CN113444756A - 一种混菌耦合发酵规模化合成6’-唾液酸乳糖的方法 - Google Patents

一种混菌耦合发酵规模化合成6’-唾液酸乳糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种混菌耦合发酵规模化合成6'‑唾液酸乳糖的方法，属于生物发酵领域。本发明通过在微生物异源表达了α‑2,6‑唾液酸转移酶和CMP‑唾液酸合成酶，构建得到了重组菌，将两株重组菌及酵母菌加入含有CMP、唾液酸和乳糖的反应体系中，能够直接价合成6'‑唾液酸乳糖。6'‑唾液酸乳糖转化率为82％，产量达到42g/L。该生产工艺显著降低了生产成本，能够应用于工业化的大规模生产。

Description

一种混菌耦合发酵规模化合成6’-唾液酸乳糖的方法
技术领域
本发明涉及一种混菌耦合发酵规模化合成6′-唾液酸乳糖的方法，属于生物发酵领域。
背景技术
母乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)广泛存在于母乳中，是一类重要的低聚糖，它由3-14 个单糖所组成的，其基本单体有以下五种：D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、L-岩藻糖(Fuc)、N- 乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)和唾液酸(N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)，他们以不同种方式连接形成多种低聚糖。母乳中的HMOs主要可以分为三大类：岩藻糖基化的HMOs、非岩藻糖基化的HMOs和唾液酸化的HMOs，其中岩藻糖基化和非岩藻糖基化的HMOs都属于中性寡糖，而唾液酸化的HMOs属于酸性寡糖[16]。
HMOs作为母乳中仅次于脂类和乳糖的第三大成分，对婴幼儿的健康成长发育起着重要作用。HMOs 在人体中不会被消化吸收，而是直接到达肠道中，促进肠道的有益菌群的生长繁殖，抑制有害菌群的生长，从而起到调控肠道菌群和抗致病菌肠道粘附的作用。同时，HMOs还可以调控免疫系统，它通过调控肠道中细胞的基因表达，来调节淋巴细胞产生淋巴因子的水平，还能刺激机体产生免疫活性物质，从而提高机体对细菌的免疫力。并且，HMOs及其代谢产物，例如唾液酸，在促进婴幼儿大脑发育方面起着重要作用。
唾液酸化的HMOs包括两种，是乳糖通过α-2,3或α-2,6在唾液酸化的末端形成3′-唾液酸乳糖 (3′-sialyllactose，3′-SL)或6′-唾液酸乳糖(6′-sialyllactose，6′-SL)，结构如图1所示。唾液酸化乳糖具有抗菌活性，可以抗菌、抗感染，提高机体免疫力，促进婴幼儿大脑发育、增强人体记忆力，改善肠道菌群等作用。
唾液酸化乳糖的合成方法主要有两种：一种是化学合成法，涉及到保护和去保护等步骤，步骤复杂，分离纯化困难，且成本较高，不适合规模化生产。另一种合成方法为生物合成法。但是目前报道的主要是 3′-SL的生产，关于6′-SL的生物法合成鲜有报道。
目前高档奶粉中已经实现了6′-SL的添加，但主要从牛奶中提取，价格相对高昂。如何实现6′-SL的生物合成是降低其价格，实现人人可以享用目的的关键所在。
发明内容
本发明以酿酒酵母将CMP转化为CTP为起始出发点，以最终实现6′-SL的合成为目标。首先由于酵母细胞自身拥有的相关酶系，酿酒酵母有来源广泛、成本低、培养周期短等优点，且不能利用乳糖，所以利用酿酒酵母将CMP转化为CTP，来实现CTP源源不断的合成，通过探索最佳转化时间以及酵母重复利用率，得到高转化率的CTP，再以CTP、Neu5Ac为底物，在工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA的催化下全细胞合成CMP-Neu5Ac，再以CMP-Neu5Ac和乳糖为底物，在工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6的催化下全细胞合成6′-SL，最终实现将三菌株耦合发酵生产6′-SL，并探究不同底物浓度对合成6′-SL的影响，以选择最适合6′-SL规模化生产且经济的反应体系。
本发明提供了一种生产6′-唾液酸乳糖的方法，所述方法是以CMP、唾液酸和乳糖为底物，通过酿酒酵母、表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌和表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌三株菌株混菌进行发酵；
或，以CMP和唾液酸为底物时，先加入酿酒酵母菌和表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌合成 CMP-Neu5Ac，再加入乳糖和表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌；
或，以CTP、唾液酸和乳糖为底物时，加入表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌。
在一种实施方式中，所述α-2,6-唾液酸转移酶来源于N.meningitidis。
在一种实施方式中，所述α-2,6-唾液酸转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌表达来源于N.meningitidis的CMP-Neu5Ac 合成酶，所述CMP-Neu5Ac合成酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述重组菌的宿主优选为大肠杆菌，更优的，选择敲除了β-半乳糖苷酶的大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae S189、 Saccharomyces cerevisiae W13-06和GDMCC 61663。
在一种实施方式中，先以CMP和唾液酸为底物时，先加入酿酒酵母菌和表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌合成CMP-Neu5Ac，再加入乳糖和表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌。
在一种实施方式中，所述CMP-Neu5Ac是利用表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌以CTP和唾液酸为底物发酵产生，或利用表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和酿酒酵母以CMP和唾液酸发酵产生。
在一种实施方式中，所述表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和酿酒酵母的添加量分别为100g/L和50 g/L
在一种实施方式中，所述CMP和唾液酸的含量分别为60～90mM和50～80mM。
在一种实施方式中，在28～32℃，180～220r/min条件下反应4～6h。
