RU2768401C1 - Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов - Google Patents

Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов Download PDF

Info

Publication number
RU2768401C1
RU2768401C1 RU2021109121A RU2021109121A RU2768401C1 RU 2768401 C1 RU2768401 C1 RU 2768401C1 RU 2021109121 A RU2021109121 A RU 2021109121A RU 2021109121 A RU2021109121 A RU 2021109121A RU 2768401 C1 RU2768401 C1 RU 2768401C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
concentration
medium
biomass
nutrient medium
nitrogen
Prior art date
Application number
RU2021109121A
Other languages
English (en)
Inventor
Татьяна Михайловна Заборская
Янкович Небойша
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Комита Биотехнологии"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Комита Биотехнологии" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Комита Биотехнологии"
Priority to RU2021109121A priority Critical patent/RU2768401C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2768401C1 publication Critical patent/RU2768401C1/ru
Priority to PCT/RU2022/000103 priority patent/WO2022211674A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/26—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13554 в проточном режиме с постоянной скоростью отбора культуральной жидкости и скоростью протока минеральной среды от 0,25 до 0,35 ч-1 при 41-44 °С, рН 5,4-5,8 и скорости потока газовоздушной смеси метан:воздух - 1:3, причем в состав питательной среды дополнительно вводят никель и до 10% воды заменяют на фугат культуральной жидкости; концентрацию компонентов минерального питания устанавливают в зависимости от заданной скорости протока среды D и планируемой продуктивности процесса культивирования Y по формуле. Изобретение обеспечивает повышение продуктивности процесса синтеза биомассы в биореакторах с различными массообменными характеристиками при масштабировании процесса длительного культивирования. 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.

Description

Область изобретения
Изобретение относится к промышленной биотехнологии, а именно к получению высокопротеиновой биомассы аэробных метанассимилирующих микроорганизмов Methylococcus capsulatus с целью использования в сельском хозяйстве для кормления животных.
Уровень техники
Биотехнология получения микробного кормового белка основана на реализации непрерывного процесса культивирования биомассы метанассимилирующих микроорганизмов в аэрируемых биореакторах с использованием минеральных питательных сред и природного газа в качестве единственного источника углерода.
Известны продуценты микробной биомассы, относящиеся к различным видам метанотрофных бактерий, например: Methylococcus capsulatus, Methylococcus minimus, Methylocystis parvus, Methylosinus sporium, Methylosinus trichospotium, Methylomonas rubra, Methylomonas metanica. Все перечисленные микроорганизмы используют природный газ в качестве единственного источника углерода и характеризуются различными скоростями роста, выходом биомассы и конверсии метана в биомассу.
Механизм ассимиляции метана метанотрофными микроорганизмами хорошо изучен для видов, перспективных для промышленного применения. Однако, при культивировании есть множество влияющих факторов, часть из которых установлена лишь эмпирически. Это открывает большое поле для дальнейших исследований и оптимизации технологических процессов биосинтеза.
Известен способ получения микробного белка на основе метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, включающий приготовление питательной среды, включающую соли макро- и микроэлементов заданной концентрации с добавлением фосфорной кислоты, ферментацию бактериальных культур с постоянной подачей культуральной жидкости, раствора аммиака и газовой смеси при температуре 40-45°С в непрерывном протоке 0,2-0,3 объема ферментера в час, отличающийся тем, что отработанную культуральную жидкость после сепарации возвращают через накопительную емкость на стадию ферментации в объеме от 10 до 95% от общего количества используемой воды, обогащают недостающими минеральными солями до заданных концентраций в культуральной жидкости, затем продолжают ферментацию бактериальной культуры до получения готового продукта (Патент RU2720121С1).
Процесс выращивания осуществляли при температуре 41-43°С и рН среды выращивания 5,6-5,8. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды.
Техническим результатом этого изобретения является повышение продуктивности процесса биосинтеза и решение проблемы утилизации отработанной культуральной жидкости.
К недостаткам этого способа можно отнести накопление продуктов катаболизма в питательной среде, подаваемой в биореактор при возвращении больших объемов отработанной культуральной жидкости. Это повышает риск ингибирования роста биомассы, приводит к снижению продуктивности и дестабилизации процесса при длительном культивировании.
