RU2743396C1 - Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах - Google Patents

Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах Download PDF

Info

Publication number
RU2743396C1
RU2743396C1 RU2019127450A RU2019127450A RU2743396C1 RU 2743396 C1 RU2743396 C1 RU 2743396C1 RU 2019127450 A RU2019127450 A RU 2019127450A RU 2019127450 A RU2019127450 A RU 2019127450A RU 2743396 C1 RU2743396 C1 RU 2743396C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nutrient medium
cultivation
salmonella
bioreactor
biomass
Prior art date
Application number
RU2019127450A
Other languages
English (en)
Inventor
Сергей Петрович Клыков
Виктор Евгеньевич Михеев
Антон Леонидович Поленов
Евгений Владимирович Сусский
Сергей Николаевич Ярцев
Original Assignee
Федеральное казенное предприятие "Армавирская биологическая фабрика"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное казенное предприятие "Армавирская биологическая фабрика" filed Critical Федеральное казенное предприятие "Армавирская биологическая фабрика"
Priority to RU2019127450A priority Critical patent/RU2743396C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2743396C1 publication Critical patent/RU2743396C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к выращиванию микроорганизмов в производственных условиях. Предлагается способ получения биомассы энтеробактерий Еscherichiа coli или Salmonella. Способ включает приготовление питательной среды на основе 0,9% раствора хлористого натрия и концентрата питательной среды, содержащего сухую глюкозу, основной перевар Хоттингера, натрий фосфорнокислый 12-водный, магний сернокислый 7-водный при заданных количествах, посев на питательную среду бактерий Еscherichiа coli или Salmonella и их культивирование при кислородном лимитировании при определенных параметрах с последовательной подачей концентрата питательной среды. Последовательную подачу концентрата питательной среды осуществляют в 3 этапа. Первая подача осуществляется через 2 ч после посева в количестве 2*V0/90 л/биореактор, вторая подача - через 3 ч после начала роста в количестве 4*V0/90 л/биореактор, а третья - начиная с 3,5 ч подачи подпитки 1,7*V0/90 мл/сек в постоянном режиме, где V0-исходный объём физиологического раствора в биореакторе, меняющийся в диапазоне 90-300 л. Изобретение позволяет повысить выход биомассы бактерий Еscherichiа coli и Salmonella. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр., 2 ил.

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для интенсификации производства вакцинных препаратов на основе биомассы микроорганизмов - энтеробактерий вида Escherichia coli и видов Salmonella.
Известны периодические процессы культивирования с добавлением субстрата (см. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, т. 2, гл. 9.1.1. - М.: Мир, 1989), где производится одноразовая загрузка питательной среды в биореактор, стерилизация, инокуляция посевным материалом, культивирование при непрерывном перемешивании и аэрации или в анаэробных условиях и дробное введение субстрата/ов. Эти процессы стараются проводить при поддержании постоянных физиологических условий культивирования: pH, скорость массопередачи кислорода на стадиях активного роста биомассы и иногда окислительно-восстановительный потенциал. Однако при ведении периодических процессов технически сложно, а подчас и невозможно обеспечить оптимальные значения иных физиологических параметров на более низком молекулярном и клеточном уровнях, необходимых для полноценного роста и деления клеток, как то оптимальные концентрации отдельных компонентов питания для быстрейшего протекания биохимических процессов, что говорит о наступлении условий несбалансированности питательной среды. Причиной несбалансированности питательной среды может являться различная скорость потребления каждого отдельного компонента, что приводит часто к исчерпанию одних компонентов и избытку иных компонентов, т.е. происходит разбалансирование питательной среды, что сопровождается снижением скорости роста биомассы, вплоть до полной остановки роста. Например, исчерпание глюкозы в питательной среде приводит к резкому снижению скорости роста клеток при переключении их на иной источник углерода и энергии. Другой крайностью может быть избыточная концентрация субстратов, что тоже влечёт снижение скорости роста клеток и часто может полностью остановить рост биомассы по причине возникающего ингибирования отдельных клеточных реакций и роста в целом.
