CN112458034A - 一种基因工程构建的重组大肠杆菌及生物合成6’-唾液乳糖的方法 - Google Patents

一种基因工程构建的重组大肠杆菌及生物合成6’-唾液乳糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因构建的重组大肠杆菌及生物合成6’‑唾液乳糖的方法，属于代谢工程领域。所述重组大肠杆菌是通过代谢工程的方法(包括删除竞争途径基因和表达关键途径基因)对大肠杆菌中6’‑唾液乳糖合成相关基因进行对应改造后得到的。利用该菌株进行摇瓶发酵24 h，可以得到4~5 g/L的6’‑唾液乳糖。该菌株能够协同利用葡萄糖和甘油碳源高效合成6’‑唾液乳糖。本发明构建的重组大肠杆菌具有广阔的应用前景，为生物法生成6’‑唾液乳糖提供了新的思路。

Description

一种基因工程构建的重组大肠杆菌及生物合成6’-唾液乳糖 的方法
技术领域
本发明涉及工业微生物代谢工程技术领域，具体涉及一种通过重组改造大肠杆菌及其工业发酵生产6’-唾液乳糖的应用。
背景技术
母乳一直被视为婴幼儿最好的食物来源，除了能为婴幼儿提供正常生长所需营养外，还具有众多牛乳不具有的益生元。其中重要组分人乳寡糖（human milkoligosaccharides，HMOs）是天然存在于人类母乳中的仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分，通常由2-10个单糖分子组成。大量研究表明，对于母乳喂养的婴儿，人乳寡糖发挥着十分广泛且有益的生物学作用，如促进肠道菌群中有益菌群的生长、防止病毒感染、阻碍病原体的黏附、维持肠道微生态平衡、调节肠道上皮细胞应答、免疫调节等。
6’-唾液乳糖可以作为生长刺激因子在婴儿结肠内选择性地刺激双歧杆菌增殖，也可以形成致病菌受体的可溶性类似物阻止与其受体结合，从而保护婴儿免于致病菌如空肠弯曲杆菌、肠道鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌、幽门螺旋杆菌以及诺瓦克病毒的感染。母乳中唾液乳糖水平的高低与婴儿大脑发育密切相关，因此其已经成为了一种营养和医药行业的重要功能寡糖。此外，一些基于唾液乳糖的衍生物，如含有唾液酸Lewis X结构的六糖，在许多的肿瘤细胞中高表达，已经被作为理想的肿瘤相关糖抗原，用于发展基于肿瘤相关抗原的糖疫苗。
近年来，针对不同的人乳寡糖，相继发展出多种化学合成以及酶法合成策略。化学全合成步骤繁琐，总收率较低，严重限制了其在规模生产中的应用。采用“一锅酶法”的合成策略不仅简便快捷，同时省去了多步的分离纯化，是一种相对快速有效的合成方法。但是该方法依然有其局限性，诸如不同的步骤需要不同的保护基操作、不同的步骤之间要有一定的相对反应活性差异、单磷酸或二磷酸核苷酸活化的糖供体价格昂贵等，成为制约其用于大量生产的“瓶颈”。
本发明采用基因工程构建的重组工程菌实现了6’-唾液乳糖的生物合成，为生物法探索生成目标代谢产物提供了新思路。
发明内容
本发明通过构建一株重组大肠杆菌，实现了从底物葡萄糖、甘油和乳糖到6’-唾液乳糖的生物合成。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种基因工程构建的重组大肠杆菌，其特征在于它是一种利用底物葡萄糖和乳糖转化合成6’-唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌，命名为GG110-SL6。
本发明进一步公开了所述基因工程构建的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于它具有6’-唾液乳糖的生物合成途径，主要是将葡萄糖和乳糖转化为6’-唾液乳糖，基于CRISPR-Cas9的方法删除乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、唾液酸分解利用途径基因（nanATEK）和/或6-磷酸葡萄糖胺分解代谢基因（nagAB），缺失删除6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（zwf）、6-磷酸果糖激酶基因（pfkAB）、乳酸脱氢酶基因（ldh）和/或丙酮酸醌氧化还原酶基因（poxB），同时在乙酸代谢途径基因ackA-pta位点插入替换了经过强启动子表达的lacY基因。
其中所述具有6’-唾液乳糖合成途径，是指过表达密码子优化的UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（neuC）、磷酸葡萄糖胺酰基转移酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（age）、N-乙酰神经氨酸合酶基因（neuB）、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因（neuA）、唾液酸转移酶基因（2,6ST）。
所述竞争途径被缺失是指，乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、唾液酸分解利用途径基因（nanATEK）以及6-磷酸葡萄糖胺分解代谢基因（nagAB）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（zwf）、6-磷酸果糖激酶基因（pfkAB）、乳酸脱氢酶基因（ldh）和/或丙酮酸醌氧化还原酶基因（poxB）。优选乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）。
所述竞争途径被缺失是指，乙酸代谢途径基因ackA-pta位点插入替换了经过强启动子表达的lacY基因。
所述密码子优化的UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（neuC）、N-乙酰神经氨酸合酶基因（neuB）、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因（neuA），是指来源于大肠杆菌、迟缓爱德华菌、溶血曼氏杆菌、空肠弯曲杆菌的其中一种或几种；优选大肠杆菌来源。
所述密码子优化的磷酸葡萄糖胺酰基转移酶（GNA1），是指来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、棉阿舒囊霉Ashbya gossypii、假囊酵母Eremotheciumcymbalariae、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis的其中一种，N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶（age），是指来源于集胞菌Synechocystis sp.、戈多尼伯特菌Gordonibacterpamelaeae、项圈藻Trichormus variabilis的其中一种或几种；优选酿酒酵母来源。
所述密码子优化的唾液酸转移酶（2,6ST），是指来源于达可马巴斯德菌Pasteurella dagmatis、鳆发光杆菌Photobacterium leiognathi、发光杆菌Photobacterium sp.的其中一种或几种。优选鳆发光杆菌来源。
本发明更进一步开了基因工程构建的重组大肠杆菌在高质量合成6’-唾液乳糖中的应用。实验结果显示，构建菌株可以生产得到2.5 g/L的6’-唾液乳糖。
