RU2447143C2 - СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С - Google Patents

СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С Download PDF

Info

Publication number
RU2447143C2
RU2447143C2 RU2008146193/10A RU2008146193A RU2447143C2 RU 2447143 C2 RU2447143 C2 RU 2447143C2 RU 2008146193/10 A RU2008146193/10 A RU 2008146193/10A RU 2008146193 A RU2008146193 A RU 2008146193A RU 2447143 C2 RU2447143 C2 RU 2447143C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
concentration
medium
amine nitrogen
gramicidin
lactic acid
Prior art date
Application number
RU2008146193/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2008146193A (ru
Inventor
Виктор Викторович Дербышев (RU)
Виктор Викторович Дербышев
Сергей Петрович Клыков (RU)
Сергей Петрович Клыков
Владимир Васильевич Кураков (RU)
Владимир Васильевич Кураков
Original Assignee
Виктор Викторович Дербышев
Сергей Петрович Клыков
Владимир Васильевич Кураков
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Виктор Викторович Дербышев, Сергей Петрович Клыков, Владимир Васильевич Кураков filed Critical Виктор Викторович Дербышев
Priority to RU2008146193/10A priority Critical patent/RU2447143C2/ru
Publication of RU2008146193A publication Critical patent/RU2008146193A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2447143C2 publication Critical patent/RU2447143C2/ru

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ культивирования Bacillus brevis штамм 101 для получения грамицидина С. Осуществляют глубинное выращивание культуры на синтетической питательной среде. Среда содержит автолизат дрожжей и гидролизат казеина в концентрациях 0,1 г/л и 0,2 г/л по аминному азоту, глицерин в концентрации 20 мл/л, пищевую 40%-ную молочную кислоту - 2,0-4,0 мл/л, хлористый фосфорно-кислый аммоний - 0-3,4 г/л, двузамещенный фосфорно-кислый аммоний - 0,85-4,5 г/л, фосфорно-кислый однозамещенный калий - 0-1,0 г/л, сернокислый 7-водный магний - 0,9 г/л, лимонно-кислый натрий - 1,0 г/л. Содержание аминного азота в исходной среде составляет 1,3-1,6 г/л. При снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л среду подпитывают концентрированным питательным раствором до концентрации 1,75 г/л. В состав концентрированного питательного раствора входят глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1÷(0,008-0,032)÷(0,027-0,036)÷(0-0,008)÷(0,002-0,008). В процессе роста скорость перемешивания увеличивают с 200 до 500 об/мин. Поддерживают рН на уровне 6,5-6,8 введением растворов едкого калия и натрия. Процесс останавливают через 2-6 ч после начала стационарной фазы. Способ позволяет воспроизводимо получать более 3,0 г/л грамицидина С. 10 табл., 5 пр.

Description

Использование: Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и может быть использовано для получения грамицидина С высокоэффективным микробиологическим способом,
Сущность изобретения: способ включает периодическое культивирование продуцента грамицидина С Bacillus brevis штамм 101 на сбалансированной по составу среде и дополнительную подпитку концентратом питательного раствора в процессе выращивания, ввод которого производят при значениях аминного (восстановленного) азота в культуральной жидкости (КЖ) ниже 1,4 г/л до достижения значения не более 1,75 г/л при кислородном лимитировании в условиях обеспечения развивающихся культур кислородом за счет плавного повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25·10-3 до 1·10-3 моль O2/л·мин и скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин при поддержании парциального содержания растворенного кислорода в культуре, близкого к нулю (0-10%), поддержания значения рН на уровне 6,5-6,8 и при остановке процесса выращивания через 2-6 ч после начала стационарной фазы, о чем свидетельствует изменение концентрации биомассы (прирост или убыль) по оптической плотности на величину не более чем на 1 г/л.
Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и может быть использовано для организации высокоэффективного производства грамицидина С.
Известны способы получения грамицидина С при глубинном выращивании продуцента Bacillus brevis на синтетических средах [1-6].
