個の ST0160の部分アミノ酸配列を明らかにした。 得られ たアミノ酸配列を、 以下の表 1に示す。
(a) XNSDNTS LKETVS SXXAXV (N末端配列）
(b) DYLGS S AKK (内部配列）
(c) FVSWKI VN (内部配列） (d) ANYLAGTS PDAPK (内部配列）
(e) ETVXXNS AVVVETETY (内部配列）
(f) YNWHK (内部配列）
(g) QA I S FDFVAPELK (内部配列）
(h) QL I H I I QAK (内部配列） なお、 N末端アミノ酸配列の解析結果によると、 N末端のアミノ酸残基は解析 不能であり、 この残基が修飾を受けている、 もしくは Cy s残基である可能性が 考えられた。
d. プローブの合成
得られたアミノ酸配列の内、 配列（d) (配列番号 1のアミノ酸残基 258— 2 70に相当） に対応するように、 以下の配列：
5' -GCIAAITAIITIGCIGGIACIIIICCIGAIGCICCIAA- 3' (配列番号 3) を有するプローブ Aを作製した。 なお、 Iはイノシンであり、 アデニン、 ゥラシ ルおよびシトシンを認識して対合を形成することが可能である。
e. ゲノム DNAのサザンハイブリダィゼーシヨン
P. d ams e 1 a J T 0160のゲノム DN Aを H i n d I I Iで消化し たものを対象として、 dで作製したプローブ Aを用いてサザンハイブリダイゼー シヨンを行なった。 その結果、 約 2. 8 kb pの DNA断片が強くハイブリダィ ズした。 そこで、 ゲノム DNAを H i nd I I Iで消化してァガロースゲル電気 泳動を行ない、 2. 8 kbpの DN A断片を含むゲル断片を切り出し、 この断片 から DNAを抽出した。 抽出した DNAと H i nd I I Iで消化後 BAP処理し た pUC 19とを結合した。 得られたプラスミドで E. c o l i MV 1 184を 形質転換した。 生じたコロニ一のコロニーハイブリダイゼ一シヨンを行なつたが 、 意外なことにプローブ Aとハイブリダイズするコ口二一は得られなかつた。
f . b s t遺伝子断片を含むと考えられるファージの単離
上記 dのコロニーハイブリダイゼーシヨンでは目的とするコロ二一が得られな かったため、 次に、 P. d ams e l a J T 0160のゲノム DNAの遺伝子 ライブラリ一を対象としてプロ一ブを用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを 行なった。 その結果、 b s t遺伝子断片を含むと考えられるファージが 7株得ら れた。 これらのファージをそれぞれ増幅してファージ DN Aを調製し、 得られた ファージ DNAを H i nd I I Iで消化したものを対象として、 プローブ Aを用 いてサザンハイブリダィゼ一ションを行なった結果、 すべてのファージで約 1. 6 k b pの大きさの DNA断片が非常に強くハイブリダィズした。
g. サブクローニング
7株のファージから 1株を選定し、 そのファージ DNA5/ gを H i n d I I Iで消化して、 ァガロースゲル電気泳動を行なった。 電気泳動後、 ァガロースゲ ル中の約 1. 6 kb pの DNA断片を含むゲル断片を切り出し、 このゲル断片か ら DNAを抽出した。 抽出した DNAと、 H i n d I I Iで消化後 BAP処理し た pUC 19とを結合した。 得られたプラスミドで E. c o l iMV1184を 形質転換した。 生じたコロニーのコロニーハイブリダィゼ一ションをプローブ A を用いて行なった結果、 強くハイブリダィズする 3コロニーを得た。 この 3株を それぞれ寒天培地から釣菌し、 LB—アンピシリン液体培地に植菌して 37でで 16時間振とう培養した。 得られた培養液から菌体を遠心分離によって回収し、 その菌体からプラスミド DNAの調製を行なった。 得られたプラスミド DNAを H i nd i I Iで消化し、 ァガロースゲル電気泳動を行なった。 その結果、 いず れの株から精製したプラスミドにも約 1. 6 k b pの DNA断片が挿入されてい ることが確認できた。 また、 この電気泳動したゲルのサザンハイブリダィゼ一シ ヨンをプロ一ブ Aを用いて行なった結果、 この約 1. 6 k b pの DNA断片は強 くハイブリダィズした。 以上の結果から、 これらのプラスミドに挿入された約 1 . 6 k b pの DNA断片に b s t遺伝子断片が含まれると考えられた。
h. b s t遺伝子の 5' 末端側断片の塩基配列の解析
上記 gで得られたプラスミドに挿入されている約 1. 6 kb pの DNA断片の 塩基配列を、 ALF r e dDNAシークェンサ一を用いて解析した （図 7および 8の塩基配列マイナス 361から 1244) 。 得られた塩基配列をアミノ酸配列 に翻訳したところ、 片方の H i nd I I Iから数えて 396番目以降の ATG ( Me t残基） から始まり、 もう片方の H i nd I I I以降まで続く、 414個の アミノ酸残基からなる長いオープン · リーディング 'フレーム （ORF) が存在 していた。 この ORFのアミノ酸配列と、 cで得られた ST0160のアミノ酸 配列と比較したところ、 N末端アミノ酸配列を含む 8個のアミノ酸配列が確認で きた。
以上の結果から、 得られた ORFが b s t遺伝子の 5' 末端側であると考えら れ、 このプラスミドを pB STNと命名した。
なお、 ST0160の分子量が 60 kDaであることから、 ST0160タン パク質の C末端側の少なくとも 200アミノ酸残基をコードする、 b s t遺伝子 3 ' 末端側断片をさらにクローニングする必要が有ると考えられた。
なお、 ST0160の N末端アミノ酸配列の 2番目の As n残基から始まる配 列は得られた ORFの 17番目からの配列と一致しており、 cで推定した様に S TO 160の N末端アミノ酸配列は Cy s残基から始まることが明らかとなった 。 また、 得られた QRFの疎水性 ·親水性を解析したところ、 本 ORFの N末端 側には疎水性の非常に高い領域が存在していた。 さらに、 この OR Fの始めの M e t残基の直後には正電荷を持つ Ly s残基が 2残基存在していた。 これは典型 的なシグナル配列の構造であったことから、 この Me t残基から 16番目の Cy s残基の前までの 15個のアミノ酸残基からなる配列が S TO 160のシグナル 配列であると推定された。
I I. b s t遺伝子の 3 ' 末端側断片の単離
a b s t遺伝子の 3 ' 側下流の塩基配列の決定
pBSTNに挿入された DNA断片の塩基配列を基に、 以下の塩基配列： 5' -GGGGGGGAAACGAAAGAGTATTATG -3' (配列番号 4)
(配列番号 2の塩基配列 1087— 1 11 1)
5' -ATTTTTCAAGGGGCATCCTGCTGG- 3 ' (配列番号 5)
(配列番号 2の塩基配列 1 188— 1211)
を有する 2種類のシークェンス用プライマ一を作製した。 これらのプライマ一を 用い、 I. fで得られた b s t遺伝子断片を含むと考えられたファージ DN Aの シークェンシングを行った。 その結果、 pBSTNの H i nd i I Iの 3' 側下 流の約 150 b pまでの塩基配列を決定することができた。
b. b s t遺伝子の 3' 末端側断片のクロ一ニング 得られた塩基配列を基にさらに、 以下の塩基配列：
5' -AAGATTTCATTTGAGGT - 3 ' (配列番号 6)
(配列番号 2の塩基配列 1270— 1286)