本发明同时也公开了采用基因工程重组大肠杆菌进行发酵合成6’-唾液乳糖的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2）将步骤1）获得的种子液与含有氯霉素和卡那霉素的培养基，按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的培养基，35~37℃，180~220rpm，培养至OD600=0.6~0.8，并加入诱导剂无水四环素1~10nM、IPTG 0.05~1 mM，然后转入20~25℃，180~220rpm，补加乳糖继续培养24 h；发酵生产6’-唾液乳糖过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的葡萄糖和甘油，具体培养基组成如下：
SYT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：5-20 g，Yeast Extract（酵母提取物）：2-8g，NaCl（氯化钠）：2-8 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：1-5 g，KH2PO4（磷酸氢二钾）：2-8 g，NH4SO4（硫酸铵）：0.5-1.5 g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.5-1.5 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：10-100mg，MnSO4•H2O （水合硫酸锰）：1-5 mg，Na2SO4（硫酸钠）：5-25 mg，ZnSO4（硫酸锌）：5-20 mg，CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）：1-5 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.05-0.25mg，Glucose（葡萄糖）：10-40 g，Glycerol（甘油）：10-40 g，Lactose（乳糖）：0.5-4.5 g。
本发明更加详细的描述如下：
一种利用底物葡萄糖和乳糖转化合成6’-唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，具有6’-唾液乳糖的生物合成途径。同时表达UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶（neuC）、磷酸葡萄糖胺酰基转移酶（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶（age）、N-乙酰神经氨酸合酶（neuB）、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶（neuA）、唾液酸转移酶（2,6ST），将葡萄糖和乳糖转化为6’-唾液乳糖。基于CRISPR-Cas9的方法删除乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、唾液酸分解利用途径基因（nanATEK）和/或6-磷酸葡萄糖胺分解代谢基因（nagAB），缺失删除6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（zwf）、6-磷酸果糖激酶基因（pfkAB）、乳酸脱氢酶基因（ldh）和/或丙酮酸醌氧化还原酶基因（poxB），同时在乙酸代谢途径基因ackA-pta位点插入替换了经过强启动子表达的lacY基因，其制备的详细过程如下：
1）制备含有密码子优化的UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（neuC）、磷酸葡萄糖胺酰基转移酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（age）、N-乙酰神经氨酸合酶基因（neuB）、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因（neuA）、唾液酸转移酶基因（2,6ST）的重组质粒，获得重组合成途径的质粒；
2）将质粒pCas导入转化到宿主菌E. coli K-12 MG1655中，获得携带质粒的宿主菌；
3）以基因组为模板，设计待删除基因的sgRNA以及同源臂，通过Gibson组装的方法体外构建pTarget质粒，并转化感受态细胞DH5α；
4）提取测序正确的pTarget质粒；
5）向步骤2所得的携带质粒pCas的宿主菌中转化pTarget质粒，电击复苏后涂布于LB+壮观霉素(50 ug/ml)+L-(+)-arabinose(10 mM)的平板，获得目的基因被删除的重组菌；
6）以步骤5所得的删除一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤3）4）5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将lacZ、lacA、nanATEK、nagAB、zwf、pfkAB、ldh、poxB基因全部敲除，获得缺失上述所有基因的重组大肠杆菌；
7）整合基因同缺失基因类似，首先将质粒pCas导入转化到宿主菌E. coli K-12MG1655中，获得携带质粒的宿主菌；
8）以基因组为模板，设计待整合经过强启动子表达基因lacY、插入位点乙酸代谢途径基因ackA-pta的sgRNA以及同源臂，通过Gibson组装的方法体外构建pTarget质粒，并转化感受态细胞DH5α；
9）提取测序正确的pTarget质粒；
10）向步骤7所得的携带质粒pCas的宿主菌中转化pTarget质粒，电击复苏后涂布于LB+壮观霉素(50ug/ml)+L-(+)-arabinose(10 mM)的平板，获得乙酸代谢途径基因ackA-pta被经过强启动子表达基因lacY替换整合的重组菌；
11）将步骤10）中基因改造的大肠杆菌制备感受态，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到感受态中，获得能够利用乳糖合成6’-唾液乳糖的重组大肠杆菌。
所述任一大肠杆菌工程菌在生产6’-唾液乳糖中的应用，也在本发明的保护范围之内。
所述应用的步骤如下：
1）活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2）将步骤1）获得的种子液与含有氯霉素和卡那霉素的培养基，按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的培养基，35~37℃，180~220rpm，培养至OD600=0.6~0.8，并加入诱导剂无水四环素1~10nM、IPTG 0.05~1 mM，然后转入20~25℃，180~220rpm，补加乳糖继续培养24 h；发酵生产6’-唾液乳糖过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的葡萄糖和甘油。具体培养基组成如下：