Существующий периодический процесс получения грамицидина С при выращивании наиболее продуктивных штаммов Bacillus brevis, выбранный в качестве прототипа [8], который использовали для синтеза продукта при выращивании Bacillus brevis штамма 101 [7], характеризуется тем, что производится одноразовая загрузка питательной среды в ферментер, инокуляция посевным материалом, культивирование при аэрации и перемешивании в течение 27 часов до достижения величины рН 6,0 и ниже.
Анализ этого способа показал, что ферментационная среда содержит весь запас питательных субстратов с момента посева. Следовательно, ранее при культивировании Bacillus brevis для роста и биосинтеза грамицидина С не использовали подпитки концентратами питательных растворов оптимизированного состава, как они использовались в [9]. Питательная среда прототипа не оптимальна, поскольку недостаточна по отдельным элементам питания (фосфор и магний), и в то же время содержит в избытке другие (глицерин и щавелевокислый аммоний). В результате высокой ингибирующей концентрации глицерина и аминного азота (2,0-3,0 г/л) в среде рост продуцента замедлен. Вследствие недостатка минеральных компонентов концентрация биомассы составляла всего около 10 г/л в среднем и не более 15 г/л. Высокая концентрация молочной кислоты (10,5 г/л) способствует накоплению клонов, не продуцирующих грамицидин С. При выращивании продуцента на этой среде величину рН не регулировали, и она снижалась до значений ниже 6,0. Низкая скорость массопередачи по кислороду (1,28·10-2 г О2/л·мин) при аэрации 0,66 л/л·мин и перемешивании (259-303 об/мин) также не способствовала получению культуры с высокой концентрацией биомассы и продукта. По этой причине содержание грамицидина в культуре в лучшем случае составляло около 2 г/л.
Целью изобретения является увеличение выхода грамицидина С в процессе периодического культивирования Bacillus brevis.
Использование предлагаемого способа позволяет получить более 3,0 г/л грамицидина С. Сущность изобретения заключается в том, что с целью увеличения выхода грамицидина С при глубинном выращивании продуцента Bacillus brevis на синтетической среде выращивание производят на среде следующего состава:
- глицерин - 20 мл/л,
- пищевая 40% молочная кислота - 2-4 мл/л;
- автолизат дрожжей - 0,1 г/л (по аминному азоту);
- гидролизат казеина - 0,2 г/л (по аминному азоту);
- хлористый аммоний, NH4Cl - 0-3,4 г/л;
- двузамещенный фосфорнокислый аммоний, (NH4)2HPO4(ДАФ) - 0,85-4,5 г/л;
- калий фосфорнокисный однозамещенный, KH2PO4 - 0-1,0 г/л;
- магний сернокислый, 7-водный, MgSO4·7H2O - 0,9 г/л;
- натрий лимоннокислый, одноводный - 1,0 г/л.
Содержание в среде аминного (восстановленного) азота - 1,3-1,6 г/л.
Способ включает дополнительную подпитку концентрированным питательным раствором, в состав которого входят глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1: (0,008-0,032):(0,027-0,036):(0-0,008):(0,002-0,008), ввод которого производят при значениях аминного азота в культуральной жидкости ниже 1,4 г/л до достижения концентрации не более 1,75 г/л при ограничении роста недостатком кислорода в условиях плавного повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25·10-3 до 1,0·10-3 моль O2/л·мин и скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин и поддержания парциального содержания растворенного кислорода в культуре, близкого к нулю (0-10%), поддержания значения рН на уровне 6,5-6,8 и при остановке процесса выращивания через 2-6 ч после начала стационарной фазы, о чем свидетельствует изменение концентрации биомассы (прирост или убыль) по оптической плотности, на величину не более чем на 1 г/л.
Пример 1.
Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 10 л.
Характеристика посевного материала:
- объем 0,5 л,
- типичная морфология,
- биомасса 2,5-3,5 г/л,
- рН 6,4-6,7.
