CN113957027B - 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法 - Google Patents

一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高乳酰‑N‑岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于生物技术和食品发酵工程领域。本发明通过对外源基因lgtA，wbgO和FucT14的表达和大肠杆菌内源基因galE，galT，galK，manB，manC，gmd和wcaG的过表达，从而构建得到乳酰‑N‑岩藻六糖的从头合成路径，通过增加氧化还原辅因子NADPH相关合成基因的表达，以及敲除大肠杆菌基因组乳酰‑N‑岩藻六糖合成途径中旁支路径的lacZ和wcaJ表达，获得高效合成乳酰‑N‑岩藻六糖的生产菌株，在摇瓶实验中，乳酰‑N‑岩藻六糖产量达到4.21g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑岩藻六糖的产量达到34.21g/L。

Description

一种提高乳酰-N-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种提高乳酰-N-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于生物技术和食品发酵工程领域。
背景技术
人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)具有拮抗微生物活性、抵抗病毒侵害和预防坏死性小肠结肠炎等功效，是母乳中仅次于乳糖和脂质的第三大固体营养成分，对婴儿消化系统的稳态和发育，以及出生后免疫系统的完善和建立发挥着重要作用。在婴幼儿配方乳粉中的添加人乳寡糖可以缩小母乳与配方乳粉之间的营养差距。乳酰-N-岩藻六糖 (LNDFH II)是人乳寡糖中的一种重要成分，是α1,4-岩藻糖基转移酶对乳酰-N-四糖(LNT) 进行双岩藻糖基化而形成的，体外研究表明：乳酰-N-岩藻六糖具有拮抗诺如病毒感染、调节免疫反应和维持肠道稳态的功效。鉴于乳酰-N-岩藻六糖的重要生物功效，为进一步阐明其作用机制，需要制备大量结构均一的该类化合物，然而从天然产物中分离提取所得到的量很少，远不及研究的需要，因此通过人工合成的方法获得该类化合物成为最佳选择。
相较于简单的人乳寡糖合成，复杂的人乳寡糖合成对未来科研工作者具有较高的挑战，乳酰-N-岩藻六糖的合成方法主要包括三种：分别是化学合成、酶法合成和发酵法合成。乳酰-N-岩藻六糖的化学合成需要众多繁琐的保护和脱保护步骤。酶促合成由于供体底物核苷酸糖相对昂贵且产量低，使得合成的乳酰-N-岩藻六糖成本较高，不适于工业化应用。利用改造的工程菌进行生物合成乳酰-N-岩藻六糖，可以从廉价碳源(葡萄糖、甘油、乳糖)生产乳酰-N-岩藻六糖，日益受到广泛关注。
目前为止，只有Florian等人利用补加岩藻糖的方法在大肠杆菌细胞内发酵合成乳酰-N- 岩藻六糖的报道，该研究的产量(547.2mg/L)较低(Florian等人，2015)，并且该方法补加UDP-岩藻糖供给，导致生产成本升高。因此，寻求廉价高产的乳酰-N-岩藻六糖从头合成途径来解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是目前急需解决的问题。
发明内容
[技术问题]
现有技术生产乳酰-N-岩藻六糖的成本高昂，且产量较低，不足以实现工业化生产，无法提供高效生产乳酰-N-岩藻六糖的菌株，也不能提供成本低廉且绿色高效生产乳酰-N-岩藻六糖的方法。
[技术方案]
本发明为了解决现有生物法合成的乳酰-N-岩藻六糖产量较低的问题，提供了一种产乳酰-N-岩藻六糖的基因工程菌及其构建方法。
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌敲除β-半乳糖苷酶基因 lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，和α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14。
在一种实施方式中，所述基因工程菌还过表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT，半乳糖激酶基因galK，过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA和/或β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO。
在一种实施方式中，所述基因工程菌还过表达氧化还原辅因子NADPH相关合成基因。
在一种实施方式中，所述氧化还原辅因子NADPH相关合成基因包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd。
在一种实施方式中，β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA来源于脑膜炎奈瑟球菌，β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO来源于大肠杆菌O55:H7，α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14来源于幽门螺杆菌。
在一种实施方式中，β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO来源于大肠杆菌O55:H7的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14来源于幽门螺杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT、半乳糖激酶基因galK、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶基因zwf，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd均来源于大肠杆菌K-12。
在一种实施方式中，UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE的核苷酸序列如SEQ IDNO.4 所示，半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，半乳糖激酶基因galK的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，磷酸甘露糖变位酶基因manB的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1或pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK、lgtA、wbgO、manB、manC、gmd、wcaG、 zwf、gnd和/或FucT14。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT和galK，利用pCOLADuet-1质粒表达基因FucT14，利用pACYCDuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK、manB、manC、gmd和wcaG，利用 pCOLADuet-1质粒表达基因FucT14。