SYT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：5-20 g，Yeast Extract（酵母提取物）：2-8g，NaCl（氯化钠）：2-8 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：1-5 g，KH2PO4（磷酸氢二钾）：2-8 g，NH4SO4（硫酸铵）：0.5-1.5 g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.5-1.5 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：10-100mg，MnSO4•H2O （水合硫酸锰）：1-5 mg，Na2SO4（硫酸钠）：5-25 mg，ZnSO4（硫酸锌）：5-20 mg，CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）：1-5 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.05-0.25mg， Glucose（葡萄糖）：10-40 g，Glycerol（甘油）：10-40 g，Lactose（乳糖）：0.5-4.5 g。
本发明所用到的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6的序列如下：
SEQ ID NO.1
neuC
ATGAAAAAGATTCTGTTCATCACCGGTAGCCGCGCGGATTACAGCAAAATCAAAAGCCTGATGTACCGCGTTCAGAACAGCAGCGAATTTGAACTGTACATCTTCGCCACCGGTATGCATCTGAGCAAAAACTTCGGCTACACCGTCAAAGAGCTGTACAAAAACGGGTTCAAAAACATCTACGAGTTCATCAACTACGACAAATACTACCAGACCGATAAAGCACTGGCTACCACCATTGATGGCTTTTCTCGTTACGCGAACGAACTGAAACCGGATCTGATCGTTGTTCACGGGGATCGTATTGAACCGCTGGCAGCAGCAATTGTAGGCGCACTGAATAACATTCTGGTTGCGCATATCGAAGGCGGCGAAATTTCTGGCACCATTGATGATAGCCTGCGTCACGCAATCAGCAAACTGGCACATATCCATCTGGTCAACGACGAATTTGCGAAACGTCGTCTGATGCAACTGGGGGAAGACGAGAAAAGCATCTTCATCATCGGCAGTCCGGATCTGGAACTGCTGAACGACAACAAAATCAGCCTGAGCGAGGCGAAAAAATACTACGACATCAACTACGAGAACTACGCCCTGCTGATGTTTCATCCGGTTACCACCGAGATCACCAGCATCAAAAACCAGGCGGATAACCTGGTCAAAGCGCTGATCCAGAGCAACAAAAACTACATCGTCATCTACCCGAACAACGACCTGGGTTTTGAACTGATCCTGCAGAGCTACGAAGAATTTAAAAACAACCCGCGCTTCAAACTGTTTCCGAGCCTGCGCTTTGAGTACTTCATCACCCTGCTGAAAAACGCGGACTTCATCATCGGTAACAGCAGCTGCATCCTGAAAGAAGCACTGTACCTGAAAACCGCCGGTATTCTGGTTGGTAGTCGTCAAAACGGTCGTCTGGGTAACGAAAACACCCTGAAAGTCAACGCGAACAGCGACGAAATCCTGAAAGCGATCAACACCATCCACAAAAAACAGGACCTGTTCAGCGCGAAACTGGAAATCCTGGACAGCAGCAAACTGTTCTTCGAGTACCTGCAGAGCGGCGATTTCTTTAAACTGAGCACCCAGAAAGTCTTCAAAGACATCAAATAA
SEQ ID NO.2
neuB
ATGAAAGAGATCAAAATCCAGAACATCATCATCAGCGAAGAAAAAGCGCCGCTGGTAGTTCCGGAAATTGGCATTAACCACAACGGTAGCCTGGAACTGGCCAAAATCATGGTTGACGCAGCGTTTAGCGCGGGCGCGAAAATTATCAAACACCAGACCCACATTGTCGAAGACGAAATGAGCAAAGCGGCGAAAAAAGTTATCCCGGGTAACGCGAAAATCAGCATCTACGAGATCATGCAGAAATGCGCGCTGGACTACAAAGACGAACTGGCGCTGAAAGAGTACACCGAGAAACTGGGCCTGGTTTATCTGAGTACCCCGTTTTCTCGCGCAGGTGCAAATCGTCTGGAAGATATGGGCGTTAGCGCGTTTAAAATTGGTAGCGGTGAGTGCAACAACTACCCGCTGATCAAACACATCGCGGCGTTCAAAAAACCGATGATCGTCTCCACCGGCATGAATAGCATCGAAAGCATCAAACCGACCGTCAAAATCCTGCTGGACAACGAAATCCCGTTCGTTCTGATGCATACCACCAACCTGTATCCGACCCCGCATAATCTGGTTCGTCTGAACGCGATGCTGGAGCTGAAAAAAGAATTTAGCTGCATGGTAGGTCTGAGCGATCATACCACCGATAATCTGGCTTGTCTGGGCGCAGTTGTACTGGGCGCTTGCGTTCTGGAACGTCATTTCACCGATAGCATGCATCGTAGCGGTCCGGATATTGTTTGCAGCATGGATACCAAAGCGCTGAAAGAGCTGATCATCCAGTCCGAACAGATGGCGATTATTCGCGGCAACAACGAGAGCAAAAAAGCGGCGAAACAGGAACAGGTCACCATTGATTTTGCGTTTGCGAGCGTGGTCAGCATCAAAGACATCAAAAAAGGCGAGGTCCTGAGCATGGACAACATCTGGGTAAAACGTCCGGGTCTGGGCGGTATTTCTGCAGCAGAATTTGAAAACATCCTGGGCAAAAAAGCGCTGCGCGATATCGAAAACGACGCTCAACTGAGCTACGAAGATTTTGCGTAA
SEQ ID NO.3
neuA
ATGAGTCTGGCAATTATTCCGGCACGCGGCGGTAGCAAAGGCATCAAAAACAAAAACCTGGTCCTGCTGAACAACAAACCGCTGATCTACTACACCATCAAAGCGGCACTGAACGCGAAAAGCATCAGCAAAGTCGTCGTTAGCAGCGATTCCGACGAAATCCTGAACTACGCGAAAAGCCAGAACGTGGATATTCTGAAACGTCCGATTAGTCTGGCACAGGACGATACCACCTCTGATAAAGTCCTGCTGCACGCGCTGAAATTCTACAAAGACTACGAGGACGTCGTCTTTCTGCAACCGACCAGTCCGCTGCGTACCAATATTCACATCAACGAGGCGTTCAACCTGTACAAAAACAGCAACGCAAACGCACTGATTAGCGTTAGCGAGTGCGACAACAAAATCCTGAAAGCGTTCGTCTGTAACGATTGCGGCGATCTGGCAGGTATCTGCAACGACGAATACCCGTTTATGCCGCGTCAGAAACTGCCGAAAACCTACATGAGCAACGGCGCGATCTACATCCTGAAAATCAAAGAGTTCCTGAATAACCCGAGCTTTCTGCAGAGCAAAACCAAACACTTCCTGATGGACGAGAGCAGTAGCCTGGATATTGACTGCCTGGAAGACCTGAAAAAAGTCGAGCAGATTTGGAAAAAATAA