在一种实施方式中，先以CTP、唾液酸和乳糖为底物时，加入表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌，CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,3-唾液酸转移酶的重组菌的添加量为50g/L。
在一种实施方式中，所述CTP、唾液酸和乳糖的含量分别为50～80mM、50-80mM和70-90mM。
在一种实施方式中，在以CMP、唾液酸和乳糖为底物时，加入酿酒酵母菌、表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,6-唾液酸转移酶的。
在一种实施方式中，在以CMP、唾液酸和乳糖为底物时，加入酿酒酵母、表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,3-唾液酸转移酶的重组菌，CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,3-唾液酸转移酶的重组菌的添加量为45～55g/L，酿酒酵母的添加量为30～150g/L。
在一种实施方式中，CMP、唾液酸和乳糖的含量分别为10-90mM、50～90mM和70～90mM。
在一种实施方式中，在以CMP、唾液酸和乳糖为底物时，在28～32℃、180～220r/min条件下反应。
在一种实施方式中，反应25～40h。
在一种实施方式中，反应全程通无菌空气。
本发明还提供所述方法生产的6′-唾液酸乳糖在制备婴幼儿奶粉或补剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过在微生物异源表达了α-2,6-唾液酸转移酶和CMP-唾液酸合成酶，构建得到了重组菌E.coli JM109(DE3)/pET28a-neuA和E.coli JM109(DE3)/pET28a-ST6，将重组菌及酵母菌加入含有乳糖、唾液酸和 CMP为底物发酵液中，通过发酵培养可以规模化合成6′-唾液酸乳糖，本专利技术明显降低了6′-唾液酸乳糖生产成本，并且可以大规模发酵生产，为6′-唾液酸乳糖廉价、大规模生产奠定基础。
附图说明
图1唾液酸乳糖的结构。
图2重组表达质粒pET28a-neuA的构建设计与酶切验证；(A)构建流程图；(B)双酶切验证注： M：10000DNA Marker；1：pET28a-neuA的双酶切。
图3重组表达质粒pET28a-ST6的构建设计与酶切验证；(A)构建流程图；(B)双酶切验证注：M： 10000DNA Marker；1：pET28a-ST6的双酶切。
图4酿酒酵母合成CTP的HPLC检测；注：A：CMP标品；B：CDP标品；C：CTP标品；D：酵母合成CTP在6h的反应液。
图5酿酒酵母合成CTP时间对浓度的影响。
图6CMP-Neu5Ac的TLC检测；注：1：CMP标品；2：CDP标品；3：CTP标品；4：CMP-Neu5Ac标品；5：工程菌株JM109(DE3)/pET28a-neuA全细胞合成CMP-Neu5Ac的发酵液。
图7CMP-Neu5Ac的HPLC检测；注：A：CMP标品；B：CMP-Neu5Ac标品；C：工程菌株JM109(DE3)/pET28a-neuA催化合成CMP-Neu5Ac的发酵液。
图8细胞浓度对合成CMP-Neu5Ac的影响。
图9双菌耦合合成CMP-Neu5Ac的HPLC检测；注：1：CMP标品；2：CDP标品；3：CTP标品；4：CMP-Neu5Ac标品；:5：双菌耦合合成CMP-Neu5Ac发酵液。
图10双菌耦合合成CMP-Neu5Ac的HPLC检测；注：A：CMP标品；B:：CMP-Neu5Ac标品；C：双菌耦合合成CMP-Neu5Ac发酵液。
图11工程菌株JM109-(DE3)/pET28a-ST6全细胞合成6′-SL的TLC检测。
图12纯化6′-SL的TLC检测；注：1：乳糖标品；2：6′-SL标品；3：纯化前；4：流穿；5：水洗； 6：纯化后。
图13双菌耦合合成6′-SL的TLC检测；注：1：乳糖标品；2：6′-SL标品；3：双菌耦合合成6′-SL 发酵液；4：流穿；5：水洗；6：纯化后。
图14三菌耦合合成6′-SL的TLC检测；注：1：乳糖标品；2：6′-SL标品；3：三菌耦合合成6′-SL 发酵液。
图15纯化6′-SL的TLC检测；注：1：乳糖标品；2：6′-SL标品；3：纯化前；4：流穿；5：水洗； 6：纯化后。
图16 6′-SL的液质联用检测；注：A：发酵液部分离子提取流图；B:发酵液MSMS谱图。
图17通风发酵和封闭发酵对6′-SL合成的影响；注：1：乳糖标品；2：6′-SL标品；3：封闭发酵； 4：通风发酵。
图18不同浓度的酿酒酵母对6′-SL合成的影响；注：1：乳糖标品；2：Neu5Ac标品；3：6′-SL标品； 4：30g/L酵母；5：60g/L酵母；6：90g/L酵母；7：100g/L酵母；8：120g/L酵母；9：150g/L酵母。
图19不同浓度的CMP对6′-SL合成的影响；注：1：乳糖标品；2：Neu5Ac标品；3：6′-SL标品； 4：10mM CMP；5：20mM CMP；6：30mM CMP；7：40mM CMP；8：50mM CMP；9：60mM CMP； 10：70mM CMP；11：80mM CMP；12：90mM CMP。
图20不同浓度的Neu5Ac对6′-SL合成的影响；注：1：乳糖标品；2：Neu5Ac标品；3：6′-SL标品； 4：50mM Neu5Ac；5：60mM Neu5Ac；6：70mM Neu5Ac；7：80mM Neu5Ac；8：90mMNeu5Ac。
图21 60g/L与100g/L酿酒酵母添加量在组合后的对比；注：1：乳糖标品；2：Neu5Ac标品；3：6′-SL 标品；4：60g/L酵母；5：100g/L酵母。
图22在添加60g/L酿酒酵母条件下探究CMP浓度对合成6′-SL的影响；注：1：乳糖标品；2：Neu5Ac 标品；3：6′-SL标品；4：10mM CMP；5：20mM CMP；6：30mM CMP；7：40mM CMP；8：50mM CMP； 9：60mM CMP；10：70mM CMP。
图23探究酿酒酵母浓度的合成6′-SL的影响；注：A：在添加20mM CMP基础上探究酿酒酵母浓度的合成6′-SL的影响1：乳糖标品；2：Neu5Ac标品；3：6′-SL标品；4：30g/L酵母；5：40g/L酵母；6： 50g/L酵母；7：60g/L酵母；B：在添加30mM CMP基础上探究酿酒酵母浓度的合成6′-SL的影响。1：乳糖标品；2：Neu5Ac标品；3：6′-SL标品；4：30g/L酵母；5：40g/L酵母；6：50g/L酵母；7：60g/L 酵母。
图24四种酵母的CTP合成能力比较。
具体实施方式
1、CTP的分析检测
(1)TLC薄层色谱鉴定
展开剂的配置：乙醇：1M pH6.5乙酸铵＝6：4，参考HERMAN H.HIGA J CP.Sialylation of glycoprotein oligosaccharides with N-acetyl-,N-glycolyl-,andN-O-diacetylneuraminic acids[J].The Journal of biological chemistry,1985,260(8838-8849)；