を有するプローブ B作製した。 ファージ DNAを H i n d I I Iで消化し、 ァガ ロースゲル電気泳動を行い、 蛍光標識したプローブ Bを用いてサザンハイブリダ ィゼーシヨンを行なった。 その結果、 約 1. 2 kbpの遺伝子断片がプローブ B と非常に強くハイプリダイズした。
そこで、 ファージ DNA5 を H i nd I I Iで消化し、 ァガロースゲル電 気泳動を行ない、 泳動後、 ァガロースゲル中の 1. 2 kb pの DNA断片を含む 部分を切り出し、 ゲルから DNAを抽出した。 抽出した DNAと、 H i nd i I Iで消化後 BAP処理した pUC 19を結合し、 得られた DNAで E. c o l i MV1184を形質転換した。 生じたコロニーのコロニーハイブリダィゼ一ショ ンをプローブ Bを用いて行なつたところ、 強くハイブリダィズした 5コロニーを 得た。
得られたコロニーをそれぞれ寒天培地から釣菌し、 LB—アンピシリン液体培 地に植菌して 37でで 16時間振とう培養した。 得られた培養液から菌体をそれ ぞれ遠心分離 （4 · 15, 000 r pm · 30秒間） により回収し、 菌体から プラスミド DNAを精製した。 得られたプラスミド DNAを H i n d I I Iで消 化し、 ァガロースゲル電気泳動を行なったところ、 いずれのコロニーから精製し たプラスミド DN Aにも約 1. 2 k b pの DN A断片が揷入されていることが確 認できた。 また、 このァガロースゲルのサザンハイブリダィゼーシヨンをプロ一 ブ Bを用いて行なった結果、 この約 1. 2 k b pの DNA断片全てがプローブ B と強くハイブリダィズした。
b. b s t遺伝子断片の C末端部分の DNA塩基配列の解析
上記 aで得られた約 1. 2 kbpの DNA断片の塩基配列を、 ALF r e dD NAシークェンサ一を用いて解析した。 得られた塩基配列をァミノ酸配列に翻訳 したところ、 片方の H i nd I I Iから 262個のアミノ酸残基からなる長い O RFが存在していた。 なお、 本 ORFの 3' 側下流には 10 b pからなるステム と 7 b pからなるループで構成されるステムアンドル一プ構造が存在していた。 以上の結果から、 本遺伝子断片の〇RFが b s t遺伝子の構造遺伝子の C末端 側 （図 7および 8の塩基配列 1239— 2348) であると考えられ、 このプラ スミドを pBSTCと命名した。
I I I. J TO 160の持つ DNAメチル化酵素
上記 l bで示したとおり、 H i n d I I Iで消化した J TO 160のゲノム D NAを対象としてサザンハイブリダィゼ一シヨンを行なった結果、 約 2. 8 k b Pの DNA断片がプローブ Aと強くハイブリダィズした。 この大きさは、 pBS TNと pBSTCに挿入された遺伝子断片を合わせたもの、 すなわち b s t遺伝 子の全塩基配列の大きさに等しい。 これは、 b s t遺伝子内に H i n d I I I部 位 （AAGCTT) が存在するにも関わらず、 ゲノム DNAでは H i nd I I I が切断されなかったことを意味する。 その理由として、 J TO 160の菌体内で ゲノム DNAがメチル化等の修飾を受けたために H i nd I I Iで切断できなか つたと考えられた。 b s t遺伝子全長の塩基配列を解明した結果、 この b s t遣 伝子の内部に存在する H i n d I I Iの配列は外側の塩基も含めて G A AG CT ： LCであり、 パリンドローム構造を持っていた。 制限酵素部位やメチル化酵素部 位の配列は、 そのほとんどがパリンドロームであり、 この GAAGCTTCとい う 8 bpの配列は、 J TO 160の持つ DNAメチル化酵素の認識配列であると 推測された。 なお、 b s t遺伝子の両端に存在する H i n d I I I部分の配列は AAGCTT Aと A AAGCTTであり、 パリンドローム配列ではないためにこ れらの部位はメチル化されず、 H i nd i I Iで切断されたと考えられる。 現在、 6 bpの塩基配列を認識する制限酵素の存在が数多く知られており、 遺 伝子工学的研究を行なう際に頻繁に使用されている。 しかしながら、 特に最近は 、 より長いヒトの遺伝子を扱うことが多くなつたため、 8 bpの配列を認識する 制限酵素が要望されている。 ところが、 現在市販されている 8 b pの配列を認識 する制限酵素は No t Iのみである。 一方、 多くの細菌が、 生体防御の機構とし て同じ配列を認識する DN Aメチル化酵素と制限酵素を合わせ持つことが知られ ている。 J TO 160が 8 b pの配列を認識する DNAメチル化酵素を持つと考 えられ、 したがって本菌がこの配列を切断する制限酵素も合わせ持つ可能性が有 ると推定された。 この 8 b pの配列を認識する新規制限酵素の開発は非常に有益 であると期待される。
I V. シァリルモチーフ
現在までに、 主として動物由来のシアル酸転移酵素がいくつか精製され、 クロ —ニングされている。 動物由来のシアル酸転移酵素のアミノ酸配列中には、 その 起源、 種類を問わず、 相同性の高い領域が 2ケ所存在し、 シァリルモチーフと呼 ばれている。 その一方は、 すべてのシアル酸転移酵素の糖受容体である CMP— シアル酸の結合部位であることが明らかにされている。 今回得られた S TO 16 の推定アミノ酸配列と、 ラット由来の /3—ガラクトシド α— 2, 3シアル酸転移 酵素のアミノ酸配列には相同性の高い領域は見られなかった。 また、 前記シァリ ルモチーフの配列と相同性の高い領域も見い出せなかった。 このことは、 ST0 160の起源と、 現在までに主に動物から得られているシアル酸転移酵素と起源 が異なることを示すものと考えられる。 本酵素の基質結合部位、 特に CMP—シ アル酸の結合部位については非常に興味深く、 その解析は有益であると期待され る。 実施例 2 組換え S Τ 0160夕ンパク質の発現
本実施例では、 pBSTNと pBSTCに分けてクロ一ニングされた遺伝子断 片に含まれる長いオープンリーディングフレーム （ORF) が、 Pho t ob a c t e r i u m d ams e l a J T 0160由来のシアル酸転移酵素 016
0 (ST0160) をコードすると遺伝子、 すなわち b s t遺伝子であることを 証明する。 そのために、 本遺伝子を発現ベクターに挿入し、 大腸菌において発現 し、 その遺伝子産物を解析する。 また、 構築した S T O 160生産系を用いて、 本構造遺伝子の C末端に存在する膜結合に関与すると推定される領域の機能を解 析する。
1. 発現プラスミドの作製
b s t遺伝子のクローニングの際に、 サザンハイブリダィゼーシヨンで本遺伝 子を含むと推定された 2. 8 13 の？！ i n d I I I断片が pUC 18に挿入で きず、 1. 6 kbpと 1. 2 kb pの 2つ H i nd I I I断片としてクロ一ニン グできたことから、 本遺伝子が大腸菌にとつて致死遺伝子であると推定された。 そこで、 2つに分けてクローニングされている b s t遺伝子の連結を、 制御可能 な t a cプロモ一夕一の制御下で行うこととした。
発現べクタ一作製の基となるベクターとして pAQ Iを改変した pAQNを使 用した。 pAQ Iの構造を図 1に示し、 pAQNの構造を図 2に示す。 本プラス ミドは t a cプロモーターの直後の E c oR Iと r rnBTl T 2夕一ミネ一夕 —の直前の H i n d I I I間にアクアライシン Iをコードする遺伝子 （a q u I 遺伝子） を有する。 a q u I遺伝子中には本プラスミド中でユニークな制限酵素 部位が、 Ec oR Iと H i nd i I Iを含めて 10個存在しており、 遺伝子操作 を行う際に有利である。 また、 本プラスミドは t a cプロモータ一を制御する 1 a c I q をプラスミド中に持ち、 通常の系よりも t a cプロモー夕一をより強力 に押さえるため、 本実施例の目的に適していると考えた。
