CN107338275A - 利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产戊二胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产1,5‑戊二胺的方法，利用催化副产物CO₂自调节全细胞催化液的pH且采用非曝气的方法控制全细胞催化生产戊二胺。本发明提供的pH自控且非曝气的方法不仅可以高效地催化生产戊二胺，并且可以节省戊二胺生产的辅料成本和废气处理成本、简化过程控制工序、减少设备投资、提高生产工艺的可操作性。本发明技术在实践上适用于1,5‑戊二胺的工业化大规模生产，具有很高的实用性和应用性。

Description

利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产戊二胺的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法。

背景技术

1,5-戊二胺(1,5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷(1,5-Diaminopentane)，与二元酸可聚合成高分子聚酰胺材料(即尼龙)。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要组成单体—1,5-戊二胺具有重要的经济学和生态学意义。

全细胞催化法以赖氨酸为底物，利用菌体细胞中的赖氨酸脱羧酶催化产生1,5-戊二胺。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，利润率极低。因此，开发高效的以赖氨酸为底物的1,5-戊二胺生物催化的生产方法，不但可以开发新型生物基材料市场，还可以推进氨基酸发酵产业的转型升级。

在全细胞催化生产1,5-戊二胺的现有技术中，通常在宿主菌中过表达源于大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因cadA，构建得到能够催化生产1,5-戊二胺的菌体细胞。酶学活性测定发现cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶的最适催化pH为5.5，当pH大于5.5时，赖氨酸脱羧酶的活性随着pH升高而降低(Biochemistry,1974,13:662-670；Microbiology,1998,144:751-760；TheEMBO Journal,2011,30:931–944)。然而，在赖氨酸全细胞催化生成1,5-戊二胺的过程中，催化液pH持续上升，理论上会导致赖氨酸脱羧酶活性降低，从而降低催化合成1,5-戊二胺的效率。为了控制全细胞催化体系的pH维持在较低水平，通常使用高浓度缓冲液，或着在催化过程中实时补加酸性pH调节剂。酸性pH调节剂通常为无机酸(如盐酸和硫酸)或有机酸(如丁二酸、己二酸和癸二酸等)，如此在催化液中形成相应的戊二胺盐，如戊二胺盐酸盐、戊二胺硫酸盐、戊二胺丁二酸盐、戊二胺己二酸盐等。

在全细胞催化生产1,5-戊二胺的现有技术中，日本味之素公司率先开发了使用过表达赖氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌全细胞催化生产戊二胺的方法(美国专利US7189543、欧洲专利EP1482055)。该方法在50L发酵罐中，使用己二酸、丁二酸或癸二酸调节催化体系的pH维持在6.0或6.5，全细胞催化生产戊二胺。类似的，日本三井化学株式会社使用盐酸调节催化反应液的pH维持在6.0(国际专利PCT/JP2011/054388，中国专利CN102782146)，或使用己二酸调节催化反应液的pH维持在6.5(国际专利PCT/JP2008/050265，中国专利CN10158256)，使全细胞催化生产戊二胺的反应顺利进行。国内技术使用6mol/L的HCl在线调节戊二胺催化反应液的pH维持在5.5，催化32小时可得到60.54g/L戊二胺(中国专利CN103725724)。PCT/CN2015/082400专利技术则在催化过程中流加硫酸或磷酸调节戊二胺催化液的pH维持在6.5。

此外，赖氨酸通过赖氨酸脱羧酶催化生成1,5-戊二胺，并同时产生二氧化碳。在全细胞催化生产1,5-戊二胺的过程中，通入空气有利于二氧化碳排出全细胞催化体系，降低反应液中二氧化碳的浓度，从而减少产物竞争性抑制，有利于催化反应向1,5-戊二胺生成的酶促方向进行。例如，在调控1,5-戊二胺催化液pH的现有技术中，美国专利US7189543和欧洲专利EP1482055以0.1vvm的速率通入空气，中国专利CN10158256则以0.5vvm的速率通入空气，国际专利PCT/CN2015/082400技术以1vvm通气量通入空气。