点样：将CMP、CTP和样品分别点在TLC薄板上，每次点样2μL，少量多次，使其样品点直径不超过2mm。待其烘干后才能放入层析缸中；
展层：将TLC薄板倾斜置于装有展开剂的层析缸中，有样品的一端向下，浸在展开剂中(液面低于点样位置)。展开剂延伸到距离TLC薄板上端1cm时，取出烘干；
显色：通过紫外照射显色。
(2)HPLC分析检测
高效液相色谱法(HPLC)分析：依立特C18 5μm(4.6mm×250mm)，流动相为甲醇-6‰(体积分数)的磷酸水溶液(用三乙胺调节pH至6.6)，二者体积比为11:89；流速为0.6mL/min；柱温为25℃；进样量为10μL；紫外检测波长为271nm。
CMP、CTP标品检测结果如图6所示，CMP的出峰时间为5.8min，CTP出峰时间为7.0min。
2、CMP-Neu5Ac的分析检测
(1)TLC薄层色谱鉴定
同CTP的分析检测方法。
(2)HPLC分析检测
高效液相色谱法(HPLC)分析：依立特C18 5μm(4.6mm×250mm)，流动相A为0.1M磷酸钾缓冲液和8mM(pH5.3)的四丁基硫酸氢铵，流动相B为70％流动相A与30％甲醇混合；梯度洗脱程序(流动相A变化)为：0～2.5min为10％，2.5～10min为100％～60％，10～11min为60％～0％，11～15min保持为0％，15～16min为0％～100％，16～30min保持为100％；流速为0.6mL/min；柱温为30℃；进样量为10 μL；紫外检测波长为270nm。
3、唾液酸乳糖的检测及分离纯化
(1)分离纯化
反应后的溶液经过10000r/min，离心10min，得到的上清用HyperSep Hypercarb固相萃取小柱(SPE 小柱)分离纯化。纯化步骤如下：
活化：用3mL甲醇活化SPE小柱；
平衡：加入3mL去离子水平衡SPE小柱；
上样：加入样品500μL，流下的液体记为流穿；
水洗：使用3mL去离子水淋洗SPE小柱，得到的液体记为水洗；
洗脱：用3mL 80％乙腈洗脱SPE小柱，得到的溶液记为纯化后。
(2)TLC薄层色谱鉴定
展开剂的配置：正丙醇：水：25％氨水＝7.5:3:2(体积比)；
苯胺-二苯胺-磷酸显色剂的配置：4g二苯胺、4mL苯胺与20mL 85％磷酸共溶于200mL丙酮中；
显色：将干燥的TLC薄板均匀浸没于显色剂中，待烘干后于105℃加热5min。
(3)6′-唾液酸乳糖的液质联用检测方法：
仪器：赛默飞U3000液相色谱AB SCIEX X500系列QTOF质谱仪；
检测样：样品用50％乙腈水溶液稀释20倍，过膜待测。
流动相：
表1左泵流动相参数
Figure BDA0003111188390000061
表2右泵流动相参数
Figure BDA0003111188390000062
流速为0.2mL/min,进样量为2μL。
质谱条件：离子源：ESI离子源；负离子模式；气帘气：35psi；Gas1：40psi；Gas2：40psi；温度：400℃；离子化压力：-3500V(负)，去簇电压：-60V(负)；全扫描范围：m/z 100-1500；裂解电压：-35V(负)； CE Spread：5V。
实施例1：异源表达neuA重组菌的构建
以N.meningitidis中neuA基因序列为模板，根据密码子的兼并性对密码子进行优化合成大小为687bp 的CMP-Neu5Ac合成酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并引入Nde和Sal I酶切位点，将合成产物用Nde I和Sal I双酶切，纯化回收酶切片段。然后将pET28a空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接，连接产物转化到敲除了编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因的菌株E.coli JM109(DE3) △LacZ(设计思路见图2a)。取适量转化液涂布在含Kan的LB培养基平板上，37℃过夜培养，菌落PCR 正确后挑取单菌落摇瓶培养、提取质粒并酶切验证(结果如图2b所示)。经测序验证正确后，得到重组质粒pET28a-neuA，含有重组质粒pET28a-neuA的菌株即为重组菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA。
实施例2：异源表达st6重组菌的构建
按照密码子的兼并性，采用人工合成的方法合成目的基因ST6(核苷酸序列如SEQID NO.2所示)，分别引入Nco I和BamH I酶切位点。目的基因ST6和pET28a载体分别经过NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后进行连接(设计思路见图3a)，并转化到E.coli JM109(DE3)△LacZ，取150μL转化液涂布于含有Kan抗性的 LB培养基平板上；37℃培养16h，挑取单菌落进行摇瓶培养，提取质粒并双酶切进行验证(图3b)。经测序验证正确后，得到重组表达质粒pET28a-ST6，含有重组质粒pET28a-ST6的菌株即为重组菌JM109(DE3) △LacZ/pET28a-ST6。
实施例3：重组菌蛋白的诱导表达与检测
将实施例1和2中构建的重组菌JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA和JM109(DE3)△LacZ/pET28a-ST6 分别接种至含20μg/mL Kan的10mL LB液体培养基中，在37℃、200r/min摇瓶培养12h，再按体积比 2％的接种量转接到含20μg/mL Kan的100mL LB液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶培养至OD600约为 0.6后，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导，200r/min摇瓶培养20h。4℃、8 000r/min离心10min 收集菌体。将诱导前及诱导20h的菌液分别与SDS-PAGE Loading缓冲液混匀，100℃加热10min，得到诱导前、后样品，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。
NeuA酶25kD～35kD之间有明显的表达条带，与现有报道的条带大小一致(30.4KDa)，说明NeuA 酶在工程菌株JM109(DE3)△LacZ/pET28a-neuA中成功表达。6′-唾液酸转移酶在45kD～60kD之间出现较为明显的蛋白表达条带，其分子量与Sun(Sun M,Li Y,Chokhawala H A,et al.N-Terminal 112amino acid residues are not required forthe sialyltransferase activity of Photobacterium damselaα2,6-sialyltransferase[J]. Biotechnology Letters,2008,30(4):671-676)等人报道的目的酶大小相一致，证明6′-唾液酸转移酶ST6在工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6中成功表达。