Известен способ выращивания метанокисляющих микроорганизмов Methylococcus capsulatus (Патент RU2032737C1), который осуществляют в условиях аэрации с использованием природного газа в качестве источника углерода, а в качестве источника кислородного питания воздуха или смеси воздуха с кислородом. В качестве элементов минерального питания используют азот, фосфор, магний, калий, медь, железо, марганец, цинк, кобальт и другие микроэлементы преимущественно в виде сульфатов. Источником азотного питания служит аммиачная вода, являющаяся одновременно титрантом, автоматически поддерживающим рН культуральной среды на уровне 4,9-5,7 ед. Давление в среде выращивания поддерживают в пределах 1-4 атм. Процесс культивирования проводят при 42-44°С и скорости протока 0,15-0,35 ч-1.
Концентрации азота и фосфора в среде регулируют в зависимости от величины протока и объема ферментера согласно формулам: CN=F/0,00165⋅V и CP=F/0,00295⋅V, где CN и CP - концентрации азота и фосфора в питательной среде, г/л; F - скорость протока, м3/ч; V - рабочий объем ферментера.
Численные значения удельных протоков KN и Кр находят экспериментальным путем из графика зависимости продуктивности от соотношений D/CN и D/Cp (где D скорость протока, ч-1) в виде значений указанных соотношений, отвечающих максимальной продуктивности процесса, осуществляемого в непрерывном строго стационарном режиме.
К недостаткам указанного способа можно отнести возможность разбалансирования процесса при длительном культивировании. При закислении культуральной среды продуктами катаболизма использование аммиачной воды одновременно и как элемента азотного питания, и как титранта, приводит к избыточному накоплению аммонийного азота, и снижению скорости роста биомассы.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ культивирования штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, описанный в патенте RU2613365C1.
Описаны оптимальные условия для культивирования Methylococcus capsulatus ГБС-15 - рН 5,6-5,8, температура 41-44°С и состав питательной среды. Состав минеральной среды на 1 л:
фосфорная кислота Н3РО4(70%) - 0,35 мл;
хлористый калий KCl - 0,125 г;
сульфат магния MgSO4×7Н2О - 0,105 г;
сульфат железа FeSO4×7Н2О - 10,75 мг;
сульфат меди СuSО4×5Н2О - 10 мг;
сульфат марганца MnSO4×5Н2О - 9,5 мг;
борная кислота Н3 ВО3 - 6,25 мг;
сульфат цинка ZnSO4×7Н2О -1,5 мг;
сульфат кобальта CoSO4×7Н2О - 0,25 мг;
натрий молибденовокислый Na2MoO4×2Н2О - 0,25 мг.
Выращивание культуры Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 осуществляли в непрерывном режиме в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем - 25 л) с непрерывной подачей питательной среды. Процесс выращивания вели при температуре 42°С и рН среды выращивания 5,6-5,8. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. Культуру выращивали при атмосферном давлении. Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составляли 15 и 45 л/час соответственно. При коэффициенте скорости протока 0,25 ч-1, концентрация биомассы в ферментере составляла 10-11 г/л. Methylococcus capsulatus.
При выращивании микроорганизмов штамм ГБС-15 при атмосферном давлении с использованием кислорода (95%) вместо воздуха концентрация биомассы составила 8 г/л при скорости протока 0,25 ч-1. При этом расход газов составлял соответственно: природный газ - 240 л/час, кислород (95%) - 280 л/час.
В указанном способе культивирования Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 применяется стандартный состав питательной среды для различных вариантов культивирования, как для периодического процесса накопления биомассы в качалочных колбах, так и для непрерывного культивирования в биореакторе эжекторного типа. Кроме того, в составе питательной среды отсутствует соль никеля, который, как было описано выше, играет значимую роль в процессе ассимиляции метана.
Раскрытие изобретения
Для крупномасштабного производства биомассы, кроме штаммов-продуцентов, определяющим фактором, который влияет на выход целевого продукта и, соответственно, на рентабельность всего процесса, является состав питательной среды.
Производственная питательная среда должна содержать обоснованный и сбалансированный набор компонентов, необходимых для построения клеточной массы.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является оптимизация состава питательной среды для промышленного культивирования Methylococcus capsulatus в биореакторах различного объема с различными массообменными характеристиками, что позволяет обеспечить высокую продуктивность и стабильные результаты длительного непрерывного культивирования при масштабировании процесса.