虽然pH调控和曝气过程在理论上有利于酶促反应向1,5-戊二胺生成的方向进行，但是在实际生产应用中，这两项过程控制步骤将会限制1,5-戊二胺全细胞催化在工业化生产中的应用：pH调控过程消耗大量的酸，将会增加辅料成本；盐酸和硫酸等无机酸腐蚀性强，对设备材质要求高，将会增加设备投资；己二酸和癸二酸等有机酸难溶于水，需要以干粉或配制成浆状膏状物的形式补料，将会增加补料管道的设计难度；曝气过程导致pH上升速率快，将会增加pH调节剂的用量；曝气过程导致部分1,5-戊二胺氧化，将会降低产物纯度；曝气过程的气提作用，使排放的尾气中含有二氧化碳和戊二胺，将会导致空气污染、增加企业的环境治理费用。

发明内容

本发明提供的全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法，与现有技术相比，仅利用催化过程中的副产物CO₂调控pH且不需曝气，突破了常规的应用微生物生产化学品的过程中，需要在线调节反应体系的pH和曝气提高菌体活性的过程控制思路，旨在解决戊二胺全细胞催化在实际工业化生产应用中的问题。

本发明的一个方面，提供全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法，利用催化副产物CO₂自调节全细胞催化液的pH且采用非曝气的方法控制全细胞催化生产1,5-戊二胺。

以上所述的方法中，所述催化副产物CO₂全部来自于赖氨酸在赖氨酸脱羧酶的催化作用下产生1,5-戊二胺的过程中生成的CO₂。

以上所述的方法中，所述全细胞催化液的pH通过自调节维持在5.5-8.5之间；优选为7.0-8.0之间。

以上所述的方法中，所述非曝气的方法是指在全细胞催化的过程中不向催化液通入任何气体。

本发明的另一个方面，提供发酵罐/生物反应器中全细胞催化生产戊二胺的方法，利用发酵罐/生物反应器中的催化副产物CO₂自调节全细胞催化液的pH且采用非曝气的方法控制全细胞催化生产1,5-戊二胺；

所述发酵罐/生物反应器中全细胞催化液的温度控制在30-45℃，发酵罐/生物反应器搅拌转速设定为0-1000rpm。

以上所述的方法中，所述全细胞催化液是指包含戊二胺工程菌的菌体细胞、赖氨酸、磷酸吡哆醛和戊二胺的混合物；

以上所述的方法中，所述全细胞催化液中菌体细胞干重为0.5-30.0g/L，所述赖氨酸的添加量为0.3-5.0mol/L，所述磷酸吡哆醛的添加量0.01-0.50mmol/L。

以上所述的方法中，所述戊二胺工程菌是指过表达赖氨酸脱羧酶基因的细菌；所述细菌优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌B株或其衍生菌株。

所述过表达是指提高赖氨酸脱羧酶在细胞内的量，具体方法可以是增加所述赖氨酸脱羧酶基因的拷贝数，例如使用多拷贝表达质粒携带赖氨酸脱羧酶基因全部或部分核苷酸序列，或是在染色体中插入多拷贝赖氨酸脱羧酶基因全部或部分核苷酸序列；过表达的方法也可以是应用高效的仅表达元件调控基因的表达水平，所述元件可以是强启动子，增强子或RBS等；过表达的方法也可以是改造基因的编码序列，如密码子优化，提高赖氨酸脱羧酶的翻译效率。

所述赖氨酸脱羧酶为将赖氨酸转化为1,5-戊二胺的酶，没有特别限制，可举出例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、毛链霉菌(Streptomycespilosus)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacteriumacidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或深海热球菌(Pyrococcus abyssi)等微生物的酶。优选来自大肠杆菌的酶。

用于全细胞催化生产1,5-戊二胺的工程菌还可以是在过表达赖氨酸脱羧酶基因的基础上进一步适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。所述适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB是指将包含或不包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或使用适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子；所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子具体为L启动子、trc启动子、T5启动子、lac启动子、tac启动子或T7启动子。