pAQ Iは、 特開平 2— 92288号にその構築方法が記載されており、 また 、 生命工学技術研究所に FERM BP 2305として寄託されている。
pAQ Iの pAQNへの改変は Mutan- K (宝酒造社製） を用い、 次の手順によ り行った。
1. 37"Cで 1夜培養した BP2305を QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN社) を用い、 pAQIを抽出した。
2. pAQIを Xholと Hindlll で切断し、 ライゲーシヨンした。 （pAQIAXH)
3. pAQIAHのアクアライシン遣伝子の EcoRI-Xbal部位切り出し、 M13即 18 の EcoRI- Xbalサイトへ揷入した。 （pMBALl)
4. pMBALlを以下のプライマ一により、 ポイントミューテシヨン し、 ァク ァライシン遺伝子の EcoRI-Xbal部位に AccIII, BamHl.Bglll を挿入し、 さらに Xmalll, Kpnlを消去した。 （pMBALl ΔΧΗ)
AccIII揷入用 （塩基番号 141)
5' -CCTGGATGATCCGGAAGCTATCC- 3' (23 mer)
BamHI 揷入用 （塩基番号 503)
5' - TGACACCGGGATCCGCACGA- 3' (20 mer)
Bglll 挿入用 （塩基番号 966)
5' -TAGTTGCGTAGATCTCTTCGCC- 3' (22 mer) Xmalll消去用 (塩基番号 531)
5' - AGTTCGGCGGACGGGCCCG- 3' (19 mer)
Kpnl 消去用 （塩基番号 592号）
5' -ACGGCCACGGGACCCATGTGG- 3' (21 mer) アニーリング温度は、 65度 15分、 37度 15分で行った。
5. pMBALlAXHの EcoRI- Xbal部位を切り出し、 pAQI ΔΗのアクアライシン遺 伝子の EcoRI-Xbal部位切り出したプラスミドの EcoRI- Xbalサイ卜へ挿入した。 （ pAQN) b s t遺伝子発現プラスミド pEBSTの構築は、 pBSTNと pBSTCに 含まれる遺伝子断片がいずれも H i nd I I I断片であることから、 次に述べる とおり、 方向性を持たせてこれらの断片を pAQNの t a cプロモー夕一の下流 に揷入した。 なお、 この際に b s t遺伝子の持つ本来のプロモー夕一は完全に切 除した。
簡単に述べると、 まず、 pAQNの制限酵素部位は t a cプロモーター直後か ら順番に E c oR I、 Bg l I I、 Xba I、 H i nd I I Iと並んでいるのを Ec oR I、 H i nd i I I、 Xb a Iの順に改変した。 次に、 pBSTCに含 まれる ORFの下流に存在する Hp a I部位 （図 7および 8の塩基配列 2201 - 2206) を Xba lに改変し、 この C末端部分を含む〇 R Fを、 改変 pAQ Nに Xb a I -H i nd I I Iで挿入した。 次に、 p B S TNに含まれる OR F の N末端に存在する Me tの上流に Ec oR I部位を挿入し、 この N末端部分を 含む ORFを C末端部分を含む ORFを挿入した p AQNに E c oR I -H i n d I I Iで挿入し、 発現プラスミド pEBSTを完成した。
なお、 C末端領域を欠失した変異体も同様にして作製した。
以下、 より詳細に説明する。
a. 材料
発現ベクター作製のための材料は以下のものを使用した。
宿主： E. c o 1 i MV 1 184,
プラスミド：
M 13mp 18 (B i o— Rad) ， M 13mp 19 (B i o— Rad) pUC 18 (宝酒造） ， pUC 19 (宝酒造）
pBSTN, pBSTC
発現べクタ一：
pAQN
試薬：和光純薬
遺伝子工学用試薬および K i t ：宝酒造
但し、 部位特異的異変 K i tは B i o—Radのものを使用した
リンカー：
H i n d I I Iリンカー
5' -CCAAGCTTGG- 3' (配列番号 7) (宝酒造： 4760 A) Xb a Iリンカー
5 ' 一 CTCTAGAG - 3' (配列番号 8) (宝酒造： 4693 A) 合成オリゴヌクレオチド：
プライマ一 BST01
5 ' -TTATGTGAATTCGCTTAATATG- 3 ' (配列番号 9) プライマ一 BST02
5 ' -TTTTTATGTGAATGTGGAATTCATGAAGAAAATACTGA- 3 ' (配列番号 10 ) プライマー BST03
5 ' -CAAAACAATTACTGATTAATAGTGAATTGGCGATGTGGCAG- 3 ' (配列番号 1 1 ) プライマ一 B ST 04
5 ' -TGTTCTGTTCTGGGCTTAGTGATAAGATCTCTCGATGGAAGTTGCC- 3 '
(配列番号 12) b. 手順
j)AQNの改良 （図 3) まず、 p AQNを H i n d I I Iと Xb a Iで切断し、 クレノー断片処理によ り平滑化し、 そのまま L i g a t i onした。 この処理により、 H i nd I I I が消失し Xb a Iのみ復活した （図 3の pAQNAXH) 。 この改良工程におけ る塩基配列の変化の様子を下に示す。
TCTAGA AAGCTT AGATCT TTCGAA
Xb a I H i n d I I I i切断 ·平滑化 1切断 ·平滑化
TCTAG AGCTT AGATC TCGAA
Ϊライゲ一シヨン
TCTAGAGCTT AGATCTCGAA
X a l 次に、 pAQNAXHを Bg l I Iで切断し、 クレノー断片処理により平滑化 した。 続いて H i n d I I Iリンカ一を加えてライゲーシヨンした。 この処理に より Bg 1 I I部位が H i nd I I I部位に置き換わつ （図 3の pAQN— E HX) 。
p B STCの改変と P AQN— EHXへの揷入 (図 4)
pBSTCに挿入されている STO 160の C末端側を含むと考えられている 1. 21^ の？1111011 1 1断片を Ml 3m 18のクローニング部位の H i nd I I Iに揷入した。 この際、 3' 末端がクロ一ニング部位の Ec oR I側 （ 即ち、 Xba l側） の向きに揷入されているものを選択した （図 4の pMBST C) 。
次に pMBSTCを Hp a Iで切断し、 クレノ一断片処理により平滑化し、 X b a Iリンカ一を加えてライゲ一ションした。 この処理により Hp a Iが Xb a Iに置き換わった （図 4の pMBSTC— HX) 。
pMB STC— HXを Xb a Iで切断し、 そのままライゲ一シヨンした。 この 処理により余分な Xb a I断片 （H i nd I I I部位を含む） が切除された （図 4の pMBSTCAX) 。
pMBSTCAXの H i nd l l l—Xb a l断片を p AQN— EHXの H i nd I I I -Xb a I部位に揷入し、 pEBSTCを作製した。
STO 160の膜結合領域を削除した改変体の作製：なお、 S T 0160の膜 結合領域と推定されている領域 （以下、 「M」 と言う） 、 および p ho Uと相同 性の高い領域 （以下、 「P」 と言う） の機能および発現に及ぼす影響を解析する ことを目的として、 これらの領域を欠失した改変体も併せて作製した。