实施例4：酿酒酵母转化CMP到CTP
(1)酿酒酵母的发酵获得
本实施以专利菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae GDMCC 61663为例。
酿酒酵母发酵初始培养基(g/L)：酵母粉12，葡萄糖5，(NH4)2SO4 2.5，CaCl2·2H2O 0.1，MgSO4·7H2O 1.5，pH 6.0。
7L发酵罐发酵培养酿酒酵母：将酿酒酵母GDMCC 61663接种于初始装液量3L的酿酒酵母发酵初始培养基，接种量15％(v/v)。温度控制在30℃，通风比为2.0vvm，通过调节搅拌转速将溶氧DO维持在 25％以上。发酵开始时，菌体先利用初始培养基中的葡萄糖生长，葡萄糖耗尽后溶氧数值则迅速上升，此时就开始流加氨水和蜜二糖，在整个发酵过程中，发酵液的pH用氨水和42.5％的磷酸自动控制在6.0。直到细胞达到200g/L，终止发酵，离心收集酵母细胞，用于下一步的耦合发酵。
(2)酿酒酵母转化CMP到CTP
发酵条件：将70mM CMP、300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、20mM MgCl2、10mL/L甘油、6mL/L 乙醛混合配制成反应液，调节pH为7，加入100g/L步骤(1)制备的酿酒酵母，在30℃，200r/min条件下反应6h。
结果如图4所示，可以看出反应6h的样品在7.5min附近出现和CTP标准样品同样的峰，在反应6h 时有CMP、CDP、CTP的存在，表明酿酒酵母可以将廉价的CMP转化为昂贵的CTP，从而使整个循环体系的成本降低。
(3)发酵时间对酿酒酵母转化CMP到CTP的影响
发酵条件：将70mM CMP、300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、20mM MgCl2、10mL/L甘油、6mL/L 乙醛混合配制成反应液，调节pH为7，加入100g/L步骤(1)制备的酿酒酵母，在30℃，200r/min条件下分析不同反应时间CTP的产量。
结果如图5所示，可以看出，在反应为6h时，产物CTP的浓度最高，可达到23.5g/L，其转化率为 79.2％。再延长反应时间，CTP的浓度逐渐开始降低，直至反应到24h，CTP的含量已经所剩无几，因此酿酒酵母转化CMP为CTP的反应时间为不超过7h，最适反应时间为为6h。
(4)酿酒酵母重复利用次数对转化CMP到CTP的影响
发酵条件：第一轮催化：将70mM CMP、300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、20mM MgCl2、10mL/L 甘油、6mL/L乙醛混合配制成反应液，调节pH为7，加入100g/L酿酒酵母，在30℃，200r/min条件下发酵6h，然后离心取上清用于HPLC分析；第二轮催化：将70mM CMP、300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、20mM MgCl2、10mL/L甘油、6mL/L乙醛混合配制成反应液，调节pH为7，加入第一轮催化后离心得到的细胞沉淀，在30℃，200r/min条件下发酵6h，离心，取上清用于HPLC分析。
第一次催化与第二次催化相比，第一次催化酿酒酵母的利用效率明显高于第二次，第二次催化过程中， CTP的浓度始终不高，并且还呈现下降的趋势，这表明只有酿酒酵母的第一次利用催化合成CTP的效果最好，第二次利用产生CTP的浓度极低，说明酿酒酵母在催化合成CTP中不适合重复利用。
实施例5：CMP-Neu5Ac的合成
1、单一工程菌株—JM109(DE3)-pET28a-neuA催化合成CMP-Neu5Ac的方法
发酵条件：将60mM CTP、60mM Neu5Ac、150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT配制成反应液，加入50g/L实施例1获得的工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA，在30℃，200r/min条件下反应4h。
结果如图6和7所示，发酵液有与CMP-Neu5Ac标品相同的Rf值，在大约11min时，反应4h的样品有和标准样品CMP-Neu5Ac有同样的出峰时间，证明以CTP和Neu5Ac为底物，使用单一工程菌株 JM109(DE3)-pET28a-neuA可以全细胞催化合成CMP-Neu5Ac。
(1)不同浓度的工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA催化合成CMP-Neu5Ac的浓度比较
反应体系：将60mM CTP、60mM Neu5Ac、150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT配制成反应液。
发酵条件：向反应液中添加50g/L、100g/L、150g/L和200g/L的工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA，在30℃，200r/min条件下反应4h。
结果如图8所示，当工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA的添加量为100g/L、150g/L和200g/L时，反应体系中的CMP-Neu5Ac的浓度在反应的前3h逐渐升高，在3h时达到最高，尤其是在工程菌株浓度为100g/L的条件下，产物CMP-Neu5Ac的浓度达到最高为26.8g/L，反应至5～6h时，反应体系中的 CMP-Neu5Ac浓度迅速下降；当工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA的添加量为50g/L时，反应4h时反应体系中的CMP-Neu5Ac的浓度达到最大值为24.7g/L，反应至5～6h时，反应体系中的CMP-Neu5Ac的浓度趋于稳定。
由实施例4的结果可知，酿酒酵母在6h时催化合成CTP的浓度才能达到最高，并且需要稳定合成 CMP-Neu5Ac，尽量减少CMP-Neu5Ac的降解是后续合成6′-SL的重要基础，因此，以CTP和Neu5Ac为底物，选择细胞浓度为50g/L的工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA来催化合成CMP-Neu5Ac最为合适。
(2)JM109(DE3)-pET28a-neuA利用次数(时间)对CMP-Neu5Ac合成的影响