Известен Способ промышленного культивирования штаммов E.coli, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения по патенту РФ №2473683, опубл. 27.01.2013. Способ культивирования основан на использовании созданных на основе штамма BL21(DE3) рекомбинантных штаммов-продуцентов и предусматривает их глубинное культивирование на питательной среде при дробном добавлении питательных субстратов, являющихся ингибитором, нейтральным веществом и индуктором по отношению к lacUV5 промотору, в процессе биосинтеза. Предусматривающий: выращивание инокулята до середины логарифмической фазы роста на питательной среде, где в качестве источника углерода используют глюкозу в концентрации 10 г/л, при температуре 38°С, перемешивании 200 об/мин, времени культивирования 3 ч; засев ферментера инокулятом с посевной дозой 10%; культивирование микроорганизмов при 38°С, концентрации растворенного кислорода 80% при максимальной скорости перемешивания 1200 об/мин, максимальном уровне аэрации 1 объем воздуха/мин: 1,2 объема культуральной жидкости, рН=7,00; - окончание ферментации на 12-13 ч культивирования; осаждение клеток штамма-продуцента E.coli, при этом вначале культивирования добавляют 50%-ный (мас.%) раствор глюкозы, в середине логарифмической фазы роста производится порционная добавка 80%-ного (мас.%) раствора глицерина и с конца логарифмической фазы роста культуры осуществляются дробные добавки 25%-ного (мас.%) раствора лактозы. Процесс длится до 12 часов, количество биомассы до 85 о.е.
Однако недостатками предлагаемого способа являются:
- Более низкий уровень массопередачи кислорода, который можно оценочно определить из представленных в патенте данных. Для середины процесса ~4 часа роста (середина логарифмической фазы роста согласно патента 2473683) - биомасса составляет около 10 г/л. Если принять значение экономического коэффициента по глюкозе для экспоненциальной фазы роста, Y = 0,6-0,7 [Таблица 1 в https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3698069/] то оцениваемое суммарное потребление этого субстрата за 4 часа будет равно ~14 г/л или, в среднем, 3,5 г/(л*ч), что соответствует ~2 ммоль O2/(л*мин). При этом если учитывать, что значительная часть глюкозы распадается на продукты неполного окисления при высоких значениях pO2, как положено по условиям известного решения, то реальный массообмен по кислороду должен быть ещё ниже.
- Низкий объём реакторов/ферментёров для производственного процесса - до 30 литров общего объёма, в то время как предлагаемый способ рассчитан на реакторы/ферментёры объёмом до 1 м3.
- Комплексный характер углеродного субстрата, состоящего из 3 веществ - глюкозы, глицерина и лактозы.
- Отсутствие единообразного алгоритма подпитки иными компонентами для преодоления различных биохимических барьеров, связанных с ингибированием или лимитированием этими компонентами по отдельности или вместе.
- Подпитки, которая имела бы простоту использования при реализации технологического процесса.
- Использование алгоритма исследовано только для вида E.coli, а другие энтеробактериальные виды не исследовались.
Для преодоления вышеуказанных негативных тенденций используется культивирование с подпитками. Подпиткой может быть как отдельный компонент, например глюкоза или источник азота, так и смесь компонентов.
Известен Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов по патенту РФ №2111246, опубл. 20.05.1998, где используется концентрированная подпитка, компоненты которой сбалансированы в определённом соотношении, включающий периодическое культивирование и подпитку питательной средой, что проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене 0,40 - 1,50 моль О2/(м3·мин) или уменьшением его в последние 3 ч культивирования на 50%, и подпитку концентрированной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 ± 2,0) : (1,2 ± 0,5) : (0,5 ± 0,2) : (0,15 ± 0,09), обеспечивающую конечный расход компонентов среды в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двухкратной от обычной концентрации.
Но соблюдение условий приблизительно соответствующим распространённому элементному составу сухой биомассы и данный способ применяется для условий культивирования, когда исходный состав питательной среды не проявляет ингибирующие свойства в самом начале ферментации. При этом область значений скорости потребления кислорода находится в пределах 0,4-1,5 ммоль O2 на 1 л среды в 1 мин.
Однако использование данного способа затруднительно для получения повышенных концентраций биомассы, если исходная питательная среда обогащена питательными веществами в такой значительной степени, что это может вызывать ингибирование компонентами питания.