以上所述的方法中，所述赖氨酸脱羧酶用来催化的底物为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液。

以上所述的方法中，所述戊二胺工程菌通过如下方法培养：将戊二胺工程菌在LB液体培养基中培养，得到种子液；将所述种子液接入含有丰富培养基或合成培养基的发酵罐中培养，培养一段时间后加入诱导剂诱导表达；将培养结束后的培养液或收集培养液中的菌体细胞用于戊二胺全细胞催化。

以上所述的方法中，所述诱导剂具体为IPTG或乳糖；

所述丰富培养基中含有10g/L酵母提取物,20g/L胰蛋白胨,0.9g/LK₂HPO₄·3H₂O,1.14g/L KH₂PO₄,10g/L(NH₄)₂SO₄,0.3g/L MgSO₄·7H₂O,5mL/L微量元素储液，50mg/L卡那霉素，余量为水；

所述微量元素储液含有6g/L FeSO₄·7H₂O,1.35g/L CaCl₂,0.8g/LZnSO₄·7H₂O，1.5g/L MnSO₄·4H₂O,0.15g/L CuSO₄·5H₂O,0.2g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O,0.1g/L H₃BO₃,0.25g/L CoCl₂·6H₂O和10mL/L浓盐酸，余量为水。

所述LB液体培养基中含卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为50mg/L；

所述种子液的OD₆₀₀为2-25，优选为3-5；

所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30.0％，具体为5.0％；

所述发酵培养的温度为25℃-45℃，具体为37℃；

所述发酵培养的DO在50％以上；

所述发酵培养的pH为4.0-9.0；

所述IPTG的终浓度为0.01-10.00mM，优选为0.05-0.40mM；

所述IPTG加入的时间为发酵培养后2-10h，优选为2-6h；

所述赖氨酸盐包括L-赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐；

所述加入底物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-10.0h，优选为1.0-5.0h；

当所述合成培养基为无机盐培养基时：

其中，无机盐培养基含有2g/L(NH₄)₂HPO_4,4g/L KH₂PO₄,0.85g/L柠檬酸,0.7g/L MgSO₄·7H₂O，10mg/L FeSO₄·7H₂O,2.25mg/L ZnSO₄·7H₂O,0.2mg/L CuSO₄·5H₂O,0.5mg/L MnSO₄·5H₂O,0.23mg/L NaB₄O₇·10H₂O,2.0mg/L CaCl₂·2H₂O,0.1mg/L NH₄Mo₇O₂₄，0.15mg/L CoCl₂·6H₂O，余量为水。

所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30.0％，具体为2.0％；

所述IPTG诱导时还包括以0.5-10.0g/L的速率补加葡萄糖的步骤，所述速率具体为3.0g/L；

所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，具体是通过流加补料液实现的，所述补料液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO₄·7H₂O，余量为水；

所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-20h，具体为4-12h；

所述加入底物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-24.0h，具体为1.0-5.0h；

本发明人大胆尝试了催化液pH自控的方法，即在1,5-戊二胺催化过程中节省了生物反应过程中常规的pH调控和曝气工序，意外地发现，仅依赖赖氨酸脱羧催化产生的酸性气体CO₂中和碱性戊二胺，不仅可使催化液的pH维持在菌体生理活性范围内，而且戊二胺的催化生产效率反而高于使用盐酸或硫酸调控pH的催化批次。通过上述两项相辅相成的1,5-戊二胺全细胞催化控制过程的改进，从而实现了本发明。