反应体系：将60mM CTP、60mM Neu5Ac、150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT配制成反应液。
发酵条件：第一轮催化：向反应液中添加50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA，在30℃，200r/min 条件下反应4h，收集发酵液用于TLC分析，发酵液离心并收集菌体；第二轮催化：向新的反应液中加入 50g/L第一轮收集的菌体在30℃，200r/min条件下反应4h，收集发酵液用于TLC分析，发酵液离心并收集菌体，用同样的方法共进行四轮催化。
以第一次转化率为100％计算，工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA菌体重复利用四次后，第四次转化率为第一次催化的37％。因此在使用工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA催化合成CMP-Neu5Ac的过程中，菌体可以重复利用至少四次，那么工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA发酵生产CMP-Neu5Ac的补料方式既可以选择分批发酵也可以选择补料发酵方式。
2、双菌株—酿酒酵母和菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA双菌催化合成CMP-Neu5Ac的方法
反应体系：将70mM CMP、60mM Neu5Ac、300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、150mM Tris、20 mM MgCl2、1mM DTT、10mL/L甘油、6mL/L乙醛配制成反应液。
发酵条件：向反应液中添加100g/L酿酒酵母和50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA，在30℃， 200r/min条件下反应4h。
探究了将酿酒酵母和工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA双菌耦合，以CMP和Neu5Ac为底物，耦合催化合成CMP-Neu5Ac，图9为TLC检测双菌耦合合成CMP-Neu5Ac，可以看出发酵液有与CMP-Neu5Ac 标准样品相同的Rf值；从图10可以看出，双菌耦合发酵生产CMP-Neu5Ac的样品与标准样品在同一时刻出峰，发酵液中CMP-Neu5Ac的浓度为10.7g/L。
实施例6：多菌耦合发酵生产6′-唾液酸乳糖
(1)单细胞发酵催化条件
反应体系：将80mM乳糖、20mL/L甘油、10mL/L二甲苯、248.3mM KH2PO4、5g/L MgCl2、4g/L Nymeen S-215、150g/L JM109(DE3)△LacZ/pET28a-ST6配制成反应液。
发酵条件：2mL体系中包含1mL按照实施例5步骤2所示方法合成的CMP-Neu5Ac溶液和1mL反应液，在30℃条件下反应30h。反应液经过SPE小柱纯化，利用TLC进行分析检测。
结果如图11所示，可以看出，样品中含有与标准样品6′-SL的Rf值相同的物质，证明单一工程菌株 JM109-(DE3)-pET28a-ST6可以全细胞合成6′-SL，但是底物乳糖没有被完全利用。将单一工程菌株 JM109-(DE3)-pET28a-ST6催化合成的6′-SL经过HyperSepHypercarb固相萃取小柱(SPE小柱)纯化，TLC 检测结果如图12所示，用80％乙腈进行洗脱纯化后的组分，与6′-SL标准样品对比，其Rf值相同，这表明，在以CMP-Neu5Ac和乳糖为底物的条件下，单一工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6可以催化合成 6′-SL。
(2)双菌株—工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA和JM109-(DE3)-pET28a-ST6双菌催化合成6′-SL的方法
反应体系：将60mM CTP、60mM Neu5Ac、80mM乳糖为底物，和150mM Tris、248.3mMKH2PO4、 20mM MgCl2、1mM DTT、20mL/L甘油、10mL/L二甲苯、4g/L Nymeen S-215配制成反应液。
发酵条件：向反应液中加入50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA和50g/L工程菌株 JM109-(DE3)-pET28a-ST6，在30℃，200r/min条件下反应30h。反应液经过SPE小柱纯化，利用TLC进行分析检测。
结果如图13所示，可以看出，纯化前的发酵液中有与标准样品6′-SL Rf值相同的寡糖存在，对发酵液用SPE柱进行纯化后的组分，与6′-SL标准样品对比，其Rf值相同，但同时有乳糖的存在，这是因为 80％乙腈不仅能洗脱酸性寡糖，还能把中性寡糖洗脱下来。这表明：以CTP、唾液酸和乳糖为底物， JM109(DE3)/pET28a-neuA和JM109(DE3)/pET28a-nst耦合发酵的条件下，成功合成了6′-SL。
(3)三菌株—酿酒酵母、工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA和JM109-(DE3)-pET28a-ST6三菌耦合合成6′-SL的方法
反应体系：将70mM CMP、60mM Neu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3mMKH2PO4、 150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT、10mL/L甘油、10mL/L二甲苯、6mL/L乙醛、4g/LNymeen S-215 配制成反应液。
发酵条件：向反应液中加入将100g/L酿酒酵母、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA和50g/L 工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6，在30℃，200r/min条件下反应30h。
结果如图14所示，发酵液中含有与标准样品6′-SL相同Rf值的组份；经过HyperSepHypercarb固相萃取小柱(SPE小柱)纯化结果如图15所示，用80％乙腈进行洗脱纯化后的组分，与6′-SL标准样品对比，其Rf值相同。
将6′-SL催化液进行液质联用检测，利用标准样品6′-SL及二级碎片特征离子对部分寡糖进行定性，结果如图16所示，图16A为部分离子提取流图，明确样品中含有Neu5Ac和6′-SL，同时利用标准样品对寡糖进行定量，25min左右出现Neu5Ac的峰，在30min左右有6′-SL出峰，证明有6′-SL的生成，二者峰面积进行对比可以看出，发酵液中大部分底物Neu5Ac已经被利用，剩余浓度为2.901g/L，合成的6′-SL，浓度达到42g/L。图16B为MSMS谱图，可以看出发酵液中的6′-SL分子量为632.13，与标准样品一致。这表明，利用“三菌株耦合发酵体系”成功实现了6′-唾液酸乳糖的合成。