Технический результат достигается за счет того, что создан способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов Methylococcus capsulatus в проточном режиме с постоянной скоростью отбора культуральной жидкости и скоростью протока минеральной среды от 0,25 ч-1 до 0,35 ч-1при поддержании оптимальной температуры культивирования (41-44)°С, рН 5,4-5,8 и скорости потока газо-воздушной смеси метан:воздух (1:3), включающий приготовление питательной среды, содержащей азот, фосфор, магний, калий, натрий, медь, железо (II), марганец, цинк, кобальт, молибден, причем в состав питательной среды дополнительно вводят никель, а также до 10% воды заменяют на фугат культуральной жидкости, при этом необходимую концентрацию компонентов минерального питания в условиях стационарного проточного культивирования устанавливают в зависимости от заданной скорости протока среды D и максимальной для используемого биореактора продуктивности процесса культивирования (Y) по формуле:
Сi=
Figure 00000001
·αi+
Figure 00000001
· (βi+γi),
где,
Сi - концентрация i-го компонента в питательной среде, мг/л;
Y - продуктивность процесса культивирования, г/л⋅ч
D - скорость разбавления культуры протоком среды, ч-1;
αi - усредненная концентрация i-го компонента в биомассе, которое зависит от биологических особенностей штамма-продуцента и принята постоянной, мг/г;
βi - удельная концентрация i-го компонента во внеклеточных продуктах метаболизма, в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости, мг/г;
γi - удельная остаточная концентрация i-го компонента в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости, мг/г.
При этом для расчета необходимой концентрации макроэлементов и микроэлементов в минеральной питательной среде для Methylococcus capsulatus используют экспериментально установленные значения «αi» и «βi+γi», которые составляют:
макроэлемент αi,
мг/г		 βi+γ,
мг/г
N - 112,5 5
P - 17,5 3
K - 11,2 1,2
Mg -
микроэлемент		 1,9 0,18
Cu - 0,380 0,050
Fe - 0,320 0,040
Ni - 0,010 0,030
Mg в данном способе используют в виде водорастворимой полностью ассимилируемой соли - магния дигидроортофосфата, а соотношение мольных долей Cu, Fe, Ni в питательной среде, составляет 1:0,97:0,1, при этом соотношение внутриклеточной и внеклеточной концентрации Ni составляет 1:3. Особенностью является то, что при приготовлении питательной среды до 10% воды заменяют на фугат культуральной жидкости для стимулирования процесса ассимиляции метана культурой микроорганизмов.
После достижения оптимальной концентрации азота в культуральной жидкости поддерживают значение рН на уровне 5,4-5,8, используя растворы натрия гидроокиси, а концентрацию аммонийного азота в точке перехода на другой титрующий раствор определяют по формуле:
СN=
Figure 00000001
· (βN+γN),
где,
СN - концентрация азота в питательной среде, мг/л;
Y - продуктивность процесса культивирования, г/л⋅ч;
D - скорость протока среды, ч-1;
(βN+γN) - удельная концентрация азота во внеклеточных продуктах метаболизма и удельное остаточное содержания азота в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости.
Реализация изобретения
Авторами создан способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов, направленный на промышленное использование для получения биомассы микроорганизмов.
В предлагаемом способе культивирование аэробных метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus осуществляли в условиях интенсивного смешивания питательной среды с газо-воздушной смесью в биореакторе. В качестве единственного источника углерода был использован природный газ, а в качестве источника кислородного питания - воздух. В аппарат подавали метано-воздушную смесь в соотношении 1:3, что обусловлено необходимостью обеспечения взрывобезопасности.
Methylococcus capsulatus является термотолерантным, поэтому процесс культивирования проводили в проточном режиме при повышенной температуре 41-44°С и давлении в аппарате от 1 до 3 атм.
Для культивирования Methylococcus capsulatus использовали минеральную питательную среду, содержащую макроэлементы азот, фосфор, магний, калий и микроэлементы медь, железо (II), марганец, цинк, кобальт, молибден, никель, бор в виде неорганических соединений далее компоненты.
В условиях непрерывного культивирования, когда популяция микроорганизмов находится в состоянии динамического равновесия, удельная скорость роста биомассы (μ, ч-1) равна скорости разбавления культуры протоком среды - (скорость протока среды D, ч-1).).