需要指出的是，与初步验证赖氨酸脱羧酶活性或工程菌催化性能所使用的常规化学容器(如离心管、试管、三角瓶或蓝盖瓶等)相比，发酵罐/生物反应器可以实时在线调控多种发酵参数(如pH、通气量和溶氧等)，与生物发酵行业中工业化生产使用的常规设备一致。例如，中国专利申请(CN 103725724)在5L发酵罐中使用6mol/L的盐酸，在线调节戊二胺催化反应液的pH维持在5.5，催化32小时可得到60.54g/L戊二胺。国际专利PCT/CN2015/082400技术使用7.5L发酵罐，在催化过程中在线流加硫酸或磷酸调节戊二胺催化液的pH维持在6.5，并以1vvm通气量通入空气。日本味之素公司在50L发酵罐中进行戊二胺全细胞催化，使用己二酸、丁二酸或癸二酸调节催化体系的pH维持在6.0或6.5，并以0.1vvm的速率通入空气(美国专利US7189543、欧洲专利EP1482055)。类似的，日本三井化学株式会社则在5m³容积的培养罐中，使用盐酸调节催化反应液的pH维持在6.0(国际专利PCT/JP2011/054388，中国专利CN102782146)，或使用己二酸浆液调节催化反应液的pH维持在6.5，并以0.5vvm的速率通入空气(国际专利PCT/JP2008/050265，中国专利CN10158256)。同样地，本发明所提供的方法是在发酵罐和生物反应器中进行的全细胞催化方法，与试管/摇瓶等常规化学容器开展的1,5-戊二胺全细胞催化试验相比，具有工业化生产的应用性。

通气或曝气速率的单位vvm是volume per volume per minute的缩写，表示每分钟单位工作体积的通气量。

赖氨酸在赖氨酸脱羧酶作用下的酶促反应方程式如下：

理论上，酸性二氧化碳和碱性戊二胺在水溶液中容易形成戊二胺碳酸盐。伴随着溶液中戊二胺碳酸盐浓度的升高，催化液的pH缓慢升高直至稳定。底物赖氨酸盐酸盐的添加量为100g/L-500g/L时，稳定时催化液的pH可以维持在7.3-8.5之间。

在催化液中加入强酸类的pH调节剂，置换催化过程中形成的弱酸性碳酸根离子，导致大部分碳酸根离子以二氧化碳的形式逸出催化液。调节pH虽然可以在一定程度上提高1,5-戊二胺催化效率，然而需要消耗大量的酸，增加了生产辅料成本，并且不利于后续1,5-戊二胺的分离提取。

在发酵工程技术中，一般认为在发酵罐中通入空气或氧气的有氧发酵与不通气的厌氧发酵相比，菌体活性更高。此外，在全细胞催化生产戊二胺的过程中，通入空气有利于二氧化碳排出全细胞催化体系，降低反应液中二氧化碳的浓度，从而减少产物竞争性抑制，有利于催化反应向戊二胺生成的酶促方向进行。然而在本发明中，为了更好的实现利用副产物CO₂调控pH，在全细胞催化的过程中不向催化液通入任何气体(即非曝气)，避免部分二氧化碳逸出而无法中和戊二胺。

需要指出的是，根据cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶的酶学活性测定数据，酶活性超过5.5时，酶活性随着pH升高急剧降低(Biochemistry,1974,13:662-670；Microbiology,1998,144:751-760；The EMBO Journal,2011,30:931–944)。进一步需要指出的是，根据酶催化原理，底物CO₂在发酵液中的积累往往会竞争性抑制底物催化效率，不利于赖氨酸脱羧产生1,5-戊二胺的酶促反应。然而本发明人在实验过程中却发现，与理论推测相反的是，在pH逐步升高和二氧化碳逐步积累的催化体系中，仍可高效的完成1,5-戊二胺催化。

应用本发明建立的pH自调控的催化方法，底物赖氨酸盐酸盐的添加量为100g/L～500g/L时，催化时间2-8h以后底物赖氨酸的消耗率为可以达到96.5～99.5％，1,5-戊二胺产量达到50～280g/L，底物赖氨酸与1,5-戊二胺的摩尔转化率达到99％以上。与同类技术相比，上述各项指标均达到领先水平。

本发明有益效果在于，应用二氧化碳自调控催化液的pH，节省了酸性pH调节剂的用量，节省了辅料成本。强腐蚀性无机酸(如盐酸和硫酸等)对设备材质要求高，己二酸和癸二酸等有机酸难溶于水，需要以干粉或配制成浆状膏状物的形式补料，本发明的技术减少了设备投资和设计难度；催化阶段不添加外源的pH调节剂，有利于后续1,5-戊二胺的分离提取；本发明的技术节省了了曝气过程，使1,5-戊二胺催化过程在密闭的发酵罐中进行，节省了空气压缩和输送所产生的成本，减少了1,5-戊二胺氧化，减少了废气排放对空气污染，降低了企业废气处理成本；本发明的技术仅需要控制全细胞催化的温度和搅拌参数，明显简化了过程控制工序，提高了生产工艺的可操作性。综上所述，本发明的技术在实践上适用于1,5-戊二胺的工业化大规模生产，具有很高的实用性和应用性。