实施例7三菌耦合发酵条件的优化
(1)三菌耦合通风发酵和封闭发酵对6′-SL合成的影响
反应体系：将70mM CMP、60mM Neu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3mMKH2PO4、 150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT、10mL/L甘油、10mL/L二甲苯、6mL/L乙醛、4g/LNymeen S-215 配制成反应液。
通风发酵条件：将100g/L酿酒酵母、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、50g/L工程菌株 JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入反应液中，在30℃，通无菌空气，发酵30h。
封闭发酵条件：将100g/L酿酒酵母、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、50g/L工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入到反应液中，在30℃，不通气，发酵30h。
TLC结果如图17所示，与标准样品进行对比，可以看出通风发酵合成的6′-SL比封闭发酵合成的6′-SL 的条带更深，且对乳糖的利用较多，这表明通风发酵比封闭发酵更加适合三菌耦合催化合成6′-SL，这是因为，在酿酒酵母的发酵过程中会产生气体，通风条件会及时释放该过程中产生的气体，并且会使更多的氧气进入，有利于酿酒酵母进行催化合成。
(2)不同浓度的酿酒酵母对6′-SL合成的影响
发酵条件：将酿酒酵母、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、50g/L工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入到和步骤(1)相同的反应液中，在30℃，通无菌空气，发酵30h。酿酒酵母添加量分别是30g/L、60g/L、90g/L、100g/L、120g/L和150g/L细胞浓度。
发酵液TLC结果如图18所示，30g/L细胞浓度的酿酒酵母的合成体系中，有较多的乳糖和Neu5Ac 剩余，这表明30g/L细胞浓度的酿酒酵母不能充分将CMP转化为CTP，导致底物利用不充分，催化合成 6′-SL的效率不高。60g/L、90g/L、100g/L、120g/L和150g/L细胞浓度的酿酒酵母的添加对于6′-SL的合成影响不大，乳糖的利用率基本相似。因此，选择60g/L细胞浓度的酿酒酵母参与6′-SL的三菌催化耦合较为经济节约。
(3)不同浓度的CMP对6′-SL合成的影响
发酵条件：将100g/L酿酒酵母、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、50g/L工程菌株 JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入到以CMP、60mM Neu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3 mM KH2PO4、150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT、10mL/L甘油、10mL/L二甲苯、6mL/L乙醛、 4g/L Nymeen S-215混合配置的溶液中，在30℃，通无菌空气，发酵30h。分别比较了10mM、20mM、 30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM的CMP添加量对6′-SL的合成影响。
TLC结果如图19所示，通过底物以及产物条带的深浅程度判断对6′-SL的影响，与标准样品进行对比， 10mM、20mM、30mM、40mM、50mM的CMP添加量对合成6′-SL的影响差别不大，底物消耗相似，产物合成量相似，增加CMP的浓度到60mM和70mM，可以看出产物合成量依旧没有太大变化，但是乳糖的消耗量却可以看出有所减少，再增加CMP的浓度到80mM和90mM，不仅乳糖的消耗量有明显减少， Neu5Ac的剩余量也增加了，这可以证明过多的添加CMP不但会造成成本的增加，而且会给反应造成负担，导致底物消耗量减少，产物的生成量也减少。
(4)不同浓度的Neu5Ac对6′-SL合成的影响
发酵条件：将100g/L酿酒酵母、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、50g/L工程菌株 JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入到以70mM CMP、Neu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3 mM KH2PO4、150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT、10mL/L甘油、10mL/L二甲苯、6mL/L乙醛、 4g/L Nymeen S-215混合配置的溶液中，在30℃，通无菌空气，发酵30h。分别比较了50mM、60mM、 70mM、80mM、90mM的Neu5Ac添加量对6′-SL的合成影响。
TLC检测结果如图20所示，通过底物以及产物条带的深浅程度判断对6′-SL的影响，与标准样品进行对比，50mM、60mM、70mM的Neu5Ac的添加对于合成6′-SL的影响差别不大，底物消耗量和产物合成量相似，再增加Neu5Ac的浓度，可以看出添加80mM Neu5Ac的反应与前面对比底物乳糖的消耗稍有增多，产物的生成略微增加，在增加Neu5Ac的浓度到90mM，可以看出底物的消耗量较前面几个浓度相比明显降低，剩余较多，产物的生成量较前面也有所降低，可以考虑80mM的Neu5Ac的添加量对于三菌耦合发酵生产6′-SL有着较好的优势。
(5)10mM CMP条件下酿酒酵母浓度对生成6′-SL的影响
反应体系：将10mM CMP、80mM Neu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3mMKH2PO4、 150mM Tris、20mM MgCl2、1mM DTT、10mL/L甘油、10mL/L二甲苯、6mL/L乙醛、4g/LNymeen S-215 配制成反应液。
发酵条件：将酿酒酵母、50g/L菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、50g/L菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6 加入到反应液中，在30℃，通无菌空气，发酵30h。分别比较了60g/L酿酒酵母与添加100g/L酿酒酵母对6′-SL的合成影响。