Таблица 1
Состав среды для выращивания в ферментере
Компоненты на 1 л среды
Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1
Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2
Цитрат натрия, г/л 1,0
КН2РO4, г/л 1,0
(NH4)2НРO4, г/л 4,5
MgSO4·7H2O, г/л 0,9
Молочная кислота пищевая, 40%-ный р-р, мл/л, 2,0
Глицерин, мл/л 20,0
Вода, л до 1,0
Пеногаситель (лапрол), мл 1,0
КОН (15% раствор)  
- подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8
- подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8
НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8
Рабочий объем ферментера 6 л, поэтому закладку компонентов на 6 л среды (с учетом ввода 0,5 л посевного материала) производили по табл.1. В состав концентрированного питательного раствора (концентрата) входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый аммоний и 7-водный сернокислый магний при соотношении глицерина, молочной кислоты, азота и магния 1,0:0,032:0,027:0,002. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного ценообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрированный питательный раствор и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин. Подачу концентрата по ходу ферментации осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывала повышение аминного азота в КЖ на 3,67·10-2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 461 об/мин, поддерживая рO2 на уровне 0-10%.
Таблица 2
Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 10 л
τ, ч n, об/мин KLa, n·10-3 моль O2/л·мин рO2, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C
0 202 0,25 100 6,9 1,38 0,43 н/о н/о
3 230 0,29 1,4 6,9 1,38 0,78 н/о н/о
6 253 0,32 1,2 6,9 1,41 1,25 н/о н/о
9 270 0,34 1,3 6,8 1,31 2,30 н/о н/о
12 281 0,36 1,4 6,9 1,38 3,34 0,412 5,4
15 300 0,39 0,9 6,7 1,54 4,39 0,655 5,6
18 348 0,49 3,0 6,7 1,68 6,90 1,085 5,8
21 354 0,50 1,7 6,7 1,40 9,57 1,465 5,3
24 393 0,60 1,5 6,6 1,40 12,54 2,346 6,0
27 393 0,60 0,9 6,6 0,91 18,10 2,700 5,8
30 405 0,64 0,8 6,6 0,84 22,60 3,722 8,4
33 450 0,71 9,7 6,7 0,70 27,10 4,287 6,9
36 461 0,83 10,0 6,6 0,49 29,30 4,710 6,4
38 461 0,83 4,5 6,6 0,49 28,20 4,944 6,4
Данные табл.2 показывают, что выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 38 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 461 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рO2 на уровне 0,9-10%. При этом скорость массопередачи возрастала с 0,25·10-3 моль O2/л·мин до 0,83·10-3 моль О2/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO2 0-10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,68 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.
Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 33-й час. Выращивание было остановлено через 4-5 часов после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 28-29 г/л биомассы и 4,944 г/л грамицидина С с содержанием примесей 6,4% от грамицидина С.
Пример 2.
Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 10 л.
Характеристика посевного материала:
- объем 0,5 л,
- типичная морфология,
- биомасса 2,5-3,5 г/л,
- рН 6,4-6,7.
Таблица 3
Состав среды для выращивания в ферментере
Компоненты на 1 л среды
Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1
Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2
Глицерин, м/л 20,0
NH4Cl, г/л 3,4
(NH4)2НРO4, г/л 0,85
MgSO4·7H2O, г/л 0,9
Молочная кислота пищевая 40%-ный р-р, мл/л, 4,0
Цитрат натрия, мл/л 1,0
Вода, л до 1,0
Пеногаситель (лапрол), мл 1,0
KОН (15% раствор)  
- подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8
- подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8
НСl (10% раствор), при
необходимости, после стерилизации, до рН		 6,7-6,8
Рабочий объем ферментера 6 л, поэтому закладку компонентов на 6 л среды (с учетом ввода посевного материала) производили по табл.3. Использовали концентрированный питательный раствор (концентрат), в состав которого входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорно-кислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1:0,008:0,036:0,005:0,008. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного ценообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин.
Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывает повышение аминного азота, в КЖ на 5,27·10-2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 500 об/мин, поддерживая рO2 на уровне 0-10%.