具体的には、 図 4中の pMBSTCAXに対して部位特異的変異法を用い、 〇 RFのアミノ酸残基 539位のロイシン （プライマー B ST 03を使用） 、 およ び 498位のァスパラギン酸 （プライマ一 BNST04を使用） をコードする塩 基配列部分を各々終止コドンに改変した。 得られたプラスミドは各々 pMBST CAC 137および pMB STCAC 178である。 この際、 完全に翻訳を終止 するために、 3種類の終止コドンを挿入し、 さらに改変の簡易確認のために制限 酵素部位を併せて挿入した （pMBSTCAC 137には P s hB I、 pMBS TCAC 178には Bg 1 1 1) 。
以下； pMBSTCAC 137および pMBSTCAC 178は、 上記 pMB STCAXの場合と同様にして、 H i nd i I I -Xb a I断片を p AQN— E HXの H i nd I I I -Xb a I部位に揷入し、 pEBSTを作製した （それぞ れ pEBSTCAC 137および pEBSTCAC 178) 。
pB STNの改変と pEB STCへの揷入による発現ベクターの構築 (図 5) 実施例 1の I hで作製された pBSTNに揷入されている STO 160の N末 端側を含むと考えられている 1. 6 k b pの H i n d I I I断片を、 Ml 3mp 19のクローニング部位の H i n d I I Iに挿入した。 この際、 N末端がクロー ニング部位の Ec oR I側の向きに挿入されたものを選択した （図 5の pMBS TN) 。
次に、 部位特異的変異法を用いて pBSTNの ORF開始部位の上流に Ec o R I部位を挿入した。 この際、 Ec oR I部位とメチォニンをコードするコドン ATCとの間を 0塩基としたもの （プライマ一 BST02を使用： pMBSTN -E 0) と 7塩基としたもの （プライマ一 BST01を使用： pMBSTN— E 7) の 2種類を作製した。 pMBSTN— E 0を pAQNに挿入した場合、 SD 配列から ATGまでの距離は 9塩基となり、 pMBSTN— E 7の場合には 16 塩基となる。 pMBSTN—EOで、 SD配列から ATGまでの距離を 9塩基と したのは、 その場合に発現効率が最も良くなると考えられているためである。 ま た、 pMBSTN— E7で、 前述したように b s t遺伝子が大腸菌にとって致死 遺伝子である可能性が考えられたため、 発現の程度を少し弱めたものを得るため に SD配列から ATGまでの距離を若干大きくした。
pMBSTN— E0とpMBSTN— E7を各々Ec oR Iで切断し、 そのま まライゲーションした。 この処理により余分な E c oR I断片 （H i nd i I I を含む） が切断された （図 5の pMB STN— E 0 ΔΕと pMB STN— E 7 Δ E) 。
pMBSTN— Ε0ΔΕ、 および p B S ΤΝ— Ε 7 Δ Εの E c o R I断片を ρ EBSTCの Ec oR I— H i nd i I I部位に揷入し、 発現べクタ一 pEBS Tを構築した （図 6)
pEBSTCAC 137および p EBSTC AC 178についても同様に挿入 を行い、 以下の表 2に示す 6種類の S TO 160発現べクタ一を構築した。 表 2
pEBST—E0=pBSTN—E0ΔE+pEBSTC=A2シリーズ pEBST-E7=pBSTN-E7AE+pEBSTC=Alシリーズ
EBST-EOAM=pBSTN-EOAE+pBSTNCAC 137=B 2 シリーズ
pEBST - E7AM=pBSTN - E7AE+pBSTNC厶 C 137=B 1 シリーズ
pEBST - ΕΟΔΡ-pBSTN - ΕΟΔΕ+pBSTNC厶 C 178=C2 シリーズ pEBST-E 7AP=pBSTN-E 7AE+pBSTNCAC 178=12 シリーズ
I I . 発現の実施例
(1) 形質転換、 および菌株の保存
一 80でで保存した E. coli MV118 コンビテント細胞 （100 1 ) を氷中で 溶かし、 これに表一 2に示した 6種類の発現ベクター （10 x l) を添加し、 30 分間氷中で放置した。 これを 42でで 1分間処理し、 その後 3分間氷中に放置した 。 これに、 37 :に保温した LB培地を 900 μ 1添加し、 1時間、 37Τ:で振 とうした。 振とう終了後、 本溶液を、 LB—アンピシリン、 I PTG、 X— Ga 1寒天培地に塗布し、 37 ：、 16時間培養した。
(2) 培養
得られた形質転換体 （6種類） を、 それぞれ LB—アンピシリン一 IPTG液体培地 で、 30 、 150 rpmで振とう培養し、 菌体の増殖とシアル酸転移活性を測定 した。 なお、 菌体の接種は、 培地 0.5%量の（1) の方法で調製したグリセロールス トツクを培地に添加することにより行った。 また、 培養液中のアンピシリン濃度 は 100mg/l、 IPTG濃度は 0. 02mM とした。 菌体の増殖は培養開始後、 培養 液を経時的にサンプリングして 66 Onmの吸光度を測定することによりモニタ一 した。
その結果、 A, B, C シリーズいずれの発現ベクターを含む E. coli MV1184 形質転 換株いずれも、 長いラグタイムの後に菌体の増殖が認められた。 それぞれの菌体 (A2, B2, C2) の増殖を図 9に示す。 図 9に示したように、 C シリーズ〉 Bシリーズ >Aシリーズの順番で増殖は速かった。
菌体からの粗酵素の調整は、 培養液から遠心分離で菌体を集めて、 0.2% Triton X- 100 を含む 20mMカコジレート緩衝液 （pH 5.0) に菌体を懸濁し、 これ を超音波処理して菌体を破砕して粗酵素とした。 表 3に示すように酵素生産量も OB>A の順であった。
シァリルトランスフェラ一ゼ活性は、 供給基質である CMP— 〔4， 5, 6, 7, 8, 9—14 C〕 一Ne uAcから受容基質であるラクトースに転移した、 〔 4, 5, 6, 7， 8, 9一14 C〕 —N e uAcを測ることにより測定した。 標準 反応混合物は、 70nmolの CMP— 〔4， 5， 6, 7, 8， 9一'4 C〕 — Ne u Ac (642cmp/nmol) 、 1. 25 /zmol のラクト一ス、 並びに 0. 02%Tr i t on X— 100を含む 2 OmMカコジレートナトリウム緩衝液 （pH5. 0)
25^1 中の酵素溶液からなる。 酵素反応は、 30 で 3分間行った。 全ての 測定は、 二重に行った。 反応後、 反応混合物を 5 mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 6. 8) で 2mlに希釈し、 Dowe x l X8 (リン酸型） のカラム （0. 5 X2 cm) に充填した。 抽出物 （2 ml) をシンチレ一シヨンバイアルに直接集め、 計測 を行った。 抽出物中の、 受容基質に転移した 〔4, 5， 6, 7, 8, 9—14 C〕 — Ne uAcの放射活性を液体シンチレーシヨンカウン夕一で測定し、 転移した
〔4, 5, 6, 7, 8, 9— l4C〕 — Ne uAcの量を測定した。 1単位 （U) は、 上述した条件下で 1 //mo 1 のシアル酸を 1分間にラクトースに転移する酵素 の量と定義した。 表 3
A1シリーズ 43 units/L
A2シリーズ 66 uni ts/L
B1シリーズ 74 units/L
B2シリーズ 112 units/L
C1シリーズ 91 units/L
C2シリーズ 240 units/L
(3) 酵素反応生成物の同定