Figure 00000002
Удельная скорость роста биомассы для Methylococcus capsulatus зависит от ее биологических свойств и, при условии обеспечения необходимыми компонентами для роста и развития биомассы, составляет от 0,25 ч-1 до 0,35 ч-1.
Скорость протока среды, равная указанной удельной скорости роста, позволяет поддерживать на низком уровне концентрацию ингибирующих рост продуктов метаболизма, а также ограничивает рост контаминирующей микрофлоры в условиях нестерильного процесса культивирования.
Продуктивность процесса (Y) определяется произведением скорости разбавления на концентрацию микроорганизмов, т.е. количеством биомассы, получаемой с единицы объема биореактора в единицу времени.
Figure 00000003
где,
Y - продуктивность процесса культивирования, г/л⋅ч;
Сбм - концентрация биомассы в вытекающей культуральной жидкости, г/л;
D - скорость протока среды, ч-1.
В зависимости от условий культивирования, таких, как массообменные характеристики биореактора, давление, качественный состав используемого природного газа, продуктивность процесса синтеза биомассы может в значительной мере варьировать.
Продуктивность процесса всегда связана с повышенной концентрацией субстрата в вытекающей среде.
В общем виде необходимую концентрацию компонентов минерального питания при проточном культивировании можно представить в виде:
Figure 00000004
где,
Сi - концентрация i-го компонента в питательной среде, мг/л;
Сбм - концентрация биомассы в культуральной жидкости, г/л;
Сia - концентрация i-го компонента в 1 кг сухой биомассы микроорганизмов, мг/г;
Сib - концентрация i-го компонента во внеклеточных продуктах метаболизма, мг/л;
Сic - остаточная концентрация i-го компонента в культуральной жидкости, мг/л.
Зависимость концентрации биомассы в культуральной жидкости от концентрации компонентов минеральной питательной среды для узкой области оптимальных значений близка к линейной.
В таком случае уравнение (3) можно представить в виде:
Figure 00000005
где,
Сi - концентрация i-го компонента в питательной среде, мг/л;
Y - продуктивность процесса культивирования, г/л⋅ч;
D - скорость протока среды, ч-1;
αi - усредненная концентрация i-го компонента в биомассе, которая зависит от биологических особенностей штамма-продуцента и принята постоянной, мг/г;
βi - удельная концентрация i-го компонента во внеклеточных продуктах метаболизма, в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости, мг/г;
γi - удельная остаточная концентрация i-го компонента в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости, мг/г.
Значения «αi» и «βi+γi» для компонентов минерального питания установлены экспериментально:
αi - для отмытой от внеклеточных компонентов биомассы;
(βi+γi) - в микрофильтрате культуральной жидкости.
Потребность растущей культуры в компонентах минерального питания определяется их физиологическими особенностями и должна быть обеспечена таким образом, чтобы их остаточная концентрация в культуральной жидкости не ограничивала рост культуры.
В то же время известно, что избыточное содержание в питательной среде таких компонентов, как азот, фосфор, медь, железо (II) приводит к снижению скорости синтеза биомассы. Поэтому для достижения максимально возможной продуктивности в условиях культивирования в конкретном биореакторе с установленными параметрами массообмена, необходимо поддерживать оптимальную концентрацию компонентов минеральной среды. Лимитирующим фактором в таком процессе является обеспечение растущей культуры микроорганизмов достаточным количеством растворенного кислорода.
Оптимальную концентрацию компонентов минеральной среды рассчитывали по формуле (4) с использованием экспериментально установленных значений «αi» и «βi+γi», приведенных в таблице 1, в зависимости от установленной скорости протока среды (D) и максимальной для используемого биореактора продуктивности процесса культивирования (Y). Значения «αi» и «βi+γi» для расчета необходимой концентрации макроэлементов в питательной среде для Methylococcus capsulatus представлены в таблице 1.
Figure 00000006
Источником азотного питания служит аммиачная вода, аммонийные соли в виде фосфатов и сульфатов аммония, фосфора - аммонийные соли ортофосфорной кислоты, и ее калиевые и магниевые соли (калий фосфорнокислый трехзамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, магния дигидроортофосфат) (таблица 1).
При этом диаммоний фосфат является одновременным источником и азотного, и фосфорного питания. Магния дигидроортофосфат и фосфаты калия одновременно являются источником фосфора и макроэлементов магния и калия. Все перечисленные соли ортофосфорной кислоты являются полностью ассимилируемыми.