SEQ ID NO.4
Pl145-2,6ST
ATGTGCAACGACAACCAGAACACCGTAGACGTGGTTGTTAGCACCGTCAACGATAACGTGATCGAGAACAACACCTACCAGGTCAAACCGATTGATACCCCGACCACCTTCGATAGCTACAGTTGGATTCAGACCTGCGGCACCCCGATTCTGAAAGACGACGAGAAATACAGCCTGAGCTTCGATTTTGTCGCACCGGAACTGGATCAGGACGAGAAATTCTGCTTCGAATTTACCGGCGACGTTGACGGTAAACGTTACGTTACCCAGACCAATCTGACCGTTGTTGCACCGACCCTGGAAGTTTACGTTGATCACGCAAGTCTGCCGAGTCTGCAGCAGCTGATGAAAATCATCCAGCAGAAAAACGAGTACAGCCAGAACGAACGCTTCATTAGCTGGGGTCGTATTCGTCTGACCGAAGATAACGCGGAGAAACTGAACGCGCATATCTATCCGCTGGCGGGTAATAATACCAGCCAGGAACTGGTAGACGCGGTTATTGACTACGCAGATAGCAAAAACCGCCTGAACCTGGAACTGAACACCAATACCGGCCATAGCTTTCGTAATATTGCGCCGATTCTGCGCGCAACCAGTAGCAAAAACAACATCCTGATCAGCAACATCAATCTGTACGACGACGGTAGCGCAGAATACGTTAGCCTGTACAACTGGAAAGACACCGACAACAAAAGCCAGAAACTGAGCGACAGCTTCCTGGTTCTGAAAGACTACCTGAACGGCATCAGCAGCGAAAAACCGAACGGTATCTACAGCATCTACAACTGGCACCAGCTGTACCATAGCAGCTACTACTTCCTGCGCAAAGACTACCTGACCGTTGAAACCAAACTGCACGATCTGCGCGAATATCTGGGCGGTTCCCTGAAACAGATGAGTTGGGATACCTTCAGCCAGCTGAGCAAAGGCGATAAAGAGCTGTTCCTGAACATCGTCGGCTTTGATCAGGAGAAACTGCAGCAGGAATATCAGCAGAGCGAACTGCCGAACTTCGTATTTACCGGCACCACCACCTGGGCAGGCGGTGAAACCAAAGAATACTACGCGCAGCAGCAGGTCAACGTCGTTAACAACGCGATCAACGAGACCAGTCCGTATTATCTGGGTCGCGAACACGACCTGTTCTTTAAAGGTCATCCGCGCGGCGGCATTATTAACGACATCATCCTGGGCAGCTTCAACAACATGATCGACATCCCGGCGAAAGTCAGCTTTGAAGTCCTGATGATGACCGGTATGCTGCCGGATACCGTTGGGGGTATTGCAAGTAGCCTGTACTTTAGCATTCCGGCGGAAAAAGTCAGCTTCATCGTCTTCACCAGCAGCGATACCATTACCGATCGCGAAGACGCACTGAAAAGTCCGCTGGTTCAGGTCATGATGACGCTGGGTATCGTCAAAGAGAAAGATGTGCTGTTCTGGTGCTAA
SEQ ID NO.5
GNA1
ATGAGTCTGCCGGACGGTTTTTACATCCGTCGTATGGAAGAAGGCGATCTGGAACAGGTTACCGAAACCCTGAAAGTTCTGACCACCGTTGGCACCATTACCCCGGAAAGTTTTAGCAAACTGATCAAATACTGGAACGAGGCGACCGTTTGGAACGACAACGAGGACAAAAAGATTATGCAGTACAACCCGATGGTCATCGTCGACAAACGTACCGAAACCGTTGCAGCAACCGGTAATATCATCATCGAGCGCAAAATCATCCACGAACTGGGTCTGTGCGGTCATATTGAAGACATCGCGGTTAACAGCAAATATCAGGGTCAGGGTCTGGGTAAACTGCTGATCGATCAGCTGGTTACCATTGGGTTCGACTACGGCTGCTACAAAATCATCCTGGACTGCGACGAGAAAAACGTCAAATTCTACGAGAAATGCGGCTTCAGCAACGCTGGCGTTGAAATGCAGATCCGCAAATAA
SEQ ID NO.6
age
ATGATCGCACATCGTCGTCAAGAACTGGCACAGCAGTACTATCAGGCGCTGCATCAAGATGTTCTGCCGTTCTGGGAGAAATATAGCCTGGATCGTCAAGGGGGGGGTTATTTTACCTGCCTGGATCGTAAAGGCCAGGTTTTTGACACCGACAAATTCATCTGGCTGCAGAACCGTCAAGTCTGGCAGTTTGCGGTCTTTTATAACCGCCTGGAACCGAAACCGCAGTGGCTGGAAATTGCACGTCACGGCGCAGATTTTCTGGCACGTCACGGTCGCGATCAAGACGGCAATTGGTATTTCGCGCTGGATCAAGAAGGTAAACCGCTGCGTCAGCCGTATAACGTTTTCAGCGATTGCTTCGCGGCAATGGCATTTAGTCAGTACGCACTGGCATCTGGCGCACAAGAAGCAAAAGCAATCGCACTGCAGGCGTATAACAACGTTCTGCGTCGTCAGCATAATCCGAAAGGTCAGTACGAGAAAAGTTATCCGGGCACCCGCCCGCTGAAAAGTCTGGCTGTTCCGATGATCCTGGCAAATCTGACCCTGGAAATGGAGTGGCTGCTGCCGCCGACCACCGTTGAAGAAGTTCTGGCACAAACCGTCCGCGAAGTTATGACCGACTTTCTGGACCCGGAAATTGGTCTGATGCGCGAAGCAGTTACCCCGACCGGCGAATTTGTTGATAGCTTTGAAGGTCGTCTGCTGAATCCGGGTCACGGTATTGAGGCCATGTGGTTCATGATGGATATTGCGCAACGTTCTGGCGATCGTCAACTGCAAGAACAGGCAATTGCGGTAGTTCTGAACACCCTGGAATACGCTTGGGACGAAGAATTTGGCGGCATCTTCTACTTTCTGGATCGCCAAGGTCATCCGCCGCAACAACTGGAGTGGGATCAAAAACTGTGGTGGGTCCATCTGGAAACCCTGGTTGCACTGGCAAAAGGTCATCAGGCAACCGGTCAAGAAAAATGCTGGCAGTGGTTCGAACGCGTTCACGATTACGCTTGGAGCCATTTTGCAGATCCGGAATACGGCGAGTGGTTTGGCTATCTGAATCGTCGCGGCGAAGTTCTGCTGAATCTGAAAGGCGGCAAATGGAAAGGCTGTTTTCACGTTCCGCGCGCTCTGTGGCTGTGCGCAGAAACCCTGCAACTGCCGGTTAGTTAA