结果如图21所示，与添加100g/L酿酒酵母相比，添加60g/L酿酒酵母产生6′-SL的量略有减少，底物乳糖和Neu5Ac的消耗也略有减少。可以证明的是酿酒酵母和CMP的添加量不能同时降低，只能选择其一，考虑到规模化生产的成本和难度问题，添加较高细胞浓度的酿酒酵母会较为复杂，且成本较高，所以我们考虑酿酒酵母的浓度依旧为60g/L，在这个条件的基础上探究CMP的添加浓度对6′-SL合成的影响。
(6)60g/L酿酒酵母条件下最佳CMP浓度对合成6′-SL影响
发酵条件：将酿酒酵母60g/L、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、50g/L工程菌株 JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入到以CMP(10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM或70mM)、 80mM Neu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、150mM Tris、20mMMgCl2、 1mM DTT、10mL/L甘油、10mL/L二甲苯、6mL/L乙醛、4g/L Nymeen S-215混合配置的溶液中，在 30℃，通无菌空气，发酵30h。
TLC结果如图22所示，可以看出添加浓度为20mM的CMP时，6′-SL合成量最多，底物消耗最多，添加浓度超过30mM的CMP会造成6′-SL合成量的降低。
(7)CMP浓度确定基础上最低酵母添加量的优化
发酵条件1：将酿酒酵母(30g/L、40g/L、50g/L或60g/L)、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、 50g/L工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入到以20mM CMP、80mMNeu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、150mM Tris、20mM MgCl2、1mMDTT、10mL/L甘油、10mL/L 二甲苯、6mL/L乙醛、4g/L Nymeen S-215混合配置的溶液中，在30℃，通无菌空气，发酵30h。
发酵条件2：将酿酒酵母(30g/L、40g/L、50g/L或60g/L)、50g/L工程菌株JM109(DE3)-pET28a-neuA、 50g/L工程菌株JM109-(DE3)-pET28a-ST6加入到以30mM CMP、80mMNeu5Ac、80mM乳糖为底物，和300mM葡萄糖、248.3mM KH2PO4、150mM Tris、20mM MgCl2、1mMDTT、10mL/L甘油、10mL/L 二甲苯、6mL/L乙醛、4g/L Nymeen S-215混合配置的溶液中，在30℃，通无菌空气，发酵30h。
TLC检测结果如图23所示，图23A为在添加20mM CMP的基础上，探究酿酒酵母的浓度对6′-SL 合成的影响，可以看出随着酿酒酵母浓度的增加，6′-SL的合成量逐渐增加。图23B为在添加30mM CMP 的基础上，探究酿酒酵母的浓度对6′-SL合成的影响，可以看出随着酿酒酵母浓度的增加，6′-SL的合成量逐渐增加。因此，可以证明60g/L酿酒酵母的添加量为最适浓度，使得6′-唾液酸乳糖转化率为82％，产量达到42g/L。
对比例1不同种属酵母对CMP转化成CTP的影响
不同种属酵母其体内所含的酶也不尽相同，本专利集中对比了酿酒酵母S.cerevisiae S189、酿酒酵母 S.cerevisiae W13-06、毕赤酵母Pichia pastoris GS115及酿酒酵母GDMCC 61663四种酵母细胞合成CTP 的能力。收集培养的四种细胞在初始条件(CMP 30mmol/L、葡萄糖150mmol/L、Na2HPO4-NaH2PO4 250 mmol/L、MgCl2 20mmol/L、pH 7，35℃水浴)下进行反应，每15min取一次样，HPLC检测CTP的生成，结果如图24所示，并非所有酵母细胞都可以合成CTP，而且合成的CTP不稳定，容易分解成CDP和CMP。
毕赤酵母几乎没有CTP生成，可能毕赤酵母中不含或仅含部分CTP合成酶系，或者部分酶无法分泌至胞外致使该酶促反应无法顺利进行。其余三种酵母细胞成功实现了CMP到CTP的转化，表明其合成CTP 的酶系体系完整。反应进行了2.5h之后CTP的转化率基本保持不变，CTP合成与降解趋于稳定。
S.cerevisiae S189、S.cerevisiae W13-06及酿酒酵母GDMCC 61663均能进行正常的CTP合成反应，S. cerevisiae W13-06最大转化率35％，S.cerevisiae S189及酿酒酵母GDMCC 61663则在60min时转化率达到最大，分别为55％和46％，两者CTP合成能力均高于前者，且酿酒酵母GDMCC 61663的CTP合成能力最强，选取该酵母作为CTP合成条件优化对象，反应时间为60min。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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aaaaatctcc ggaaaatgaa tggcatatca ttacttggtc atacaattaa tgctgctata 120
tcatcaaagt gttttgaccg cataattgtt tcgactgatg gcgggttaat tgcagaagaa 180
gctaaaaatt tcggtgtcga agtcgtccta cgccctgcag agctggcctc cgatacagcc 240
agctctattt caggtgtaat acatgcttta gaaacaattg gcagtaattc cggcacagta 300
accctattac aaccaaccag tccattacgc acaggggctc atattcgtga agctttttct 360
ctatttgatg agaaaataaa aggatccgtt gtctctgcat gcccaatgga gcatcatcca 420
ctaaaaaccc tgcttcaaat caataatggc gaatatgccc ccatgcgcca tctaagcgat 480
ttggagcagc ctcgccaaca attacctcag gcatttaggc ctaatggtgc aatttacatt 540
aatgatactg cttcactaat tgcaaataat tgttttttta tcgctccaac caaactttat 600
attatgtctc atcaagactc tatcgatatt gatactgagc ttgatttaca acaggcagaa 660
aacattctta atcacaagga aagctaa 687
<210> 2