附图说明

图1 pET28a-cadA质粒图谱。

图2 自控pH、硫酸和盐酸调控pH条件下的赖氨酸消耗过程曲线。

图3 自控pH、硫酸和盐酸调控pH条件下的1,5-戊二胺生产过程曲线。

图4 以100g/L赖氨酸盐酸盐为底物的1,5-戊二胺全细胞催化过程曲线。

图5 以200g/L赖氨酸盐酸盐为底物的1,5-戊二胺全细胞催化过程曲线。

图6 以300g/L赖氨酸盐酸盐为底物的1,5-戊二胺全细胞催化过程曲线。

图7 以400g/L赖氨酸盐酸盐为底物的1,5-戊二胺全细胞催化过程曲线。

图8 以450g/L赖氨酸盐酸盐为底物的1,5-戊二胺全细胞催化过程曲线。

图9 以500g/L赖氨酸盐酸盐为底物的1,5-戊二胺全细胞催化过程曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 HPLC法检测赖氨酸和1,5-戊二胺

取1mL全细胞催化液，8000g离心5min，收集上清液检测赖氨酸含量；取10μL上清液于2mL离心管中，加入200μL 0.5MNaHCO₃水溶液和100μL1％(体积比)2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，加入700μL 0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/L KOH水溶液调整pH)释并摇匀，放置15min过滤后可进样，进样量为15μL；

所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1mL/min，洗脱过程如下：

洗脱起始时刻(0min)流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为5个阶段，每个阶段中流动相A和流动相D占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为88％、流动相B占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为70％、流动相B占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为30％、流动相B占流动相总流量的体积份数为70％。以市售L-赖氨酸标准品制作标准曲线，计算样品的赖氨酸浓度。

检测1,5-戊二胺时，取10μL样品上清液加入含有100μL 4.2g/100mL的碳酸氢钠水溶液的2mL离心管，混匀后加入200μL含有体积百分含量为1％的2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液，混匀；60℃衍生反应60分钟(严格计时，30分钟取出轻微震荡混匀继续衍生反应)。取出避光降温至室温，加入1600μL乙腈，漩涡震荡混匀30秒，有机系滤膜过滤后取15μL进样。

流动相A为pH7.2的5.4g/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为体积百分含量80％的乙腈水溶液，将A和B按照体积比5：95的比例，1mL/min的流速泵入流动相，所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm,Agilent,USA)；柱温：35℃；检测波长：360nm。

以1,5-戊二胺盐酸盐(购自sigma公司)为标准品，1,5-戊二胺盐酸盐的浓度在1-5g/L之间线性关系良好。以标准品的浓度为横坐标，标准品积分峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

以下实施例中的1,5-戊二胺浓度均由标准曲线公式计算得到的1,5-戊二胺盐酸盐的测定值换算成1,5-戊二胺浓度值。

实施例2 全细胞催化生产戊二胺工程菌的构建

(一)赖氨酸脱羧酶基因cadA过表达质粒的构建

在pET28a(+)表达载体的T7启动子和RBS之后插入优化的赖氨酸脱羧酶基因cadA的ORF。以优化设计的序列设计引物，以野生型大肠杆菌K12 W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPAHiFi^TMHotStar，以P1和P2为引物，PCR扩增cadA基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，通过引物P1引入突变位点，从而获得改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA*的片段。

P1：5’-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT-3’(SEQ ID NO.5)

(下划线所示序列为Nco I酶切识别位点)

P2：5’-ACGCGTCGACCTCCTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTG-3’(SEQID NO.6)

(下划线所示序列为Sal I酶切识别位点)