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT和galK，利用pACYCDuet-1质粒表达基因FucT14，利用pCOLADuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK、manB、manC、gmd和wcaG，利用 pACYCDuet-1质粒表达基因FucT14。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK和FucT14，利用pCOLADuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK和FucT14，利用pACYCDuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK和FucT14，利用pCOLADuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG，利用pACYCDuet-1质粒表达基因zwf。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK和FucT14，利用pCOLADuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG，利用pACYCDuet-1质粒表达基因gnd。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，利用pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK和FucT14，利用pCOLADuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG，利用pACYCDuet-1质粒表达基因zwf和gnd。
本发明提供了一种构建所述重组大肠杆菌的方法，先在大肠杆菌基因组中敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，再利用表达载体，过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因 gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14，UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT，半乳糖激酶基因galK，过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA和/或β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO。
在本发明的一种实施方式中，利用pTargetF质粒敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ。
在本发明的一种实施方式中，表达载体为pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和/或pETDuet-1，所述重组大肠杆菌以pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK和FucT14，以pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO，以pCOLADuet-1质粒表达基因manB、manC、gmd和wcaG，以pACYCDuet-1质粒表达基因gnd。
本发明还提供了上述基因工程菌在生产乳酰-N-岩藻六糖及含有乳酰-N-岩藻六糖的产品中的应用。
本发明还提供了一种生产乳酰-N-岩藻六糖的方法，所述方法为，以乳糖和甘油为碳源，利用上述基因工程菌为发酵菌株发酵生产乳酰-N-岩藻六糖。
在一种实施方式中，将上述基因工程菌接种于发酵培养基中，培养至OD600为10～13，加入终浓度为15～25g/L乳糖和0.2～1.0mM的IPTG。
在一种实施方式中，待初始碳源消耗完后，流加750～850g/L甘油和15～25 g/LMgSO4·7H2O，待初始乳糖消耗完后，流加乳糖使其浓度维持在3～10g/L。
在一种实施方式中，发酵条件为，培养温度为24～38℃，搅拌转速250～850r/min，通气量0.8～1.2vvm，pH 6.5～7.0，发酵时间为15～55h。
在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成为：10～20g/L甘油，10～15g/L磷酸二氢钾， 2～6g/L磷酸氢二氨，1～2g/L柠檬酸，1～2g/L七水硫酸镁和7.5～12.5mL/L微量金属元素，余量为水。
在一种实施方式中，所述微量金属元素的组成为：8～12g/L硫酸亚铁，2～2.5g/L七水硫酸锌，0.5～1.5g/L无水硫酸铜和1.5～2.5g/L二水氯化钙。
本发明的有益效果：
本发明通过α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14、β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA 和β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO的外源表达，组合调控乳酰-N-岩藻六糖合成途径中 UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT、半乳糖激酶基因galK、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd的表达并敲除大肠杆菌宿主乳酰-N-岩藻六糖合成途径中的lacZ和wcaJ表达，以及利用质粒拷贝数微调转录水平，从而达到提高乳酰-N-岩藻六糖产量的目的。
通过摇瓶发酵培养，本申请构建的基因工程菌生产乳酰-N-岩藻六糖的能力由初始的 0.38g/L提升至4.21g/L，在3L发酵罐中，乳酰-N-岩藻六糖的产量达到34.21g/L，为乳酰- N-岩藻六糖的工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1为乳酰-N-岩藻六糖代谢通路图。
具体实施方式
以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实例中所使用的质粒、 PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。
本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。
质粒和DNA产物的测序工作交予天霖生物科技(无锡)有限公司完成。
大肠杆菌感受态的制备：上海生工生物工程公司试剂盒。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。
LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，17g/L琼脂粉。
本发明实施例中所述的乳酰-N-岩藻六糖的测定方法使用HPLC，具体为：