本发明公开的基因工程构建的重组大肠杆菌及生物合成6’-唾液乳糖的方法所具有的积极效果在于：
（1）本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌具有以葡萄糖、甘油为碳源发酵合成6’-唾液乳糖的特点，发酵24 h，可以得到4~5 g/L的6’-唾液乳糖。相对于现有技术具有协同利用葡萄糖和甘油碳源高效合成目的产物的特点。
（2）本发明建立了一条6’-唾液乳糖的合成途径，同时克服了现有的技术难题，获得了一个高效的基因敲除方案；原始菌株在通过基因工程改造以后，除了生产6’-唾液乳糖外，没有改变菌株的其它特性，不影响发酵生产；该菌株采用的质粒为成熟的大肠杆菌质粒，因此在代谢过程中不影响细菌生长和正常代谢。
附图说明
图1是质粒pACYC184-neuCBA-2,6ST的图谱，用来过表达6’-唾液乳糖合成途径中的neuC、neuB、neuA、2,6ST基因；
图2是质粒pET28m-GNA1-age-neuAB-2,6ST的图谱，用来过表达6’-唾液乳糖合成途径中的GNA1、age、neuA、neuB、2,6ST基因；
图3是质粒pTarget的图谱，用来缺失大肠杆菌途径中的lacZ、lacA、nanATEK、nagAB、zwf、pfkAB、ldh、poxB基因以及ackA-pta被经过强启动子表达基因lacY替换整合的重组菌；
图4是本发明中构建的合成6’-唾液乳糖的代谢途径；
图5是ESI-MS检测重组菌株发酵液。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受实施例的限制；
以下实施例中所用的材料、试剂、仪器和方法未经特殊说明均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得；
本发明中质粒提取采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（Catalog NO.：B518191），切胶回收是采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式胶回收试剂盒（Catalog NO.：B518131），DNA片段的连接是使用fermentas公司的T4 DNA Ligase（Catalog NO.：EL0014），DNA片段的扩增使用fermentas公司的pfu DNApolymerase（Catalog NO.：EP0571），PCR质粒模板的消化使用fermentas公司的FastDigest
E. coli电击转化实验使用Bio-Rad的电转仪（Catalog NO.：165-2100）。细菌基因组提取使用北京康为世纪生化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒（Catalog NO.：CW0552S）。
实施例1
基因的获取
本实施例中，对不同来源的基因进行密码子优化，包括：来源于大肠杆菌的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC（优化基因号SEQ ID NO.1），乙酰神经氨酸合成酶基因neuB（优化基因号SEQ ID NO.2），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA（优化基因号SEQ ID NO.3），来源于Photobacterium leiognathi的2,6ST基因（优化基因号SEQ ID NO.4），来源于酿酒酵母的磷酸葡萄糖胺酰基转移酶基因GNA1（优化基因号SEQ ID NO.5），来源于集胞菌Synechocystis sp.的N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因age（优化基因号SEQ ID NO.6）。
实施例2
重组质粒的制备
对实施例1中获得的密码子优化的来源于大肠杆菌的CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA，乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并进行双酶切，酶切后的片段与同样经过双酶切的质粒pACYC184质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下连接5h，连接产物转化E. coli DH5α，并在氯霉素平板上进行筛选，获得重组质粒pACYC-neuCBA。
对实施例1中获得的来源于Photobacterium leiognathi的2,6ST基因进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，双酶切后的片段与同样经过双酶切的pACYC-neuCBA质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下连接5h，连接产物转化E. coli DH5α，并在链霉素板上进行筛选，获得重组质粒pACYC-neuCBA。
对实施例1中获得的密码子优化的来源于酿酒酵母的磷酸葡萄糖胺酰基转移酶基因GNA1，来源于集胞菌Synechocystis sp.的N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因age进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并进行双酶切，酶切后的片段与同样经过双酶切的质粒pET28m质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下连接5h，连接产物转化E. coli DH5α，并在卡那霉素平板上进行筛选，获得重组质粒pET28m-GNA1-age。
对实施例1中获得的密码子优化的来源于大肠杆菌的CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA，乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，来源于Photobacterium leiognathi的2,6ST基因进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，双酶切后的片段与同样经过双酶切的pET28m- GNA1-age质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下连接5h，连接产物转化E. coli DH5α，并在链霉素板上进行筛选，获得重组质粒pET28m-GNA1-age-neuAB-2,6ST。
实施例3
基因的敲除
本实施例使用Red同源重组辅助的CRISPR-Cas9方法进一步简化了基因编辑方法，使得能够高效快速连续地对大肠杆菌基因组进行编辑，迅速获得设计好的遗传和生理代谢特征。下面以ldh基因为例，详细阐述基因敲除的步骤，其余基因的敲除与此相同。