切胶回收上述PCR电泳条带,使用限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切赖氨酸脱羧酶基因cadA*的DNA片段和pET28a(+)质粒，得到酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段和载体大片段；将酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段与载体大片段连接，转化至大肠杆菌EC135(Zhang et al,Plos Genetics，2012,8(9):e1002987)的感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为pET28a-cadA*质粒示意图见图1。

(二)染色体cadB基因启动子的替换

以大肠杆菌BL21(DE3)菌株基因组DNA为模板，以引物P3和P4、P5和P6分别进行PCR扩增，获得长度分别为510bp和610bp的两条DNA片段,分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。其中，T7启动子序列和lac调控序列由引物P4和P5引入。PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。其中，引物序列如下：

P3：5’-CGCGGATCCTGCGCCATTCTCAACATCCTT-3’(SEQ IDNO.7)

(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点)

P4：5’-TCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCGCAACATATTATACCAACAG-3’(SEQ ID NO.8)

P5：5’-ACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGAAATTAGGAGAAGAGCATGAG-3’(SEQ ID NO.9)

P6：5’-ATTGCGGCCGCTCCGCAGTATTCCAGTTAGCT-3’(SEQ IDNO.10)

(下划线所示序列为Not I酶切识别位点)

将SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA分子的混合物为模板，以P3和P6为引物，通过Overlap PCR扩增到长约1.1kb的Overlap片段，如SEQ ID No.4所示。其中PCR程序为：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸60秒，26个循环。

SEQ ID No.4中自5’末端起第477位至第495位核苷酸所示的序列为T7启动子序列，SEQ ID No.4中自5’末端起第496位至第520位核苷酸所示的序列为lac调控序列。

Bam HI和Not I双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；Bam HI和Not I双酶切pKOV质粒(购自Addgene，产品目录号为25769)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pKOV-P_T7-cadB，并将其送测序，验证其含有正确T7启动子和lac调控基因序列，保存备用。

将构建好的pKOV-P_T7-cadB质粒电转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，于30℃、150rpm，在LB培养基中复苏2h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的cadB基因的自身启动子被替换为T7启动子，将该菌株命名为E.coliBL21 P_cadB::P_T7。

(三)戊二胺工程菌的构建

将质粒pET28a-cadA*转化至E.coli BL21 P_cadB::P_T7的感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21 P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*，用于1,5-戊二胺全细胞催化。

实施例3 菌体培养和1,5-戊二胺催化的生产工艺

刮取工程菌E.coli BL21(DE3)P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*菌苔接入含有50mL LB(含50mg/L卡那霉素(5-200mg/L均可)培养基的500mL三角瓶中，在37℃220rpm摇床中培养4h，得到种子液，OD₆₀₀为4-5；培养所得的种子液按2％的接种量接入含有2L无机盐培养基的10L发酵罐中，培养温度为37℃，DO控制在30％以上，罐压控制在0.02-0.10MPa。通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维持在5g/L以下。当培养液中菌体OD₆₀₀达到30-40时加入0.1mM诱导剂IPTG，2h后菌体培养液OD₆₀₀达到80左右，离心获得湿菌体。

其中无机盐培养基成分和补料液成分如下：无机盐培养基：2g/L(NH₄)₂HPO₄,4g/L KH₂PO₄,0.85g/L Citric acid(柠檬酸),0.7g/LMgSO₄·7H₂O，10mg/L FeSO₄·7H₂O,2.25mg/L ZnSO₄·7H₂O,0.2mg/LCuSO₄·5H₂O,0.5mg/L MnSO₄·5H₂O,0.23mg/L NaB₄O₇·10H₂O,2.0mg/LCaCl₂·2H₂O,0.1mg/L NH₄Mo₇O₂₄，0.15mg/L CoCl₂·6H₂O，余量为水。补料液包含700g/L葡萄糖和20g/L MgSO₄·7H₂O，余量为水。