1mL发酵液于100℃煮沸10min，13400rpm离心10min，上清液经0.22μm膜过滤处理，利用HPLC检测乳酰-N-岩藻六糖的生成量。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为RezexROA-organic acid(Phenomenex，USA)，柱温为50℃；流动相为5mM的H2SO4水溶液，流速为0.6mL/min；进样量为10μL。
摇瓶发酵培养方法如下：
将构建的工程菌接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养12h，得到种子液；再将种子液以2mL/100mL的接种量接入50mL发酵培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养至 OD600为0.6；加入终浓度为0.4mM的IPTG，同时加入乳糖至乳糖浓度为10g/L，25℃，200rpm的条件下诱导培养48h。
发酵培养基：20g/L甘油，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和微量金属元素(10mg/L硫酸亚铁，2.25mg/L七水硫酸锌，1.0mg/L无水硫酸铜，2.0mg/L二水氯化钙)，pH 6.8。
pCOLADuet-1：Novagen(WI，美国)
pACYCDuet-1：Novagen(WI，美国)
pCDFDuet-1：Novagen(WI，美国)
pETDuet-1：Novagen(WI，美国)
实施例1：大肠杆菌BL21(DE3)染色体组基因lacZ和wcaJ的敲除
利用CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌BL21(DE3)基因组中lacZ和wcaJ基因，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：
(1)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，使用引物对lacZ-up-F/R和lacZ-down-F/R， wcaJ-up-F/R和wcaJ-down-F/R通过PCR分别扩增出lacZ和wcaJ的上下游片段，胶回收。再分别以lacZ和wcaJ上下游片段为模板，采用lacZ-up-F/lacZ-down-R和wcaJ-up-F/wcaJ- down-R引物通过重叠PCR得到完整的lacZ和wcaJ模板，胶回收DNA片段。
(2)以原始pTargetF质粒(Addgene:#62226)为模板，lacZ-sg-F/R和wcaJ-sg-F/R为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N20序列分别替换为与lacZ、wcaJ序列互补的N20序列，得到带有靶向lacZ的pTargetF质粒和靶向wcaJ的pTargetF质粒(即带有lacZ和wcaJ 特异性N20序列的靶向质粒pTargetF)。转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布LB平板(含壮观霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。
(3)取pCas质粒(Addgene:#60847)及大肠杆菌BL21(DE3)感受态，冰上放置5min至感受态融化，取5μL质粒加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴30min，42℃热激 90s，立即置于冰上5min。加入1mL LB培养基，30℃，180rpm培养1h。取200μL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜至长出大肠杆菌 BL21(DE3)/pCas的单菌落。
(4)挑取大肠杆菌BL21(DE3)/pCas单菌落于LB培养基中，30℃培养1.0h，加入终浓度为30mM的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达。当OD600达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌BL21(DE3)/pCas感受态。
(5)将200ng步骤(2)构建的带有lacZ特异性N20序列的靶向质粒pTargetF和1000ng的供体DNA片段(即步骤(1)得到的完整的lacZ模板)，电转至步骤(4)制备的大肠杆菌BL21(DE3)/pCas感受态，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，挑取平板上的阳性菌落于LB中培养10h，送天霖生物科技(上海)有限公司测序验证。
(6)将步骤(5)测序验证敲除成功的阳性克隆菌落挑至4mL LB液体试管，加入终浓度为1mM的IPTG和30mg/L卡那霉素，30℃培养8-16h，以去除pTargetF质粒，再在 42℃培养12h，去除pCas质粒，得到基因组敲除lacZ基因的大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ，以大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ为宿主菌。
(7)利用相同的方法，结合步骤(2)中获得的带有wcaJ特异性N20序列的靶向质粒pTargetF和1000ng的供体DNA片段(即步骤(1)得到的完整的wcaJ模板)，敲除大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ基因组的wcaJ基因，得到相应的大肠杆菌BL21(DE3)的lacZ基因和 wcaJ基因敲除菌株BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ。
表1.lacZ敲除的引物序列
实施例2：乳酰-N-岩藻六糖从头合成路径的重组菌的构建
重组菌的构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表2)：
(1)galE、galT、galK、manB、manC、gmd和wcaG基因片段的获得：由于galE- galT-galK、manB-manC和gmd-wcaG在大肠杆菌基因组上是连续的基因片段，因此以大肠杆菌K-12的基因组为模板，以ETK-F/ETK-R、BC-F/BC-R和GW-F/GW-R分别扩增出galE- galT-galK、manB-manC和gmd-wcaG基因片段，胶回收DNA片段，将回收的galE-galT- galK和manB-manC基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)分别连接到载体pETDuet-1和pCOLADuet-1的BamHI/SaiI酶切位点之间，获得质粒pET-ETK和 pCOL-BC。用同样的连接方法，将回收的gmd-wcaG基因片段连接到质粒的pCOL-BC的 BgiII/XhoI酶切位点之间，最终获得的质粒为pCOL-BC-GW。