Использование фосфатов в виде солей аммония и солей макроэлементов К, Mg позволяет избежать применения концентрированных растворов ортофосфорной кислоты для приготовления питательных сред, снизить затраты на дорогостоящее оборудование для ее транспортирования, хранения, и передачи. Кроме того, позволяет снизить содержание неассимилируемых сульфат-ионов в питательной среде.
Медь, железо и никель - основные микроэлементы, которые определяют эффективность ассимиляции метана метанотрофными микроорганизмами, в связи с тем, что они входят в состав важнейших металлопротеиназ и пептидов, регулирующих этот процесс.
Окисление метана метанотрофными бактериями осуществляется ферментной системой - метанмонооксигеназой (ММО). В настоящее время выявлены два вида метаноксиляющих ферментных систем: растворимая (рММО) и мембрансвязанная (мММО). У метанотрофов, обладающих обеими формами ММО, в том числе у Methylococcus capsulatus, их экспрессия определяется наличием меди в среде культивирования и регулируется на уровне транскрипции (Gilbert et al., 2000; Morton et al., 2000; Murrell et al., 2000a; 2000b). Причем экспрессия рММО происходит при низкой концентрации ионов меди<0,8 μM, тогда как при повышении концентрации меди до ≥ 4 μM экспрессируется мММО. У метанотрофов, имеющих оба фермента, медь является ключевым фактором в регуляции их активности и экспрессии генов, кодирующих эти ферменты (Murrell et al., 2000). Показано, что мММО составляет до 60-80% тотальных мембранных белков клеток метанассимилирующих микроорганизмов (Nguyen et al., 1998; Murrell et al., 2000; Smith et al., 2002). Активная мММО содержит 2 атома железа и около 15 атомов меди на одну молекулу фермента. Для проявления активности мММО необходимы молекулы небольшого флуоресцирующего хромопептида (1,2 кДа) - метанобактина, ответственного также за транспорт ионов меди и поддержание их уровня в клетках. Метанобактин является внеклеточным Сu-комплексообразующим агентом и имеет следующий химический состав: C45Ni2O4H62S5Cu (Graham et al., 2005). Он секретируется во внеклеточную среду для рекрутирования меди, перевода токсичного для клетки Cu (II) в Cu (I), и перемещения меди в клетку.
Как видно из приведенной химической формулы метанобактина, для обеспечения достаточного уровня его секреции необходимо ввести в питательную среду соответствующее количество не только меди, но и никеля.
Учитывая вышеизложенные результаты исследований, для расчета концентрации микроэлементов Cu, Fe, Ni в питательной среде для Methylococcus capsulatus по формуле (4) экспериментально установлены значения «αi» и «βi+γi» (таблица 2).
Figure 00000007
В связи с выявлением значительной роли метанобактина в процессе ассимиляции метана метанотрофными бактериями, в состав питательной среды был введен никель в количестве, обеспечивающем соотношение его внутриклеточной и внеклеточной концентрации 1:3. Соотношение мольных долей Cu, Fe, Ni составляет 1: 0,97: 0,1.
С целью интенсификации процесса и повышения скорости биосинтеза предложено использование фугата культуральной жидкости в качестве ростстимулирующего фактора.
Известно, что добавление очищенного метанобактина к клеткам Methylococcus capsulatus повышает активность мММО на ~ 35% (Graham, Kim, 2011).
Фугат содержит метанобактин, и добавление его в питательную среду стимулирует процесс ассимиляции метана, и повышение продуктивности биосинтеза в целом.
При приготовлении питательной среды, подаваемой в биореактор, заменяют часть воды на фугат культуральной жидкости, получаемый на стадии сепарации. Объем добавляемого фугата должен быть не более 10%. Ограничение объема возвращаемого в питательную среду фугата связано с предельным уровнем допустимого содержания продуктов клеточного метаболизма в питательной среде, т.к. известно, что их накопление в культуральной жидкости оказывает ингибирующее действие на рост биомассы и снижает продуктивность процесса биосинтеза.