上記 (2) に記載した方法で調製した粗酵素を、 イオン交換カラム （Q—セファ ロース， フアルマシア） 、 ハイドロキシアパタイト （高研製） で部分精製した酵 素を用いて、 糖受容体基質としてピリジルァミノ化ラクト一ス、 糖供与体基質と して CMP-NeuAc を用いて酵素反応を行い （30t：、 6 時間） 、 反応生成物を反応終 了後、 100でで 2分間処理することにより酵素を失活させた。 その後、 HPL Cで反応生成物の分析を行った。 HPLCシステムとしては Shimazu LC-10 (島津製） 、 カラムとしては Takara PALPAK Type R (宝酒造製） を用い、 酵素を失活させた反応液 1 Owl を、 0. 15% n—ブ夕ノールを含む 10 OmM酢酸—トリェチルァミン （pH5. 0) で 平衡化したカラムに注入した。 ピリジルァミノ化糖鎖の溶出には溶出液 A (10 0 DiM酢酸ートリエチルァミン、 pH5. 0) 及び溶出液 B (0. 5%、 n—ブタノ ールを含む 10 OmM酢酸—トリェチルァミン、 pH5. 0) を用い、 30〜； 100 %溶出液 Bの直線濃度勾配法 （ 0 ~ 35分） 及び 100 %溶出液 B ( 35〜 50 分） により、 順次ピリジルァミノ化糖鎖の溶出を行い、 lml/minの流速、 40 のカラム温度の条件下、 蛍光 （Ex ： 320nm、 Em： 40 Onm) を検出するこ とによりピリジルァミノ化糖鎖を検出した。
その結果 （図 10) 、 いずれの粗酵素を用いて酵素反応を行った場合にも、 ST0160を酵素として反応を行った場合と同じリテンションタイムをもつ反応生成 物のピークが検出されたことから、 6 種類の粗酵素はいずれもシアル酸をガラク ト一スの 6位に a 2、 6で転移していると判断した。
(4) 可溶化体酵素
一般に、 100, 000 xg, lhrで遠心分離を行い、 その遠心上清に存在するタンパ ク質は可溶化されていると定義される。 そこで、 C2シリーズの菌株を LB—アンピ シリン一 IPTG液体培地で、 30t：、 15 Orpmで振とう培養し、 培養終了後、 遠 心分離を行い、 菌体を集め、 20mMカコジレート緩衝液 （pH 5.0) に菌体を懸濁し 、 これを超音波処理して菌体を破砕して粗酵素とした。 この菌体破砕液を 4 、 100, 000 xg, lhrで遠心分離を行い上清を集め、 この遠心上清のシアル酸転移活 性を測定した。 その結果、 この遠心上清には、 （2) で示した酵素生産量の約 50 % (12 Ounis/L) の酵素が存在した。 一方、 Al, A2 シリーズの菌株を用いて同 様の検討を行ったところ、 界面活性剤が抽出緩衝液に含まれていない場合には、 100, 000 xg, lhrで遠心分離を行って得られた遠心上清にはほとんど酵素は存在 しなかった。 つまり、 本酵素をコードする遺伝子の C末端側が膜結合に関与して いるものと考えられ、 この部分を欠損させたタンパク質を生産することで、 可溶 化体のシアル酸転移酵素を生産することが可能となった。 (5) C 2シリーズ形質転換体培養上清液のシァリルトランスフエラ一ゼ活性 前記 C 2シリーズの菌株を LB—アンピシリンー I PTG液体培地で 30で 1 5 Orpmで振とう培養し、 OD60。 が 2. 8となったとき 97 Oml分取し、 シァ リルトランスフェラーゼ活性を測定した。
シァリルトランスフェラーゼ活性は、 供給基質である CM P— 〔4, 5, 6, 7, 8, 9— 14 C〕 一 Ne uAcから受容基質であるラク！ ^一スに転移した、 〔 4, 5, 6, 7, 8, 9— 14C〕 一 Ne uAcを測ることにより測定した。 標準 反応混合物は、 70nmolの CMP— 〔4, 5, 6, 7, 8, 9一14 C〕 -Ne u Ac (642cmp/nmol) 、 1. 25 ^mol のラクトース、 並びに 0. 02%Tr i t o n X— 100を含む 2 OmMカコジレートナトリウム緩衝液 （pH5. 0)
25 i l 中の酵素溶液からなる。 酵素反応は、 30 で 3分間行った。 全ての 測定は、 二重に行った。 反応後、 反応混合物を 5 mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 6. 8) で 2mlに希釈し、 Dowex lX8 (リン酸型） のカラム （0. 5X2 cm) に充填した。 抽出物 （2ml) をシンチレーシヨンバイアルに直接集め、 計測 を行った。 抽出物中の、 受容基質に転移した 〔4, 5， 6, 7, 8, 9— '4C〕 一 Ne u Acの放射活性を液体シンチレーシヨンカウン夕一で測定し、 転移した 〔4, 5, 6, 7, 8, 9— 14C〕 — Ne uAcの量を測定した。 1単位 （U) は、 上述した条件下で 1 //mo 1 のシアル酸を 1分間にラクトースに転移する酵素 の量と定義した。
その結果、 シアル酸トランスフェラ一ゼ活性は、 12. 98UZ1であった。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ： 675 アミノ酸残基
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
生物名： ファトバクテリゥムタムセーラ （Photobacterium damsela) 株名： J T 0160
配列の特徴：
特徴を表す記号： シグナルペプチド
存在位置： 1..15
配列の特徴：
特徴を表す記号： 成熟タンパク質
存在位置： 16..675
配列： 配列番号： 1
Met Lys Lys lie Leu Thr Val Leu Ser lie Phe lie Leu Ser Ala Cys
1 5 10 15
Asn Ser Asp Asn Thr Ser Leu Lys Glu Thr Val Ser Ser Asn Ser Ala
20 25 30
Asp Val Val Glu Thr Glu Thr Tyr Gin Leu Thr Pro lie Asp Ala Pro
35 40 45
Ser Ser Phe Leu Ser His Ser Trp Glu Gin Thr Cys Gly Thr Pro lie
50 55 60 ·
Leu Asn Glu Ser Asp Lys Gin Ala lie Ser Phe Asp Phe Val Ala Pro 65 70 75 80
Glu Leu Lys Gin Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Thr Phe Lys Gly lie Thr
85 90 95
Gly Asp His Arg Tyr lie Thr Asn Thr Thr Leu Thr Val Val Ala Pro
100 105 110 Thr Leu Glu Val Tyr lie Asp His Ala Ser Leu Pro Ser Leu Gin Gin
115 120 125
Leu lie His lie lie Gin Ala Lys Asp Glu Tyr Pro Ser Asn Gin Arg
130 135 140
Phe Val Ser Trp Lys Arg Val Thr Val Asp Ala Asp Asn Ala Asn Lys 145 150 155 160
Leu Asn lie His Thr Tyr Pro Leu Lys Gly Asn Asn Thr Ser Pro Glu
165 170 175
Met Val Ala Ala He Asp Glu Tyr Ala Gin Ser Lys Asn Arg Leu Asn
180 185 190 lie Glu Phe Tyr Thr Asn Thr Ala His Val Phe Asn Asn Leu Pro Pro
195 200 205
lie lie Gin Pro Leu Tyr Asn Asn Glu Lys Val Lys lie Ser His lie