(2)lgtA、wbgO和FucT14基因片段的获得：委托天霖生物科技(上海)有限公司合成来源于脑膜炎奈瑟球菌的lgtA基因序列、来源于大肠杆菌O55:H7的wbgO基因序列和来源于幽门螺杆菌的α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14，将合成后的lgtA基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)连接到载体pCDFDuet-1的BamHI/SaiI酶切位点之间，获得质粒pCDF-lgtA，再将wbgO基因片段连接到载体质粒pCDF-lgtA的BgiII/XhoI 酶切位点之间，最终获得的质粒为pCDF-lgtA-wbgO；将FucT14基因片段连接到载体 pACYCDuet-1的BgiII/XhoI酶切位点之间，获得质粒pACY-FucT14。
表2.质粒构建引物
(3)根据乳酰-N-岩藻六糖合成通路中的关键基因将步骤(1)获得的质粒pET-ETK、pCDF-lgtA-wbgO、pCOL-BC-GW和pACY-FucT14转入实施例1获得大肠杆菌BL21(DE3) ΔlacZ，得到工程菌F1，该工程菌株发酵培养后经LC-MS鉴定确认产物为乳酰-N-岩藻六糖，其产量为0.38g/L(见表3)。得益于pET-ETK和pCDF-lgtA-wbgO对于乳酰-N-四糖的高效合成(1.58g/L)，以及pCOL-BC-GW和pACY-FucT14对于UDP-岩藻糖的合成。菌株F1的乳酰-N-岩藻六糖代谢通路图如图1所示。
实施例3：三种不同拷贝数重组质粒的筛选
利用实施例2的构建方法将基因片段manB-manC和gmd-wcaG分别连接到载体pACYCDuet-1的BamHI/SaiI和BgiII/XhoI酶切位点之间，最终获得质粒pACY-BC-GW；将基因片段FucT14分别连接到载体pET-ETK、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1的BgiII/XhoI 酶切位点之间，最终获得质粒pET-ETK-FucT14、pCOL-FucT14和pACY-FucT14；以质粒 pCOL-BC-GW为模板，以引物BCGW-F/BCGW-R(引物序列见表2)扩增出manB-manC- gmd-wcaG基因片段，胶回收DNA片段，将回收的manB-manC-gmd-wcaG基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)连接到载体pET-ETK的BgiII/XhoI酶切位点之间，获得质粒pET-ETK-BCGW。
在含有质粒pCDF-lgtA-wbgO和pET-ETK生产乳酰-N-四糖的工程菌株基础上，将表达 manB-manC-gmd-wcaG基因片段的质粒pCOL-BC-GW、pACY-BC-GW和pET-ETK-BCGW，和表达FucT14基因片段的质粒pCOL-FucT14、pACY-FucT14和pET-ETK-FucT14进行组合，得到了6种不同的工程菌，分别表示为F1～F6(表3)。发酵培养方法同实施例2，6种不同的工程菌株发酵后的乳酰-N-岩藻六糖的产量分别为0.38g/L、0.42g/L、0.46g/L、0.53g/L、 0.63g/L和0.97g/L。其中含有重组质粒pCDF-lgtA-wbgO、pET-ETK-FucT14、pCOL-BC- GW的工程菌(即菌株F3)获得了2.54g/L的最高产量(见表3)。
表3.各工程菌详细信息
实施例4：氧化还原辅因子NADPH的表达对乳酰-N-岩藻六糖合成的影响
还原型辅酶II(NADPH)作为供氢体可促进代谢反应，对于增加乳酰-N-岩藻六糖的合成效率可能有一定影响，参与磷酸戊糖途径的葡萄糖6-磷酸脱氢酶(zwf)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(gnd)是NADPH产生的主要来源。为此，以大肠杆菌K-12的基因组为模板，以引物zwf-F/R和gnd-F/R(引物序列见表2)分别扩增出zwf和gnd的基因片段，胶回收 DNA片段，利用实施例2的构建方法将回收的zwf和gnd基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)分别连接到载体pACYCDuet-1的BamHI/SaiI和BgiII/XhoI酶切位点之间，获得质粒pACY-zwf和pACY-gnd；将基因片段gnd连接到载体pACY-zwf的 BgiII/XhoI酶切位点之间，最终获得质粒pACY-zwf-gnd。
在实施例3菌株F3的基础上，将表达zwf基因片段的质粒pACY-zwf，表达gnd基因片段的质粒pACY-gnd和表达zwf和gnd基因片段的质粒pACY-zwf-gnd进行组合，得到了3种不同的工程菌，分别表示为F7～F9(表4)。3种不同的工程菌摇瓶发酵培养后的乳酰-N-岩藻六糖的产量分别为1.99g/L、2.81g/L和2.51g/L。其中含有重组质粒pCDF-lgtA-wbgO、 pET-ETK-FucT14、pCOL-BC-GW和pACY-gnd的工程菌(即菌株F8)获得了2.81g/L的最高产量(见表4)。因此，表明适当表达NADPH可以提高乳酰-N-岩藻六糖产量，其中表达 gnd基因对乳酰-N-岩藻六糖的产量提高最有效果。
表4.各工程菌详细信息
实施例5：敲除乳酰-N-岩藻六糖合成途径中分解代谢基因wcaJ的验证
为了增加乳酰-N-岩藻六糖的合成效率，通过实施例1所述步骤以大肠杆菌BL21(DE3) ΔlacZ为出发菌株，采用CRISPR/Cas9系统敲除编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因 wcaJ，从而阻断前体物质UDP-岩藻糖的其他代谢途径流失，得到敲除菌株BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ。将实施例4中筛选得到的最优质粒组合转化进入敲除菌株BL21(DE3) ΔlacZΔwcaJ中，得到菌株F10，摇瓶发酵培养可获得4.21g/L乳酰-N-岩藻六糖的最高产量(见表5)，提高了50％的产量，说明阻断UDP-岩藻糖的旁支路径有助于提高将乳酰-N-四糖的转化，增加乳酰-N-岩藻六糖的合成。
表5.各工程菌详细信息
实施例6：3L发酵罐分批补料生产乳酰-N-岩藻六糖
为了进一步验证乳酰-N-岩藻六糖合成方法的有效性，提高乳酰-N-岩藻六糖的产量。
将构建的基因工程菌F10接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养12h，得到种子液；将种子液以体积比10％的接种量接种到工作体积为1L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度37℃，搅拌转速800r/min，通气量1vvm，pH 6.8(补加氨水自动控制)。发酵12h (OD600约为12)，加入终浓度为20g/L乳糖和0.5mM的IPTG。为了维持菌体的生长以及乳酰-N-岩藻六糖的合成，待初始碳源消耗完后流加800g/L的甘油(含20g/L的 MgSO4·7H2O)以补充碳源，待初始乳糖消耗完后流加200g/L的乳糖并使其在体系中的浓度维持在10g/L左右至发酵结束。培养整个过程达到47h后，菌体OD600达到97，乳酰-N- 岩藻六糖的产量最高达到34.21g/L。表6为发酵过程中菌的乳酰-N-岩藻六糖合成量动态变化表。
表6.发酵过程中乳酰-N-岩藻六糖合成量动态变化表