В процессе культивирования в результате использования азота микроорганизмами в ферментационной среде также накапливаются неассимилируемые анионы кислот, основным из которых является сульфат-ион из используемых сульфатных солей, возрастает кислотность среды. Кроме того, растворение углекислого газа и образование угольной кислоты также приводит к снижению рН культуральной жидкости. Во избежание закисления в процессе ферментации корректируют рН среды. Использование в качестве титрующего агента гидроокиси аммония, который одновременно является источником азотного питания для микроорганизмов, приводит к нарушению баланса компонентов минеральной среды, и дестабилизирует процесс биосинтеза.
Чтобы не допустить отклонений в сбалансированном составе питательной среды, предложено при достижении оптимальной концентрации аммонийного азота в культуральной жидкости переходить на регулирование рН другим основанием - раствором гидроокиси натрия. При этом исключается возможность ингибирования синтеза биомассы избыточным количеством азота при снижении рН вследствие влияния продуктов катаболизма.
Концентрацию аммонийного азота в точке перехода на другой титрант определяют по формуле:
Figure 00000008
где,
СN - концентрация азота в питательной среде, мг/л;
Y - продуктивность процесса культивирования, г/л⋅ч;
D - скорость протока среды, ч-1;
(β+γN) - удельная концентрация азота во внеклеточных продуктах метаболизма и удельное остаточное содержания азота в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости в соответствии с таблицей 2, мг/г.
В условиях стационарного проточного режима культивирования при поддержании необходимой концентрации азота и фосфора, а также связанных с ними концентрациями макро- и микроэлементов, стабилизации скорости протока минеральной питательной среды (D), управление процессом сводится к контролю рН, концентрации аммонийного азота и растворенного кислорода в культуральной жидкости, их регулирование подачей титрующего агента, и газо-воздушной смеси.
Предлагаемый способ значительно упрощает управление процессом биосинтеза. Он позволит оптимизировать количество подаваемых субстратов, повысить степень их использования и добиться стабилизации технологических показателей культивирования при масштабировании процесса.
Пример 1.
Культивирование Methylococcus capsulatus штамм ВКПМ:В-13554 вели в непрерывном режиме в ферментере с мешалкой барботажного типа вместимостью 5 л (рабочий объем - 2,2 л) с непрерывной подачей минеральной питательной среды со скоростью 550 мл/ч. Температуру культуральной среды поддерживали на уровне 41-43°С.Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды. Процесс вели в течение 7 дней при атмосферном давлении и расходе природного газа и воздуха 550 мл/мин и 1650 мл/мин соответственно. Скорость протока минеральной питательной среды составляла 0,25 ч-1.
Использовали минеральную питательную среду следующего состава. Состав минеральной питательной среды для культивирования Methylococcus capsulatus представлен в таблице 3.
Figure 00000009
В процессе культивирования поддерживали рН культуральной жидкости на уровне 5,4-5,8. Для титрования использовали 5% раствор NH4OH и 1 М раствор NaOH. В процессе биосинтеза контролировали концентрацию аммонийного азота в культуральной жидкости. Концентрация аммонийного азота в точке перехода на другой титрант составляла 58 мг/л.
После стабилизации процесса концентрация биомассы в отбираемом потоке культуральной жидкости составила в среднем 9 г/л, продуктивность - 2,25 г/л⋅ч.
Пример 2
Культивирование Methylococcus capsulatus штамм ВКПМ: В-13554 вели в непрерывном режиме в ферментере с мешалкой барботажного типа вместимостью 50 л (рабочий объем - 28 л) с непрерывной подачей минеральной питательной среды со скоростью 7 л/ч. Температуру культуральной среды поддерживали на уровне 41-43°С.Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Процесс вели в течение 30 дней при атмосферном давлении и расходе природного газа и воздуха 7 и 21 л/мин соответственно. Скорость протока минеральной питательной среды составляла 0,25 ч-1.
При приготовлении минеральной питательной среды 10% воды заменили на фугат культуральной жидкости, полученный после сепарирования биомассы.
Состав минеральной питательной среды для культивирования
Methylococcus capsulatus приведен в таблице 4.
Figure 00000010
В процессе биосинтеза поддерживали рН культуральной жидкости на уровне 5,4-5,8. Для титрования использовали 5% раствор NH4OH и 1 М раствор NaOH. Контролировали концентрацию аммонийного азота в культуральной жидкости. Концентрация аммонийного азота в точке перехода на другой титрант составляла 60 мг/л.
После стабилизации процесса концентрация биомассы в отбираемом потоке культуральной жидкости составила в среднем 12 г/л, продуктивность - 3,0 г/л⋅ч.