在NCBI中查找E. coli ldh基因的核苷酸序列，设计ldh基因的缺失引物和鉴定引物。
实施例4
E. coli各个基因缺失的构建
打靶质粒pTarget的设计和构建
1)线性化载体的制备：反向扩增pTarget质粒骨架，一端含有sgRNA序列5’ 15-25bp的同源序列，另一端含有待删除基因的下游同源臂3’的15-25 bp的同源序列。
2)目的片段的克隆：以基因组为模板，设计上下游同源片段均与上一个片段保持15-25 bp的同源序列。
3)N20的设计：设计待删除基因的sgRNA，将待删除区域的DNA序列输入TargetSequence条目，碱基数不超过1000个，PAM Type选择SpCas9 from Streptococcuspyogenes：5’-NGG-3’。Target genome选择others里的Escherichia coli (K-12,MG1655)，网址为：http://www.rgenome.net/cas-designer/。
4)通过Gibson组装的方法体外构建pTarget质粒，并转化感受态细胞DH5α，PCR验证并测序。
目的基因的敲除
1)1:100转接过夜培养的E. coli K-12 MG1655菌液至含200 mL LB液体培养基中，于37 ℃下180~200 rpm振荡培养至菌液至OD600 ≈ 0.6-0.8。
2)将菌液转移至预冷的无菌50 mL离心管中，4℃，5000 g离心5 min，收集菌体，弃上清。
3)加入50 mL预冷的新鲜配置的10%甘油充分洗涤重悬菌体，4℃，5000 g离心5min，弃上清。
4)重复步骤3和4两次。
5)加入适量预冷的10%的甘油，充分重悬菌体，每管50-200 μL分装至1.5 mL离心管中，冰上放置备用。
6)将温敏质粒pCas导入转化到上述感受态中，30℃培养，获得携带质粒的宿主菌。
7)上述步骤6)所得菌株于30℃，200 rpm振荡培养，用1)-5)步骤制备含pCas温敏质粒的感受态细胞，转化4.1所得的pTarget质粒，电击复苏后涂布于LB+壮观霉素(50 ug/ml)+L-(+)-arabinose(10 mM)的平板，获得目的基因被删除的重组菌。
8)上述步骤7)所得菌株于30 ℃，180~200 rpm振荡培养，加入0.5 mM IPTG诱导消除pTarget质粒。
9)以步骤8)所得的删除一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤1)-8)的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将lacZ、lacA、nanATEK、nagAB、zwf、pfkAB、ldh、poxB基因全部敲除，pCas质粒通过转到37 ℃培养消除，最终获得缺失上述所有基因的重组大肠杆菌，命名为GG100。
实施例5
E. coli缺失整合
缺失整合同实施例4相似，只是打靶质粒pTarget的设计和构建上有所不同，除了上下游同源臂，在其中间插入目的基因lacY以及启动子和核糖体结合位点，最终获得缺失上述所有基因的重组大肠杆菌，命名为GG110。
实施例6
产6’-唾液乳糖E. coli菌株的构建
以敲除和整合过的E. coli菌株GG110为基础，制备感受态细胞（方法参照实验步骤4.2），将pACYC184-neuCBA-2,6ST、pET28m-GNA1-age-neuAB-2,6ST转入，在LB平板（卡那霉素50 μg/ml，氯霉素25 μg/ml）上筛选正确的克隆。经PCR验证得到携带整个6’-唾液乳糖合成途径的菌株E. coli GG110-SL6。E. coli GG110-SL6能够在葡萄糖和甘油培养基上生长，最大生物量OD600可以达到4.5，图4为本发明中合成6’-唾液乳糖的代谢途径。
实施例7
E. coli GG110-SL6菌株生产6’-唾液乳糖
将菌株接种至5mL的LB培养基中（卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100μg/ml，链霉素50μg/ml），37℃，180~220rpm，过夜培养。第二天按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的SYT培养基，37℃，200 rpm，培养至OD600=0.6~0.8，并加入不同浓度诱导剂无水四环素0.5 nM、1 nM、2 nM、5 nm、7.5 nM、10 nM，IPTG 0.05 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.5mM、0.75mM、1 mM，然后转入25℃，200 rpm，补加乳糖继续培养24 h。取样，4℃，7000g，离心10min，将上清与沉淀分开。上清过0.22μm滤膜。通过ESI-MS和高效液相色谱检测。
SYT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：10 g，Yeast Extract（酵母提取物）：4 g，NaCl（氯化钠）：2 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：1 g，KH2PO4（磷酸氢二钾）：2 g，NH4SO4（硫酸铵）：0.5 g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.5 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：10mg，MnSO4•H2O（水合硫酸锰）：2 mg，Na2SO4（硫酸钠）：5 mg，ZnSO4（硫酸锌）：5 mg，CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）：1 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.1 mg，Glucose（葡萄糖）：20 g，Glycerol（甘油）：20 g，Lactose（乳糖）：2 g。
沉淀首先用灭菌水悬浮，4℃，7000 g，离心10min，重复一次，然后采取反复冻融来破碎细胞，破碎后，4℃，5100g，离心25min，离心，将上清转移至10mL的离心管中，过0.22μm滤膜，得到2.5 g/L的6’-唾液乳糖，通过ESI-MS检测，图5为ESI-MS检测结果。
6’-唾液乳糖的检测：
ESI-MS，仪器：Finnigan LCQ Advantage
MAX ion trap mass spectrometer
(Thermo Electron,CA)离子化模式：电喷雾负离子模式;
电喷雾范围：400-700m/z;
干燥器温度：250℃；干燥器流速：10L/min;
喷雾压力：45psi；毛细管电压：3500V;高效液相检测
色谱柱：Venusil C18柱（5μm particle size，4.6 by 250mm）;
流动相：10% 乙腈， 90% 三乙胺冰醋酸（pH 6.0）;
流速：0.6mL/min;
进样量5μL。