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高乳酰-N-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
<130> BAA211311A
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 脑膜炎奈瑟球菌
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gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactaccgca 900
ggtggcaccc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960
gaagacgcca tctacggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020
tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagagaaa 1080
acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140
agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtcg aacagcattt tagccgcgag 1200
gcgctggcgg tggatcgcac tgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260
ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320
ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371
<210> 8
<211> 1437
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 8
atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60
ccgctttccc gcgtacttta ccccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120
ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggt gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180
aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa actcaccaag 240
aacattattc tcgaaccggc agggcgtaac actgcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300
gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtcttggc ggcggatcat 360
gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc gtatgccaaa 420
gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac ctgaaaccgg ttatggctat 480
attcgtcgcg gtgaagtgtc ggcgggtgag caggatacgg tggcctttga agtggcgcag 540
tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600
tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660
cgcccggata ttctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcgat 720
tttattcgtg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780
gtcatggaac gtacggcaga tgccgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagtgatgtc 840
ggttcttggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900
ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt acgccgaatc tggcctggtc 960
accaccgtcg gggtgaaaga tttggtggta gtgcagacca aagatgcagt gctgattgcc 1020
gaccgtaacg cggtgcagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080
catgagcatc gggtacatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140
gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200
cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtagtggtcg cgggaacggc aaaagtcact 1260
attgacggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320
acgcactgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcggtccggc 1380
tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgc ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437
<210> 9
<211> 1122
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
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atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60
tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgtgcatc gtcattcaac 120
accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180
cattatggcg acctgagtga tacctccaac ctgacacgca ttttgcgtga agtgcagccg 240
gatgaagtgt ataacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccggaa 300