210 215 220
Ser Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ser Glu Tyr Val Ser Leu Tyr Gin Trp 225 230 235 240
Lys Asp Thr Pro Asn Lys lie Glu Thr Leu Glu Gly Glu Val Ser Leu
245 250 255
Leu Ala Asn Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Pro Asp Ala Pro Lys Gly Met
260 265 270
Gly Asn Arg Tyr Asn Trp His Lys Leu Tyr Asp Thr Asp Tyr Tyr Phe
275 280 285
Leu Arg Glu Asp Tyr Leu Asp V l Glu Ala Asn Leu His Asp Leu Arg
290 295 300
Asp Tyr Leu Gly Ser Ser Ala Lys Gin Met Pro Trp Asp Glu Phe Ala 305 310 315 320
Lys Leu Ser Asp Ser Gin Gin Thr Leu Phe Leu Asp lie Val Gly Phe
325 330 335
Asp Lys Glu Gin Leu Gin Gin Gin Tyr Ser Gin Ser Pro Leu Pro Asn
340 345 350
Phe lie Phe Thr Gly Thr Thr Thr Trp Ala Gly Gly Glu Thr Lys Glu
355 360 365 Tyr Tyr Ala Gin Gin Gin Val Asn Val He Asn Asn Ala He Asn Glu
370 375 380
Thr Ser Pro Tyr Tyr Leu Gly Lys Asp Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly 385 390 395 400
His Pro Ala Gly Gly Val lie Asn Asp lie He Leu Gly Ser Phe Pro
405 410 415
Asp Met He Asn lie Pro Ala Lys lie Ser Phe Glu Val Leu Met Met
420 425 430
Thr Asp Met Leu Pro Asp Thr Val Ala Gly lie Ala Ser Ser Leu' Tyr
435 440 445
Phe Thr lie Pro Ala Asp Lys Val Asn Phe lie Val Phe Thr Ser Ser
450 455 460
Asp Thr lie Thr Asp Arg Glu Glu Ala Leu Lys Ser Pro Leu Val Gin 465 470 475 480
Val Met Leu Thr Leu Gly lie Val Lys Glu Lys Asp Val Leu Phe Trp
485 490 495
Ala Asp His Lys Val Asn Ser Met Glu Val Ala lie Asp Glu Ala Cys
500 505 510
Thr Arg lie lie Ala Lys Arg Gin Pro Thr Ala Ser Asp Leu Arg Leu
515 520 525
Val lie Ala He lie Lys Thr lie Thr Asp Leu Glu Arg lie Gly Asp
530 535 540
Val Ala Glu Ser lie Ala Lys Val Ala Leu Glu Ser Phe Ser Asn Lys 545 550 555 560
Gin Tyr Asn Leu Leu Val Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gin His Thr Val
565 570 575
Arg Met Leu His Glu Val Leu Asp Ala Phe Ala Arg Met Asp Val Lys
580 585 590
Ala Ala lie Glu Val Tyr Gin Glu Asp Asp Arg He Asp Gin Glu Tyr
595 600 605
Glu Ser lie Val Arg Gin Leu Met Ala His Met Met Glu Asp Pro Ser 610 615 620 Ser l ie Pro Asn Val Met Lys Val Met Trp Al a Al a Arg Ser l i e Glu 625 630 635 640
Arg Val Gly Asp Arg Cys Gin Asn l ie Cys Gl u Tyr l ie l i e Tyr Phe
645 650 655
Val Lys Gly Lys Asp Val Arg His Thr Lys Pro Asp Asp Phe Gly Thr
660 665 670
Met Leu Asp
675
配列番号: 2
配列の長さ： 2709塩基対
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： Genomi c DNA
起源
生物名： ファトバクテリゥムダムセーラ （Photobac ter ium damse l a) 株名： J T 0 1 6 0
配列： 配列番号 2
AAGCTTATCT TGAAATGAAT GATAAGGAAG GGGCGATTGA ATTACTTGAA GAGGTAACGG -336 CAAAAGCGGA TGGGGCTGTA AAAGCGGAAG CTGAGGAAGT TATTGAATAA CTAATTTTTC -276 AAATGTTCTG TTTTAAGGCG TAAACGATTG AGTCTCTTAA AGCGTACTAT GTCATCATAA -216 GGCTGGTGTG GCATAGTACG CACTTTTAAT GATCTTCATT ATTTATTACT TATTGGTATG -156 ACAGTTTGTA AATAATAATT TTTCAATTGA TATTTTTATG CTGGTATTGA ACCTGAAATC -96 AAATGAGATA TATCTCACAA AAAGCAAATG TAAACATCAT CTTAAATAGA TGAGGCAATA -36 TACTACTAAG AATTTTTTAT GTGAATGTGC TTAAT ATG AAG AAA ATA CTG ACA 18
Met Lys Lys l ie Leu Thr
1 5
GTT CTA TCT ATT TTT ATT CTT TCA GCG TGT AAT AGT GAC AAT ACC AGC 66 Val Leu Ser l i e Phe l ie Leu Ser Ala Cys Asn Ser Asp Asn Thr Ser
10 15 20 6 ε
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WO V3V WO VID VID IVD VD9 131 IVV 131 DOV VIO 03V VVV Oil /86df/X3<I ACA GCT CAT GTT TTT AAT AAT TTA CCA CCT ATT ATT CAA CCT TTA TAT 642 Thr Ala Hi s Val Phe Asn Asn Leu Pro Pro He l i e Gin Pro Leu Tyr
200 205 210