Способ получения биомассы E.coli и Salmonella согласно известному решению, выбранному в качестве прототипа, проводят следующим образом. Выращенную и проверенную на чистоту роста посевную (матровую) культуру засевают в биореакторы через пробоотборник в количестве 8 – 10% от объема питательной среды следующего состава:
- бульон Хоттингера, состоящий из: основного перевара Хоттингера, разведенного водой до содержания аминного азота 250-300 мг%,
- 0,5% пептона, 0,5% хлористого натрия,
- 0,3% химически чистого двуосновного фосфорнокислого натрия
Культивируют микроорганизмы 12 – 14 часов при:
- температуре 37 ±1°С,
- непрерывной аэрации (1,5 – 2 объема воздуха на объем среды в мин),
- непрерывном перемешивании при 120 – 150 об/мин.
Через каждые 2 часа культивирования из реактора берут пробы для определения концентрации, чистоты культуры и рН,
Для улучшения роста микроорганизмов и снижения рН добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы из расчета 1 л раствора на 100 л среды при достижении значений 7,8-8,0.
Культивирование прекращают, когда концентрация микробов не повышается или повышается незначительно. Концентрация на выходе- 40 – 45 млрд. микробных клеток для обоих видов микроорганизмов.
Данный способ предусматривает дополнительное введение отдельных других компонентов питания в качестве подпитки, если это необходимо достижения концентрации микроорганизмов 40-45 миллиардов клеток/мл.
Однако данный способ не обеспечивает повышенных концентраций - до 82 миллиардов клеток/мл для E.coli и 65 миллиардов клеток для Salmonella.
Целью изобретения и достигаемым техническим результатом является повышение выхода биомассы аэробнорастущих клеток биомассы микроорганизмов - энтеробактерий вида Escherichia coli, и видов Salmonella, которая достигается тем, что в способе получения биомассы энтеробактерий Еscherichiа coli и Salmonella с повышенной урожайностью в производственных биореакторах, включающий операции периодического культивирования при кислородном лимитировании и подпитки биомассы питательной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, с поддержанием оптимальных физиологических значений рН по показаниям датчика биореактора, при этом
- проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при скоростью массопередачи кислорода в диапазоне 2,5±0,5 ммоль O2 на 1 л в 1 мин, при аэрации 1 объём воздуха на 1 объём среды в 1 мин и непрерывном перемешивании, при поддержании избыточного давления в реакторе 0,4-0,8 атм, в диапазоне pH 6,5-7,0 с преимуществом для низких значений;
- при получении двух компонентной питательной среды перед засевом биореактора, изначально в виде раствора хлорида натрия (0,9% раствор хлористого натрия), предварительно простерилизованного в реакторе с последующим смешиванием с концентратом питательной среды при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 ± 2,0) : (1,2 ± 0,5) : (0,5 ± 0,2) : (0,15 ± 0,09), в диапазоне соотношений от 5:1 до 2,5:1 , где 5 и 2,5, соответственно, доли раствора хлористого натрия для нижнего и верхнего значения исходного объёма раствора хлористого натрия в реакторе, с последующим посевом микроорганизмов,
- при этом последовательная подача концентрированной подпитки осуществляются: первая через 2 часа после посева в количестве 2*V0/90 л/биореактор, вторая подача через 3 часа после начала роста в количестве 4*V0/90 л/биореактор, третья - начиная с 3,5 часов подачи подпитки 1,7*V0/90 мл/сек в постоянном режиме, где V0-исходный объём физиологического раствора в биореакторе, меняющийся в диапазоне 90-300 л.
При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован в биореакторе с общим объём 1000 л и максимальный рабочим объёмом в конце культивирования от 140 до 450 л.
При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован при условии, что процесс культивирования проводят при отсутствии пептона в исходной питательной среде и подпитке.
При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован при предварительной стерилизации раствора хлорида натрия в реакторе при 120 градусах Цельсия в течение 60 мин, в количестве 90-300 л.
В связи с тем, что в предлагаемом способе конечный объём ферментационной жидкости увеличивается по ходу процесса культивирования до 1,5 раз по сравнению с исходным объёмом культивирования, для оценки урожая биомассы используется показатель общего съёма урожая, равный произведению действующей концентрации микроорганизмов на рабочий объём в реакторе в данный момент времени, триллионы клеток/биореактор. Примеры реализации приведены ниже.