tataccgcag acgttgatgc gatgggtacg ctgcgcctgc tcgaggcgat ccgcttcctc 360
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gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900
ggtgatgtga ttatcgccgt tgacccgcgt tacttccgtc cggcagaagt tgaaacgctg 960
ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020
gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
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taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300
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gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420
atcgccggga tcaaactgtg cgaatcttac aatcgccagt acggacgaga ttaccgttca 480
gtcatgccga ccaacctgta cgggccgcac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540
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gtatggggca gcggtacacc gatgcgtgaa ttcctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660
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tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcaccatcc gtgaactggc gcaaaccatc 780
gccaaagtgg tgggttacaa aggtcgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggtacg 840
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<211> 1476
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 11
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aaagttctct ctggtccgca agcacagcca gcaggcgaca aggctgagtt catcgaaaaa 960
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cgtgctgcgt ctgaagagta caactgggat ctgaactacg gcgaaatcgc gaagattttc 1080
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cagcaggcgc tgcgtgatgt cgttgcttat gcagtacaga acggtattcc ggttccgacc 1260
ttctccgcag cggttgccta ttacgacagc taccgtgctg ctgttctgcc tgcgaacctg 1320
atccaggcac agcgtgacta ttttggtgcg catacttata agcgtattga taaagaaggt 1380
gtgttccata ccgaatggct ggattaa 1407

Claims (7)

1.一种产乳酰-N-岩藻六糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG和α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14；
所述基因工程菌还过表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT，半乳糖激酶基因galK，过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA和/或β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO；
所述基因工程菌还过表达氧化还原辅因子NADPH相关合成基因；
β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，α-1,4岩藻糖基转移酶基因FucT14来源于幽门螺杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，半乳糖激酶基因galK的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，磷酸甘露糖变位酶基因manB的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述氧化还原辅因子NADPH相关合成基因包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和/或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌利用pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1或pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK、lgtA、wbgO、manB、manC、gmd、wcaG、zwf、gnd和/或FucT14。
4. 根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌利用pCOLADuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1表达galE、galT 、galK和FucT14，利用pACYCDuet-1表达gnd。
5.权利要求1~4任一所述的基因工程菌在生产乳酰-N-岩藻六糖及含有乳酰-N-岩藻六糖的产品中的应用。
6. 一种生产乳酰-N-岩藻六糖的方法，其特征在于，以乳糖和甘油为碳源，以0.2~1.0mM IPTG为诱导剂，利用权利要求1~4任一所述的基因工程菌发酵生产乳酰-N-岩藻六糖。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵条件为，培养温度为24~38℃，搅拌转速250~850 r/min，通气量0.8~1.2 vvm，pH 6.5~7.0。
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