AAT AAC GAG AAG GTG AAA ATT TCT CAT ATT AGT TTG TAT GAT GAT GGT 690 Asn Asn Glu Lys Val Lys l i e Ser Hi s l i e Ser Leu Tyr Asp Asp Gly 215 220 225 230
TCT TCT GAA TAT GTA AGT TTA TAT CAA TGG AAA GAT ACA CCA AAT AAG 738 Ser Ser Glu Tyr Val Ser Leu Tyr Gin Trp Lys Asp Thr Pro Asn Lys
235 240 245
ATA GAA ACA TTA GAA GGT GAA GTA TCG CTT CTT GCT AAT TAT TTA GCA 786 l i e Glu Thr Leu Glu Gly Glu Val Ser Leu Leu Al a Asn Tyr Leu Al a
250 255 260
GGA ACA TCT CCG GAT GCA CCA AAA GGA ATG GGA AAT CGT TAT AAC TGG 834 Gly Thr Ser Pro Asp Al a Pro Lys Gly Met Gly Asn Arg Tyr Asn Trp
265 270 275
CAT AAA TTA TAT GAC ACT GAT TAT TAC TTT TTG CGC GAA GAT TAC CTT 882 Hi s Lys Leu Tyr Asp Thr Asp Tyr Tyr Phe Leu Arg Glu Asp Tyr Leu
280 285 290
GAC GTT GAA GCA AAC CTA CAT GAT TTA CGT GAT TAT TTA GGC TCT TCC 930 Asp Val Glu Ala Asn Leu Hi s Asp Leu Arg Asp Tyr Leu Gly Ser Ser 295 300 305 310
GCA AAG CAA ATG CCA TGG GAT GAA TTT GCT AAA TTA TCT GAT TCT CAG 978 Al a Lys Gin Met Pro Trp Asp Glu Phe Al a Lys Leu Ser Asp Ser Gin
315 320 325
CAA ACA CTA TTT TTA GAT ATT GTG GGT TTT GAT AAA GAG CAA TTG CAA 1026 Gin Thr Leu Phe Leu Asp l ie Val Gly Phe Asp Lys Glu Gin Leu Gin
330 335 340
CAA CAA TAT TCA CAA TCC CCA CTA CCA AAC TTT ATT TTT ACC GGC ACA 1074 Gin Gin Tyr Ser Gin Ser Pro Leu Pro Asn Phe l ie Phe Thr Gly Thr
345 350 355
ACA ACT TGG GCT GGG GGG GAA ACG AAA GAG TAT TAT GCT CAG CAA CAA 1 122 Thr Thr Trp Ala Gly Gly Glu Thr Lys Glu Tyr Tyr Al a Gin Gin Gin
360 365 370
4 O GTA AAT GTG ATT AAT AAT GCG ATC AAT GAA ACT AGC CCT TAT TAT TTA 1170 Val Asn Val lie Asn Asn Ala lie Asn Glu Thr Ser Pro Tyr Tyr Leu 375 380 385 390
GGT AAA GAC TAC GAT CTA TTT TTC AAG GGG CAT CCT GCT GGT GGC GTT 1218 Gly Lys Asp Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ala Gly Gly Val
395 400 405
ATT AAC GAC ATC ATT CTT GGA AGC TTC CCT GAT ATG ATC AAT ATT CCA 1266 lie Asn Asp lie lie Leu Gly Ser Phe Pro Asp Met lie Asn lie Pro
410 415 420
GCC AAG ATT TCA TTT GAG GTC TTG ATG ATG ACG GAT ATG TTG CCT GAT 1314 Ala Lys lie Ser Phe Glu Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp
425 430 435
ACA GTA GCT GGT ATT GCG AGC TCT CTG TAC TTC ACA ATT CCT GCC GAT 1362 Thr Val Ala Gly He Ala Ser Ser Leu Tyr Phe Thr lie Pro Ala Asp
440 445 450
AAA GTT AAT TTT ATT GTA TTT ACT TCA TCT GAC ACT ATT ACT GAT CGT 1410 Lys Val Asn Phe lie Val Phe Thr Ser Ser Asp Thr lie Thr Asp Arg 455 460 465 470
GAA GAG GCT CTT AAA TCA CCA TTA GTA CM GTG ATG CTA ACG TTG GGT 1458 Glu Glu Ala Leu Lys Ser Pro Leu Val Gin Val Met Leu Thr Leu Gly
475 480 485
ATT GTT AAA GAA AAA GAT GTT CTG TTC TGG GCT GAT CAT AAA GTA AAC 1506 He Val Lys Glu Lys Asp Val Leu Phe Trp Ala Asp His Lys Val Asn
490 495 500
TCG ATG GAA GTT GCC ATT GAT GAA GCC TGT ACT CGG ATC ATT GCA AAG 1554 Ser Met Glu Val Ala lie Asp Glu Ala Cys Thr Arg lie lie Ala Lys
505 510 515
CGA CAA CCA ACC GCG AGT GAT TTA CGC TTG GTT ATT GCT ATT ATC AM 1602 Arg Gin Pro Thr Ala Ser Asp Leu Arg Leu Val lie Ala lie lie Lys
520 525 530
ACA ATT ACT GAT CTT GAG CGT ATT GGC GAT GTG GCA GAA AGT ATT GCT 1650 Thr lie Thr Asp Leu Glu Arg lie Gly Asp Val Ala Glu Ser lie Ala 535 540 545 550 AAA GTC GCA TTA GAG AGC TTT AGT AAT AAG CAA TAT AAC CTA TTG GTT 1698 Lys Val Al a Leu Gl u Ser Phe Ser Asn Lys Gin Tyr Asn Leu Leu Val
555 560 565
TCT TTA GAA TCT CTT GGC CAG CAT ACG GTT CGA ATG CTG CAT GAG GTG 1746 Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gin His Thr Val Arg Met Leu Hi s Gl u Val
570 575 580
TTA GAT GCG TTT GCT CGT ATG GAT GTT AAA GCC GCA ATA GAA GTG TAC 1794 Leu Asp Al a Phe Al a Arg Met Asp Val Lys Ala Al a He Glu Val Tyr