Технический результат заключается в получении высокой продуктивности синтеза биомассы в биореакторах с различными массообменными характеристиками при масштабировании и стабильности процесса при длительном культивировании.
Технический результат достигается за счет того, что необходимую концентрацию компонентов в питательной среде в условиях стационарного проточного культивирования устанавливают в зависимости от заданной скорости протока среды (D) и максимальной продуктивности процесса культивирования (Y) для используемого биореактора, а также за счет того, что для расчета необходимой концентрации компонентов минеральной питательной среды по формуле (4) используют экспериментально установленные значения «αi» и «βi+γi».
Промышленная применимость
Полученные в опытных процессах результаты, описанные в примерах, демонстрируют возможность получения стабильных результатов длительного непрерывного культивирования с использованием состава питательных сред, рассчитанных по формуле (4) в зависимости от установленной скорости протока среды (D) и планируемой продуктивности (Y).

Claims (19)

1. Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов Methylococcus capsulatus в проточном режиме с постоянной скоростью отбора культуральной жидкости и скоростью протока минеральной среды от 0,25 до 0,35 ч-1 при поддержании оптимальной температуры культивирования 41-44°С, рН 5,4-5,8 и скорости потока газовоздушной смеси метан:воздух 1:3, включающий приготовление питательной среды, содержащей азот, фосфор, магний, калий, натрий, медь, железо (II), марганец, цинк, кобальт, молибден, отличающийся тем, что культивируют штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13554, в состав питательной среды дополнительно вводят никель в количестве, обеспечивающем соотношение его внутриклеточной и внеклеточной концентраций 1:3, при этом соотношение мольных долей Cu, Fe, Ni составляет 1:0,97:0,1, причем не более 10% воды заменяют на фугат культуральной жидкости, а при масштабировании процесса необходимую концентрацию компонентов минерального питания в условиях стационарного проточного культивирования устанавливают в зависимости от заданной скорости протока среды D и планируемой продуктивности процесса культивирования Y по формуле:
Сi =
Figure 00000011
· αi +
Figure 00000011
· (βi+γi),
где
Сi – концентрация i-го компонента в питательной среде, мг/л;
Y – продуктивность процесса культивирования, г/л·ч
D – скорость разбавления культуры протоком среды, ч-1;
αi – усредненная концентрация i-го компонента в биомассе, которая зависит от биологических особенностей штамма-продуцента и принята постоянной, мг/г;
βi – удельная концентрация i-го компонента во внеклеточных продуктах метаболизма, в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости, мг/г;
γi – удельная остаточная концентрация i-го компонента в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости, мг/г;
где для расчета необходимой концентрации макроэлементов и микроэлементов в минеральной питательной среде используют экспериментально установленные значения «αi» и «βi+γi», которые составляют:
макроэлемент αi,
мг/г βi+γi,
мг/г N - 112,5 5 P - 17,5 3 K - 11,2 1,2 Mg -
микроэлемент 1,9 0,18 Cu - 0,380 0,050 Fe - 0,320 0,040 Ni - 0,010 0,030
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Mg используют в виде водорастворимой полностью ассимилируемой соли - магния дигидроортофосфата.
3. Способ по п.1 и 2, отличающийся тем, что после достижения оптимальной концентрации азота в культуральной жидкости поддерживают значение рН на уровне 5,4-5,8, для чего используют растворы аммония гидроокиси и натрия гидроокиси, а концентрацию аммонийного азота в точке перехода на титрующий раствор натрия гидроокиси определяют по формуле:
СN =
Figure 00000011
⋅ (βN+γN),
где
СN – концентрация азота в питательной среде, мг/л;
Y – продуктивность процесса культивирования, г/л·ч;
D – скорость протока среды, ч-1;
(βN+γN) – сумма удельной концентрации азота во внеклеточных продуктах метаболизма и удельного остаточного содержания азота в пересчете на концентрацию биомассы в культуральной жидкости по п.1 формулы, мг/г.