Влияние пропорции добавленной первоначально концентрированной подпитки при последующей подпитке растущих культур микроорганизмов с разными скоростями подпитки для разных исходных объёмов согласно предлагаемому способу позволило получить кривые с оптимумами накопления биомассы, в триллионах клеток на биореактор в зависимости от процентного содержания подпитки, добавленной в реактор перед посевом, Фиг. 1 и 2. Оптимальные пропорции добавленной подпитки находятся в пределах 33,3%-66,7%, что по предлагаемому способу позволяет увеличить в 1,5-2 раза съём урожая биомассы для E.coli и в 1,4-1,65 раза для Salmonella по сравнению с имеющейся технологией.
Сущность изобретения заключается в том, что с целью повышения урожая при ферментациях.
Процесс культивирования проводят при отсутствии дорогостоящего пептона в исходной питательной среде и подпитке.
Процесс культивирования проводят в диапазоне pH 6,5-7,0 при добавлении 10% раствора NaOH по показаниям датчика pH - с преимуществом для низких значений.
В начале процесса культивирования используется следующая схема приготовления питательной среды перед засевом биореактора: раствор хлорида натрия (0,9% раствор хлористого натрия), предварительно простерилизованный при 120 градусах Цельсия в реакторе, в количестве 90-300 л смешивается с концентратом питательной среды (Подпиткой), в диапазоне соотношений от 5:1 до 2,5:1, где 5 и 2,5, соответственно, доли раствора хлористого натрия для нижнего и верхнего значения исходного объёма раствора хлористого натрия в реакторе, с последующим посевом микроорганизмами.
Подпитка имеет следующий состав на 1 л: 0,1 кг сухой глюкозы, до 1 л основного перевара Хоттингера с содержанием аминного азота 1000 мг%, 0,005 кг натрия фосфорнокислого 12-водного, 0,0015 кг магния сернокислого 7-водного.
Подачи концентрированной подпитки осуществляются по следующей схеме: Первая подача подпитки осуществляется через 2 часа после посева в количестве до 2*V0/90 л/биореактор. Через 3 часа после начала роста – вторая подача подпитки в количестве до 4*V0/90 л/биореактор. Далее, начиная с 3,5 часов, включаем предварительно оттарированный по воде насос на скорость подачи подпитки до 1,7*V0/90 мл/сек в постоянном режиме, где V0-исходный объём физиологического раствора в реакторе, который может изменяться в диапазоне 90-300 л.
Окончанием процесса считается накопление не менее 50х109 микробных клеток/мл для Salmonella при конечном рабочем объеме не менее 150 л (урожайность 7500 триллионов клеток - произведение концентрации микроорганизма на конечный объём в реакторе перед сливом урожая) или накопление не менее 65х109 микробных клеток/мл для E.coli при конечном рабочем объеме не менее 130 л (урожайность 8450 триллионов клеток) или до исчерпания подпитки. В результате культивирования обеспечиваются концентрации от 56 до 82 млрд/см3, соответственно, для Salmonella и E.coli.
На фиг.1 и 2 представлены Зависимости процента прироста (показатель эффективности увеличения выхода биомассы, в %) съёма урожаев биомассы для видов E.coli и Salmonella, %, в предлагаемой схеме, с исследованием влияния различных количеств (объёмов) первоначально добавленных компонентов в питательную среду, в %, на общий выход биомассы, в %, по сравнению с обычным культивированием с подачей глюкозы по значениям pH и 10%-ным раствором едкого натрия. Показатель эффективности представляет собой отношение между разностью микробных концентраций в конце культивирования по новому способу и регламентной культуры к концентрации по регламентному способу, т.е. это есть отношение прибавления к имеющейся регламентной технологии.
Примеры реализации способа при первоначальном количестве Подпитки азотными веществами и витаминным комплексом при его первоначальной подаче 1/3 от общего количества данной Подпитки-48 литров:
Пример 1. Культивирование E.coli, смесь штаммов: 733, 1308, 1370, 1463. Ферментация 28.02.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 70 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 40 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 3 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста – 3,5 л/ч.
Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы - 4 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 162 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 80 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 12,96 триллионов клеток/биореактор.
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным растовором едкого натрия, при концентрации клеток E.coli 45 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 148 л, даёт общий выход биомассы 45 млрд/мл*144*103 мл=6480 триллинов клеток.
Эффективность =100%*(12,96-6,48)/6,48= 100%.
Пример 2. Культивирование E.coli, штаммы 320, 1330, 1230, 1092. Ферментация 13.03.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 70 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 40 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 3,5 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста - 3,5 л/ч.
Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы-3,5 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 156,5 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса- 82 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 12,8 триллионов клеток/биореактор.
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным растовором едкого натрия., при концентрации клеток E.coli 40 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 142 л, даёт общий выход биомассы 45 млрд/мл*142*103 мл=6400 триллинов клеток.
Эффективность =100%*(12,8 – 6,4)/6,4= 100%.
Пример 3. Культивирование Salmonella dublin, штамм Армавирской биофабрики. Ферментация 28.03.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 90 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 20 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 4 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста - 4 л/ч.
Подача подпитки на 4-й час роста и в последующие часы - 4 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 166,5 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 55 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 9,157 триллионов клеток/ на биореактор.
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным раствором едкого натрия, при концентрации клеток Salmonella dublin 41,6 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 160 л, даёт общий выход биомассы 41,6 млрд/мл*160*103 мл=6660 триллионов клеток.
Эффективность =100%*(9,157-6,66)/6,66= 37,5%.
Пример 4. Культивирование Salmonella typhymurium, штамм Армавирской биофабрики. Ферментация 29.03.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 90 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 20 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 4 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста - 4 л/ч.
Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы - 4 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 165 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 62 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 10,23 триллионов клеток/на биореактор.
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10%-ным растовором едкого натрия., при концентрации клеток Salmonella dublin 40 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 165 л, даёт общий выход биомассы 40 млрд/мл*165*103 мл=6600 триллионов клеток.
Эффективность=100%*(10,23-6,6)/6,6= 55%.
Пример 5. Сводные данные по увеличению эффективности прироста биомассы для различных первоначальных количеств добавляемой азотно-витаминно-фосфорно-магниевой подпитки.
Процент изначально загруженной среды Вид Процент эффективности
100 E.coli IV(контроль) 0
33 E.coli I* 100
33 E.coli II 50
33 E.coli III 100
67 E.coli IV 93
0 E.coli шт.727(декабрь 2017) 25
33 Sal.dublin 37,5
33 Sal. Th.murium 55
0 Sal.dublin 25
0 Sal.dublin 40
100 Сальмонеллы (контроль) 0
67 Sal.dublin 39,8
*В данной Таблице штаммы E.coli сгруппированы по общепринятой классификации в группы, В отличие от предыдущих Примеров, здесь даны номера групп.

Claims (3)

1. Способ получения биомассы энтеробактерий Еscherichiа coli или Salmonella в производственных биореакторах, предусматривающий приготовление питательной среды путем смешивания предварительно простерилизованного 0,9% раствора хлористого натрия и концентрата питательной среды, содержащего до 01 кг сухой глюкозы, до 1 л основного перевара Хоттингера с содержанием аминного азота 1000 мг%, 0,005 кг натрия фосфорнокислого 12-водного, 0,0015 кг магния сернокислого 7-водного, посев E.coli или Salmonella, культивирование микроорганизмов при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при скорости массопередачи кислорода в диапазоне 2,5±0,5 ммоль O2 на 1 л в 1 мин, при аэрации 1 объём воздуха на 1 объём среды в 1 мин и непрерывном перемешивании, при поддержании избыточного давления в реакторе 0,4-0,8 атм, в диапазоне pH 6,5-7,0 с преимуществом для низких значений; с последовательной подачей концентрата питательной среды: через 2 ч после посева в количестве до 2*V0/90 л/биореактор, вторая подача - через 3 ч после начала роста в количестве до 4*V0/90 л/ биореактор и третья подача - начиная с 3,5 ч подачи концентрата питательной среды 1,7*V0/9 мл/сек, в постоянном режиме по прошествии данного времени, где V0 - исходный объём физиологического раствора в реакторе, меняющийся в диапазоне 90-280 л; культивирование осуществляют до накопления биомассы до 82 миллиардов клеток/мл для E.coli и 65 миллиардов клеток/мл для Salmonella.
2. Способ получения биомассы по п. 1, отличающийся тем, что биореактор имеет общий объем 1000 л и максимальный рабочий объем в конце культивирования от 140 до 450 л.
3. Способ получения биомассы по п. 1, отличающийся тем, что предварительную стерилизацию раствора хлорида натрия в количестве 90-280 л проводят в реакторе при 120 градусах Цельсия в течение 60 мин.