585 590 595
CAA GAA GAT GAT CGA ATT GAT CAA GAG TAT GAG TCG ATA GTC AGA CAG 1842 Gin Glu Asp Asp Arg l i e Asp Gin Glu Tyr Glu Ser l i e Val Arg Gin
600 605 610
CTA ATG GCC CAT ATG ATG GAA GAT CCA AGC TCA ATT CCT AAT GTA ATG 1890 Leu Me t Al a Hi s Met Met Glu Asp Pro Ser Ser l ie Pro Asn Val Met 615 620 625 630
AAA GTG ATG TGG GCG GCA CGT TCT ATT GAG CGA GTG GGT GAT CGC TGT 1938 Lys Val Met Trp Al a Al a Arg Ser l i e Glu Arg Val Gly Asp Arg Cys
635 640 645
CAA AAC ATT TGT GAG TAC ATT ATC TAC TTT GTG AAG GGT AAA GAC GTT 1986 Gin Asn He Cys Glu Tyr l ie l i e Tyr Phe Val Lys Gly Lys Asp Val
650 655 660
CGC CAT ACC AAA CCA GAT GAT TTT GGT ACT ATG CTC GAT TAA 2028 Arg Hi s Thr Lys Pro Asp Asp Phe Gly Thr Met Leu Asp STP
665 670 675
TCTATACAAG AAACAAGAAA CAAGAAGGTC GCCAGCATCG TAAATGTGGC GACCTTTTTT 2088 AATGCAAAAA AGCCCTTCTA AAGGTAAACG AAGGGCGAGA GTAACCAAAT GGTCAAAATT 2148 GAGTGGATAT AACATTCATG CTGATTTTGT TATTGTTGCT ATATTTCAAT TAGTTAACTG 2208 CGTTTCAGTT AAAGCTGTAT TGTAAACCGA CACCGCCTGC GACTTCTGAT GACGAGTATT 2268 TACCGCTCGT TTCGTAATGG AAAGTTCCTG ATACACTTAA GTTTTCGTTG ATTCCATAAG 2328 CACCACCAAG GCTAAAGCTT 2348 配列番号: 3
配列の長さ： 38 配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 3
GCIAAITAI I TIGCIGGIAC I I I ICCIGAI GCICCIAA 38 配列番号: 4
配列の長さ： 25
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 4
GGGGGGGAAA CGAAAGAGTA TTATG 25 配列番号： 5
配列の長さ： 24
配列の型： 核酸
鎖の数： - -本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号： 5
ATTTTTCAAG GGGCATCCTG CTGG 24 配列番号： 6
配列の長さ： 17
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 6
AAGATTTCAT TTGAGGT 17 配列番号： 7
配列の長さ： 10
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 7
CCAAGCTTGG 10 配列番号: 8
配列の長さ： 8
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 8
CTCTAGAG 8 配列番号: 9
配列の長さ： 22
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 9
TTATGTGAAT TCGCTTAATA TG 22 配列番号： 10
配列の長さ： 38
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 配列： 配列番号： 10
TTTTTATGTG AATGTGGAAT TCATGAAGAA AATACTGA 38 配列番号： 1 1
配列の長さ： 41
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号： 11
CAAAACAATT ACTGATTAAT AGTGAATTGG CGATGTGGCA G 41 配列番号： 12
配列の長さ： 46
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号： 12
TGTTCTGTTC TGGGCTTAGT GATAAGATCT CTCGATGGAA GTTGCC 46

Claims

請求の範囲
1. 以下の （A) 又は （B) のタンパク質をコードする遺伝子：
(A) 配列番号 1の 16— 498のアミノ酸配列を含むタンパク質
(B) 配列番号 1の 16— 498において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ3—ガラクトシド一 α 2. 6—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質。
2. 以下の （a) 又は （b) の DNAからなる、 請求項 1に記載の遺伝子：
(a) 配列番号 2の 46— 1494の塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 2の 46- 1494を含む DN Aと温和なストリンジエンシー条 件下でハイブリダィズし、 かつ /3—ガラクトシドーひ 2, 6—シアル酸転移酵素 活性を有するタンパク質をコードする DNA。
3. さらに、 配列番号 1の 499— X (Xは、 500— 675の整数である） のアミノ酸配列をコードする遺伝子も含む、 請求項 1または 2に記載の遺伝子。
4. 請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の DN A配列を含む発現べクタ一。
5. 発現べクタ一のシグナル配列が宿主由来の DNAである、 請求項 4に記載 の発現 クタ一。
6. 発現べクタ一のシグナル配列が：
(A) 配列番号 1の 1一 15のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする DN A 配列、 または
(B) 配列番号 1の 1一 15において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換 若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つシグナル活性を有するぺプチド をコードする DN A配列
である、 請求項 4に記載の発現ベクター。
7. 組換え |3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を製造 する方法であって、 請求項 4ないし 6のいずれか 1項に記載したベクタ一で形質 転換された宿主細胞を) 3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移酵素の発現を 促進する条件下で培養し、 その培養物から ]3—ガラクトシドー α 2， 6—シアル 酸転移酵素夕ンパク質を回収することを含む方法。
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