配制含有300g/L赖氨酸盐酸盐和0.2mmol/L PLP的催化液体系，调控温度至37℃以后，发酵罐搅拌转速设置为500rpm，加入20g/L湿菌体(折合细胞干重4g/L)开始全细胞催化，催化过程中pH持续上升。pH自控实验不补加酸性物质调节pH，并且不通空气；而对照组实验分别补加浓盐酸和稀释一倍的浓硫酸，调节催化液的pH维持在6.0左右，并且通风量调节为为0.5vvm。每隔0.5h从发酵罐中取出催化液，12000×g离心5分钟，倒出上清液，检测上清液中的1,5-戊二胺含量。按照实施例1的1,5-戊二胺检测方法检测全细胞催化过程中1,5-戊二胺产量，结果如图2所示，pH自控的催化过程中，赖氨酸消耗速率略高于使用盐酸调节pH的对照试验，但明显高于硫酸对照试验；相应地，1,5-戊二胺生产强度变化趋势与底物消耗速率相同(图3)。此外，由于补加硫酸和盐酸稀释了1,5-戊二胺催化体系，1,5-戊二胺浓度低于pH自控的催化试验(图3)。根据硫酸或盐酸调控pH试验计算，每催化生产1kg戊二胺，需要消耗0.77kg硫酸或0.58kg盐酸。

实施例4 底物添加量对催化效率的影响

菌体培养和收集过程同实施例3，分别配制含有100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、450g/L和500g/L赖氨酸盐酸盐的全细胞催化水溶液，分别加入0.2mmol/L PLP和20g/L湿菌体(折合细胞干重约4g/L)，温度控制在37℃，搅拌桨转速设置为500rpm，进行催化生产1,5-戊二胺。催化过程中不补加酸性调节剂，利用副产物CO₂调节自调控催化体系的pH，在催化开始的前20分钟pH迅速上升至7.2左右，而在之后的几个小时pH缓慢升高至7.6-7.8(图4至图9)。赖氨酸消耗和1,5-戊二胺生产过程变化趋势与pH类似，前0.5小时赖氨酸迅速消耗且1,5-戊二胺迅速积累，之后变化过程缓慢。底物赖氨酸盐酸盐的添加量不大于300g/L时，催化4h的底物催化消耗率达到99.6％以上，赖氨酸盐酸盐残余量小于1g/L；底物赖氨酸盐酸盐的添加量为400g/L和450g/L时，需要催化8h时底物催化消耗率才能达到99.0％以上，底物赖氨酸盐酸盐的添加量为500g/L时，催化8h时底物催化消耗率达到96.5％，1,5-戊二胺产量达到277.0g/L。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，利用催化副产物CO₂自调节全细胞催化液的pH且采用非曝气的方法控制全细胞催化生产1,5-戊二胺。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化副产物CO₂全部来自于赖氨酸在赖氨酸脱羧酶的催化作用下产生1,5-戊二胺的过程中生成的CO₂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化液的pH通过自调节维持在5.5-8.5之间；优选为7.0-8.0之间。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非曝气的方法是指在全细胞催化的过程中不向催化液通入任何气体。

5.发酵罐/生物反应器中全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，利用发酵罐/生物反应器中的催化副产物CO₂自调节全细胞催化液的pH且采用非曝气的方法控制全细胞催化生产1,5-戊二胺；

所述发酵罐/生物反应器中全细胞催化液的温度控制在30-45℃，发酵罐/生物反应器搅拌转速设定为0-1000rpm。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化液是指包含戊二胺工程菌的菌体细胞、赖氨酸、磷酸吡哆醛和1,5-戊二胺的混合物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化液中菌体细胞干重为0.5-30.0g/L，所述赖氨酸的添加量为0.3-5.0mol/L，所述磷酸吡哆醛的添加量为0.01-0.50mmol/L。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述戊二胺工程菌是指过表达赖氨酸脱羧酶基因的细菌；所述细菌优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌B株或其衍生菌株。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶用来催化的底物为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述戊二胺工程菌通过如下方法培养：将戊二胺工程菌在LB液体培养基中培养，得到种子液；将所述种子液接入含有丰富培养基或合成培养基的发酵罐中培养，培养一段时间后加入诱导剂诱导表达；将培养结束后的培养液或收集培养液中的菌体细胞用于1,5-戊二胺全细胞催化。