RU2021109121A 2021-04-02 2021-04-02 Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов RU2768401C1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021109121A RU2768401C1 (ru) 2021-04-02 2021-04-02 Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов
PCT/RU2022/000103 WO2022211674A1 (ru) 2021-04-02 2022-04-01 Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021109121A RU2768401C1 (ru) 2021-04-02 2021-04-02 Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2768401C1 true RU2768401C1 (ru) 2022-03-24

Family

ID=80820042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021109121A RU2768401C1 (ru) 2021-04-02 2021-04-02 Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2768401C1 (ru)
WO (1) WO2022211674A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2811437C1 (ru) * 2023-04-10 2024-01-11 Публичное акционерное общество "Газпром" Способ культивирования метанокисляющих микроорганизмов

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2032737C1 (ru) * 1989-11-20 1995-04-10 Валерий Шакирович Мирзазянов Способ выращивания метанокисляющих микроорганизмов
RU2064016C1 (ru) * 1992-11-26 1996-07-20 Акционерное общество открытого типа "Биотех" Способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и способ управления непрерывным процессом получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов
RU2613365C1 (ru) * 2016-04-07 2017-03-16 Ооо "Гипробиосинтез" Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 для получения микробной белковой массы
RU2699986C1 (ru) * 2018-10-26 2019-09-11 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение Биосинтез" Способ получения биомассы метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus
RU2728345C1 (ru) * 2019-11-11 2020-07-29 Публичное акционерное общество "Газпром" Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - продуцент микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2728193C1 (ru) * 2019-06-11 2020-07-28 Общество с ограниченной ответственностью "Биопрактика" (ООО "Биопрактика") Ферментер и ферментационная установка для непрерывного культивирования микроорганизмов

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2032737C1 (ru) * 1989-11-20 1995-04-10 Валерий Шакирович Мирзазянов Способ выращивания метанокисляющих микроорганизмов
RU2064016C1 (ru) * 1992-11-26 1996-07-20 Акционерное общество открытого типа "Биотех" Способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и способ управления непрерывным процессом получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов
RU2613365C1 (ru) * 2016-04-07 2017-03-16 Ооо "Гипробиосинтез" Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 для получения микробной белковой массы
RU2699986C1 (ru) * 2018-10-26 2019-09-11 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение Биосинтез" Способ получения биомассы метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus
RU2728345C1 (ru) * 2019-11-11 2020-07-29 Публичное акционерное общество "Газпром" Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - продуцент микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2811437C1 (ru) * 2023-04-10 2024-01-11 Публичное акционерное общество "Газпром" Способ культивирования метанокисляющих микроорганизмов

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022211674A1 (ru) 2022-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7521203B2 (en) Feeding processes for fermentation
WO2008100782A2 (en) Process for the preparation of coenzyme qlo by culturing rhodobacter sphaeroides in a defined medium
CA3003944A1 (en) Process for improved fermentation of a microorganism
Zeng et al. Bioreaction techniques under microaerobic conditions: from molecular level to pilot plant reactors
BR112021009004A2 (pt) composição de meio de crescimento, processo para preparação da mesma e métodos para produção de biomassa e de produtos de valor agregado
RU2768401C1 (ru) Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов
CN109593801A (zh) 一种发酵生产l-色氨酸的工艺
RU2699293C1 (ru) Способ получения биомассы метанокисляющих бактерий
RU2787202C1 (ru) Штамм Methylococcus capsulatus - продуцент высокобелковой биомассы
RU2720121C1 (ru) Способ получения микробного белка на основе углеводородного сырья
RU2064016C1 (ru) Способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и способ управления непрерывным процессом получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов
RU2745093C1 (ru) Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы
IE862147L (en) Alcohol production
US4003790A (en) Nitrogen control in mixed culture production
Kim et al. Control of intracellular ammonium level using specific oxygen uptake rate for overproduction of citric acid by Aspergillus niger
RU2032737C1 (ru) Способ выращивания метанокисляющих микроорганизмов
CN107338275A (zh) 利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产戊二胺的方法
SU908085A1 (ru) Способ получени биомассы
WO2024158272A1 (ru) Способ получения белкового кормового концентрата из микробного белка
RU2755539C1 (ru) Способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и линия для ее производства
RU2743396C1 (ru) Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах
RU2755727C2 (ru) Способ культивирования метанокисляющих бактерий
RU2811437C1 (ru) Способ культивирования метанокисляющих микроорганизмов
Zhivotchenko et al. Copper effect on the growth kinetics of Methylococcus capsulatus (bath)
CN111349577B (zh) 一种氨氧化细菌的培养方法