检测结果如图5所示，该产物为6’-唾液乳糖。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的范围和精神。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 一种基因工程构建的重组大肠杆菌及生物合成6'-唾液乳糖的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaaaaga ttctgttcat caccggtagc cgcgcggatt acagcaaaat caaaagcctg 60
atgtaccgcg ttcagaacag cagcgaattt gaactgtaca tcttcgccac cggtatgcat 120
ctgagcaaaa acttcggcta caccgtcaaa gagctgtaca aaaacgggtt caaaaacatc 180
tacgagttca tcaactacga caaatactac cagaccgata aagcactggc taccaccatt 240
gatggctttt ctcgttacgc gaacgaactg aaaccggatc tgatcgttgt tcacggggat 300
cgtattgaac cgctggcagc agcaattgta ggcgcactga ataacattct ggttgcgcat 360
atcgaaggcg gcgaaatttc tggcaccatt gatgatagcc tgcgtcacgc aatcagcaaa 420
ctggcacata tccatctggt caacgacgaa tttgcgaaac gtcgtctgat gcaactgggg 480
gaagacgaga aaagcatctt catcatcggc agtccggatc tggaactgct gaacgacaac 540
aaaatcagcc tgagcgaggc gaaaaaatac tacgacatca actacgagaa ctacgccctg 600
ctgatgtttc atccggttac caccgagatc accagcatca aaaaccaggc ggataacctg 660
gtcaaagcgc tgatccagag caacaaaaac tacatcgtca tctacccgaa caacgacctg 720
ggttttgaac tgatcctgca gagctacgaa gaatttaaaa acaacccgcg cttcaaactg 780
tttccgagcc tgcgctttga gtacttcatc accctgctga aaaacgcgga cttcatcatc 840
ggtaacagca gctgcatcct gaaagaagca ctgtacctga aaaccgccgg tattctggtt 900
ggtagtcgtc aaaacggtcg tctgggtaac gaaaacaccc tgaaagtcaa cgcgaacagc 960
gacgaaatcc tgaaagcgat caacaccatc cacaaaaaac aggacctgtt cagcgcgaaa 1020
ctggaaatcc tggacagcag caaactgttc ttcgagtacc tgcagagcgg cgatttcttt 1080
aaactgagca cccagaaagt cttcaaagac atcaaataa 1119
<210> 2
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaagaga tcaaaatcca gaacatcatc atcagcgaag aaaaagcgcc gctggtagtt 60
ccggaaattg gcattaacca caacggtagc ctggaactgg ccaaaatcat ggttgacgca 120
gcgtttagcg cgggcgcgaa aattatcaaa caccagaccc acattgtcga agacgaaatg 180
agcaaagcgg cgaaaaaagt tatcccgggt aacgcgaaaa tcagcatcta cgagatcatg 240
cagaaatgcg cgctggacta caaagacgaa ctggcgctga aagagtacac cgagaaactg 300
ggcctggttt atctgagtac cccgttttct cgcgcaggtg caaatcgtct ggaagatatg 360
ggcgttagcg cgtttaaaat tggtagcggt gagtgcaaca actacccgct gatcaaacac 420
atcgcggcgt tcaaaaaacc gatgatcgtc tccaccggca tgaatagcat cgaaagcatc 480
aaaccgaccg tcaaaatcct gctggacaac gaaatcccgt tcgttctgat gcataccacc 540
aacctgtatc cgaccccgca taatctggtt cgtctgaacg cgatgctgga gctgaaaaaa 600
gaatttagct gcatggtagg tctgagcgat cataccaccg ataatctggc ttgtctgggc 660
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ggtccggata ttgtttgcag catggatacc aaagcgctga aagagctgat catccagtcc 780
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Claims (9)

1.一种基因工程构建的重组大肠杆菌，其特征在于它是一种利用底物葡萄糖和乳糖转化合成6’-唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌，命名为E. coli GG110-SL6。
2.权利要求1所述基因工程构建的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于它具有6’-唾液乳糖的生物合成途径，主要是将葡萄糖和乳糖转化为6’-唾液乳糖，基于CRISPR-Cas9的方法删除乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、唾液酸分解利用途径基因（nanATEK）和/或6-磷酸葡萄糖胺分解代谢基因（nagAB），缺失删除6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（zwf）、6-磷酸果糖激酶基因（pfkAB）、乳酸脱氢酶基因（ldh）和/或丙酮酸醌氧化还原酶基因（poxB），同时在乙酸代谢途径基因ackA-pta位点插入替换了经过强启动子表达的lacY基因。
3.权利要求2所述的构建方法，其中所述具有6’-唾液乳糖合成途径，是指过表达密码子优化的UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（neuC）、磷酸葡萄糖胺酰基转移酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（age）、N-乙酰神经氨酸合酶基因（neuB）、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因（neuA）、唾液酸转移酶基因（2,6ST）。