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgggcaaaa aaatcctgac tgtgctgtct attttcattc tgtctgcatg taactccgac 60
aacacctctc tgaaagaaac cgtgtcttcc aactccgctg acgttgtgga gactgaaacc 120
taccagctga ctccgatcga cgccccgtct tctttcctgt cccactcctg ggaacagact 180
tgcggtaccc cgatcctgaa cgaatccgat aagcaagcaa tcagcttcga tttcgtggct 240
ccggaactga aacaggacga aaaatactgt ttcacgttca aaggcattac gggtgaccac 300
cgttacatca ccaacactac gctgacggtt gtagcgccga ctctggaggt ttatattgac 360
catgcgtccc tgccgtccct gcaacagctg atccacatca tccaagctaa agatgaatat 420
ccgtctaacc agcgtttcgt ttcctggaaa cgtgtgaccg tcgacgcaga taacgctaat 480
aaactgaaca ttcacaccta cccgctgaaa ggcaacaaca cttctccgga gatggttgcc 540
gcaatcgatg aatacgcgca gtctaaaaac cgtctgaaca tcgaatttta caccaacacc 600
gcccacgttt tcaacaacct gccgccgatc attcaacctc tgtataacaa tgaaaaagtg 660
aaaatttccc acatctccct gtacgacgat ggctcctccg aatacgtgtc cctgtaccaa 720
tggaaggata cgccgaacaa aatcgaaacc ctggaaggcg aagtgtccct gctggcaaac 780
tacctggcag gtacctctcc tgatgcacct aaaggcatgg gcaaccgtta caactggcac 840
aaactgtacg atacggatta ctacttcctg cgcgaggact atctggacgt tgaagcgaac 900
ctgcacgatc tgcgtgatta tctgggtagc agcgccaaac agatgccgtg ggacgaattt 960
gccaaactga gcgactccca gcagactctg ttcctggaca tcgttggctt cgataaagaa 1020
cagctgcagc agcagtatag ccagtctcct ctgccgaact tcatcttcac cggcacgacc 1080
acctgggcag gcggtgaaac caaagaatac tatgcgcagc agcaggttaa cgttatcaac 1140
aacgcgatca atgaaacgag cccatattac ctgggtaaag actacgacct gttcttcaaa 1200
ggtcacccag ctggcggcgt gattaacgat atcattctgg gcagcttccc tgacatgatc 1260
aacattccgg ctaaaatttc cttcgaagtt ctgatgatga ccgacatgct gcctgacacc 1320
gttgcgggta tcgcatcctc cctgtacttc accatcccgg ctgataaagt taatttcatc 1380
gttttcacct cttccgacac catcaccgat cgcgaagaag ctctgaagtc tccactggta 1440
caggttatgc tgactctggg cattgtaaaa gagaaagacg ttctgttttg ggctgaccac 1500
aaataa 1506

Claims (10)

1.一种生产6'-唾液酸乳糖的方法，其特征在于，以CMP、唾液酸和乳糖为底物，通过酿酒酵母、表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌和表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌三株菌株混菌进行发酵；
或，以CMP和唾液酸为底物时，先加入酿酒酵母菌和表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌合成CMP-Neu5Ac，再加入乳糖和表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌；
或，以CTP、唾液酸和乳糖为底物时，加入表达CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,6-唾液酸转移酶的重组菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-2,6-唾液酸转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CMP-Neu5Ac合成酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌为宿主。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S189、Saccharomyces cerevisiae W13-06和GDMCC 61663。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以CMP、唾液酸和乳糖为底物时，CMP-Neu5Ac合成酶的重组菌和表达α-2,3-唾液酸转移酶的重组菌的添加量为45～55g/L，酿酒酵母的添加量为30～150g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以CMP、唾液酸和乳糖为底物时，CMP、唾液酸和乳糖的含量分别为10-90mM、50～90mM和70～90mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在以CMP、唾液酸和乳糖为底物时，在28～32℃、180～220r/min条件下发酵。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应时间为25～40h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应全程通无菌空气。
10.权利要求1～9任一所述方法生产的6'-唾液酸乳糖在制备婴幼儿奶粉或补剂中的应用。
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