RU2019127450A 2019-08-30 2019-08-30 Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах RU2743396C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019127450A RU2743396C1 (ru) 2019-08-30 2019-08-30 Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019127450A RU2743396C1 (ru) 2019-08-30 2019-08-30 Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2743396C1 true RU2743396C1 (ru) 2021-02-18

Family

ID=74665988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019127450A RU2743396C1 (ru) 2019-08-30 2019-08-30 Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2743396C1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2111246C1 (ru) * 1992-06-03 1998-05-20 Дербышев Виктор Викторович Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов
RU2138549C1 (ru) * 1994-08-31 1999-09-27 Орлова Валентина Сергеевна Способ получения биомассы микроорганизмов
RU2447143C2 (ru) * 2008-11-24 2012-04-10 Виктор Викторович Дербышев СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С
RU2473683C1 (ru) * 2011-12-15 2013-01-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММОВ E.coli, ПОЛУЧЕННЫХ НА ОСНОВЕ ШТАММА BL21(DE3), НЕСУЩЕГО ГЕН T7 RNA ПОЛИМЕРАЗЫ ПОД КОНТРОЛЕМ lacUV5 ПРОМОТОРА, С ПОВЫШЕННЫМ СИНТЕЗОМ БИОМАССЫ И ВЫХОДОМ ЦЕЛЕВОГО БЕЛКА В ТЕЛЬЦАХ ВКЛЮЧЕНИЯ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2111246C1 (ru) * 1992-06-03 1998-05-20 Дербышев Виктор Викторович Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов
RU2138549C1 (ru) * 1994-08-31 1999-09-27 Орлова Валентина Сергеевна Способ получения биомассы микроорганизмов
RU2447143C2 (ru) * 2008-11-24 2012-04-10 Виктор Викторович Дербышев СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С
RU2473683C1 (ru) * 2011-12-15 2013-01-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММОВ E.coli, ПОЛУЧЕННЫХ НА ОСНОВЕ ШТАММА BL21(DE3), НЕСУЩЕГО ГЕН T7 RNA ПОЛИМЕРАЗЫ ПОД КОНТРОЛЕМ lacUV5 ПРОМОТОРА, С ПОВЫШЕННЫМ СИНТЕЗОМ БИОМАССЫ И ВЫХОДОМ ЦЕЛЕВОГО БЕЛКА В ТЕЛЬЦАХ ВКЛЮЧЕНИЯ

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102168115A (zh) 一种辅酶q10工业化生产方法
US20240067993A1 (en) Method of culture
CN111500464A (zh) 一种先兼养-后自养微藻生产叶黄素的方法
NO146331B (no) Fremgangsmaate til fremstilling av et enecellet proteinmateriale ved dyrking av termofile bakterier
AU2020101953A4 (en) A method of cultivating microalgae with high oil content
RU2743396C1 (ru) Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах
RU2447143C2 (ru) СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С
EP0047641B1 (en) Ethanol production by high performance bacterial fermentation
JP2013132248A (ja) 光合成細菌の培養方法および光合成細菌
RU2745093C1 (ru) Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы
Kim et al. Control of intracellular ammonium level using specific oxygen uptake rate for overproduction of citric acid by Aspergillus niger
CN112852893A (zh) 一种生物发酵生产长链二元酸的方法
JP3004509B2 (ja) 微細藻からのエタノール製造方法及び装置
CN111893077A (zh) 一种丁酸梭菌的规模化生产方法
EP1613759B1 (en) Fermentation processes with low concentrations of carbon- and nitrogen-containing nutrients
CN109762858A (zh) 以罗氏阿太菌为菌种生产硬葡聚糖发酵液的方法
Virkar et al. Glycerol production by anaerobic vacuum fermentation of molasses on pilot scale
US4042460A (en) Method for producing glucose isomerase
US20080233624A1 (en) Apparatus and method for biohydrogen production
CN107604017A (zh) 一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法
CN111748491B (zh) 一种利用低频交变磁场促进巴氏醋酸杆菌发酵产酸的方法
RU1314667C (ru) Способ выращивания метанолокислящих бактерий
US3843445A (en) Asparaginase production
KR900007000B1 (ko) 칸디다 유틸리스의 변이주 sh 8636 및 이를 이용한 단세포단백질의 제조방법
US3067109A (en) Method for producing cobalamins