4.权利要求2所述的构建方法，其中所述竞争途径被缺失是指，乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、唾液酸分解利用途径基因（nanATEK）以及6-磷酸葡萄糖胺分解代谢基因（nagAB）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（zwf）、6-磷酸果糖激酶基因（pfkAB）、乳酸脱氢酶基因（ldh）和/或丙酮酸醌氧化还原酶基因（poxB）。
5.权利要求2所述重组大肠杆菌的构建方法，其中所述竞争途径被缺失是指，乙酸代谢途径基因ackA-pta位点插入替换了经过强启动子表达的lacY基因。
6.权利要求3所述的构建方法，其中所述密码子优化的UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（neuC）、N-乙酰神经氨酸合酶基因（neuB）、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因（neuA），是指来源于大肠杆菌、迟缓爱德华菌、溶血曼氏杆菌、空肠弯曲杆菌的其中一种或几种；
所述密码子优化的磷酸葡萄糖胺酰基转移酶基因（GNA1），是指来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、棉阿舒囊霉Ashbya gossypii、假囊酵母Eremothecium cymbalariae、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis的其中一种，N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶（age），是指来源于集胞菌Synechocystis sp.、戈多尼伯特菌Gordonibacter pamelaeae、项圈藻Trichormus variabilis的其中一种或几种；
所述密码子优化的唾液酸转移酶基因（2,6ST），是指来源于达可马巴斯德菌Pasteurella dagmatis、鳆发光杆菌Photobacterium leiognathi、发光杆菌Photobacterium sp.的其中一种或几种。
7.权利要求2所述的构建方法，其制备过程如下：
1）制备含有密码子优化的UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（neuC）、磷酸葡萄糖胺酰基转移酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因（age）、N-乙酰神经氨酸合酶基因（neuB）、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因（neuA）、唾液酸转移酶基因（2,6ST）的重组质粒，获得重组合成途径的质粒；
2）将质粒pCas导入转化到宿主菌E. coli K-12 MG1655中，获得携带质粒的宿主菌；
3）以基因组为模板，设计待删除基因的sgRNA以及同源臂，通过Gibson组装的方法体外构建pTarget质粒，并转化感受态细胞DH5α；
4）提取测序正确的pTarget质粒；
5）向步骤2所得的携带质粒pCas的宿主菌中转化pTarget质粒，电击复苏后涂布于LB+壮观霉素(50 ug/ml)+L-(+)-arabinose(10 mM)的平板，获得目的基因被删除的重组菌；
6）以步骤5所得的删除一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤3）4）5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将lacZ、lacA、nanATEK、nagAB、zwf、pfkAB、ldh、poxB基因全部敲除，获得缺失上述所有基因的重组大肠杆菌；
7）整合基因同缺失基因类似，首先将质粒pCas导入转化到宿主菌E. coli K-12MG1655中，获得携带质粒的宿主菌；
8）以基因组为模板，设计待整合经过强启动子表达基因lacY、插入位点乙酸代谢途径基因ackA-pta的sgRNA以及同源臂，通过Gibson组装的方法体外构建pTarget质粒，并转化感受态细胞DH5α；
9）提取测序正确的pTarget质粒；
10）向步骤7所得的携带质粒pCas的宿主菌中转化pTarget质粒，电击复苏后涂布于LB+壮观霉素(50ug/ml)+L-(+)-arabinose(10 mM)的平板，获得乙酸代谢途径基因ackA-pta被经过强启动子表达基因lacY替换整合的重组菌；
11）将步骤10）中基因改造的大肠杆菌制备感受态，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到感受态中，获得能够利用乳糖合成6’-唾液乳糖的重组大肠杆菌。
8.权利要求1所述基因工程构建的重组大肠杆菌在高效合成6’-唾液乳糖中的应用。
9.一种采用权利要求1所述的基因工程重组大肠杆菌发酵合成6’-唾液乳糖的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2）将步骤1）获得的种子液与含有氯霉素和卡那霉素的培养基，按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的培养基，35~37℃，180~220rpm，培养至OD600=0.6~0.8，并加入诱导剂无水四环素1~10nM、IPTG 0.05~1 mM，然后转入20~25℃，180~220rpm，补加乳糖继续培养24 h；发酵生产6’-唾液乳糖过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的葡萄糖和甘油，具体培养基组成如下：
SYT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：5-20 g，Yeast Extract（酵母提取物）：2-8 g，NaCl（氯化钠）：2-8 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：1-5 g，KH2PO4（磷酸氢二钾）：2-8 g，NH4SO4（硫酸铵）：0.5-1.5 g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.5-1.5 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：10-100mg，MnSO4•H2O （水合硫酸锰）：1-5 mg，Na2SO4（硫酸钠）：5-25 mg，ZnSO4（硫酸锌）：5-20 mg，CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）：1-5 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.05-0.25 mg，Glucose（葡萄糖）：10-40 g，Glycerol（甘油）：10-40 g，Lactose（乳糖）：0.5-4.5 g。
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