Таблица 4
Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 10 л
τ, ч n, об/мин KLa, n·10-3 моль O2/л·мин рO2, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C
0 202 0,25 100 6,7 1,47 0,37 н/о н/о
3 202 0,25 2,4 6,8 1,40 0,68 н/о н/о
6 225 0,28 2,2 6,6 1,26 2,04 н/о н/о
9 247 0,31 3,3 6,7 1,33 3,45 н/о н/о
12 270 0,34 2,2 6,6 1,26 4,81 0,576 4,22
15 298 0,39 1,5 6,6 1,40 7,32 0,998 6,10
18 320 0,43 1,7 6,6 0,91 9,64 1,639 9,30
21 343 0,48 1,8 6,6 0,84 13,49 2,297 8,90
24 393 0,60 2,0 6,6 0,84 16,94 3,163 8,90
27 393 0,60 2,0 6,6 0,84 21,34 3,360 8,28
30 450 0,78 2,2 6,6 0,77 26,15 4,083 8,60
33 500 0,99 2,8 6,6 0,98 28,24 4,162 8,30
36 500 0,99 2,4 6,6 0,77 33,89 4,553 9,10
39 500 0,99 2,4 6,6 1,05 37,68 4,772 8,90
42 500 0,99 63,0 6,8 1,05 38,01 5,282 8,44
Данные табл.4 показывают, что выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 42 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 500 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая pO2 на уровне 1,5-10%. Скорость массопередачи возрастала с 0,25·10-3 моль O2/л·мин до 0,99·10-3 моль O2/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO2 0-10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,47 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.
Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 38 г/л биомассы и 5,282 г/л грамицидина С с содержанием примесей 8,44% от грамицидина С.
Пример 3.
Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 100 л. Посевной материал готовили в 10-литровом ферментере.
Характеристика посевного материала:
- объем 5,2 л,
- типичная морфология,
- биомасса - 2,93 г/л,
- рН 6,4.
Таблица 5
Состав среды для выращивания в ферментере «Биор 0,1»
Компоненты на 1 л среды
Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1
Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2
Цитрат натрия, г/л 1,0
КН2РO4, г/л 1,0
(NH4)2НРO4, г/л 4,5
MgSO4·7H2O, г/л 0,9
Молочная кислота пищевая 40%-ный р-р, мл/л, 2,0
Глицерин, мл/л 20,0
Вода, л до 1,0
Пеногаситель (лапрол), мл 1,0
КОН (15% раствор)  
- подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8
- подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8
НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8
Рабочий объем ферментера 60 л, поэтому закладку компонентов на 60 л среды (с учетом ввода 5,2 л посевного материала) производили по табл.5.
В состав концентрированного питательного раствора (концентрата) входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый аммоний и 7-водный сернокислый магний при соотношении глицерина, молочной кислоты, азота и магния 1,0:0,032:0,030:0,002. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15%-ный раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин. Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 100 мл концентрата на 60 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,29·10-2 г/л.
В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 502 об/мин, поддерживая рO2 на уровне 0-10%.
Таблица 6
Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 100 л
τ, ч n, об/мин KLa,n·10-3 моль O2/л·мин рO2, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C
0 203 0,37 100 6,8 1,40 0,25 н/о н/о
3 203 0,37 0,2 6,8 1,40 0,68 н/о н/о
6 276 0,47 0,4 6,8 1,40 1,26 н/о н/о
9 321 0,55 0,5 6,7 1,40 2,09 н/о н/о
12 350 0,61 0,6 6,6 1,47 3,03 0,474 5,9
15 389 0,69 1,0 6,6 1,40 3,87 0,632 5,7
18 400 0,72 3,2 6,6 1,26 5,02 1,013 5,8
21 431 0,80 1,0 6,6 1,19 7,32 1,503 8,1
24 468 0,91 1,0 6,6 1,19 10,04 1,888 8,6
27 500 1,01 7,1 6,6 0,12 11,94 2,654 8,8
30 502 1,02 0,8 6,6 0,12 15,90 2,892 7,7
33 502 1,02 0,8 6,6 0,91 17,80 3,211 7,2
36 502 1,02 14,8 6,6 0,63 21,70 3,498 7,9
39 502 1,02 0,9 6,7 0,56 22,56 3,807 7,6
Данные табл.6 показывают, что выращивание продуцента в 100-литровом ферментере производили в течение 39 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 502 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рO2 на уровне 0,2-15%. При этом скорость массопередачи возрастала с 0,37·10-3 моль О2/л·мин до 1,02·10-3 моль O2/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO2 (0-10%) и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,4 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.
Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 36-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 22,5 г/л биомассы и 3,807 г/л грамицидина С с содержанием примесей 7,6% от грамицидина С.
Пример 4.
Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 10 л. Характеристика посевного материала:
- объем 0,5 л,
- типичная морфология,
- биомасса 2,5-3,5 г/л,
- рН 6,4-6,7.
Таблица 7
Состав среды для выращивания в ферментере
Компоненты на 1 л среды
Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1
Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2
Глицерин, м/л 20,0
NH4Cl, г/л 3,4
(NH4)2НРO4, г/л 0,85
MgSO4·7H2O, г/л 0,9
Молочная кислота пищевая, 40%-ный р-р, мл/л, 4,0
Цитрат натрия, мл/л 1,0
Вода, л до 1,0
Пеногаситель (лапрол), мл 1,0
NaОН (15% раствор)  
- подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8
- подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8
НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8
Рабочий объем ферментера 6 л, поэтому закладку компонентов на 6 л среды (с учетом ввода посевного материала) производили по табл.7. Использовали концентрированный питательной раствор, в состав которого входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1:0,009:0,038:0,008:0,008. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого натрия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин.
Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,37·10-2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 472 об/мин, поддерживая рO2 на уровне 0-10%.
Таблица 8
Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 10 л
τ, ч n, об/мин KLa, n·10-3 моль O2/л·мин рO2, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C
0 202 0,25 100 6,7 1,40 0,40 н/о н/о
3 202 0,25 0,4 6,8 1,12 0,84 н/о н/о
6 253 0,32 0,7 6,7 1,05 2,09 н/о н/о
9 292 0,38 2,1 6,9 0,91 3,45 н/о н/о
12 303 0,40 4,1 6,6 1,19 5,44 0,888 5,9
15 332 0,46 1,0 6,7 0,49 7,32 1,425 11,3
18 354 0,50 0,5 6,7 0,63 8,16 2,199 14,6
21 354 0,50 0,6 6,7 0,91 11,13 2,667 9,1
24 399 0,62 0,4 6,7 0,98 14,43 2,847 10,3
27 427 0,71 10,0 6,7 0,77 17,12 3,337 11,1
30 478 0,89 1,2 6,7 0,84 19,68 3,793 11,4
33 472 0,87 2,9 6,7 0,70 23,44 3,674 11,4
36 472 0,87 6,5 6,7 0,63 27,20 3,870 12,3
39 472 0,87 3,7 6,7 0,77 28,80 4,643 11,1
42 410 0,65 1,1 6,7 0,99 29,30 5,366 11,6
Данные табл.8 показывают, что выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 42 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 472 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рО2 на уровне 1,5-10%. Скорость массопередачи возрастала с 0,25·10-3 моль O2/л·мин до 0,87·10-3 моль O2/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO2 0-10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,4 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.
Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого натрия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 29 г/л биомассы и 5,366 г/л грамицидина С с содержанием примесей 11,6% от содержания грамицидина С.
Пример 5.
Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 100 л.
Посевной материал выращивали в 10-литровом ферментере.
Характеристика посевного материала для 100-литрового аппарата:
- объем 5,0 л,
- отсутствие посторонней микрофлоры,
- типичная морфология вегетативных клеток,
- биомасса 2,82 г/л,
- рН7.
Таблица 9
Состав среды для выращивания в ферментере «Биор 0,1»
Компоненты на 1 л среды
Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1
Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2
Цитрат натрия, г/л 1
КН2РO4, г/л 1
(NH4)2НРO4, г/л 4,5
MgSO4·7H2O, г/л 0,9
Молочная кислота пищевая, 40%-ный р-р, мл/л, 2,0
Глицерин, мл/л 20,0
Вода, л до 1,0
Пеногаситель (лапрол), мл 1,0
КОН (15% раствор)  
- подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8
- подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8
НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8
Рабочий объем ферментера 60 л, поэтому закладку компонентов на 60 л среды (с учетом ввода 5,0 л посевного материала) производили по табл.9.
В состав концентрированного питательного раствора (концентрата) входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый аммоний и 7-водный сернокислый магний при соотношении глицерина, молочной кислоты, азота и магния 1,0:0,032:0,030:0,002. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин.
Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 100 мл концентрата на 60 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,29·10-2 г/л.
В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 502 об/мин, поддерживая pO2 на уровне 0-10%.
Таблица 10
Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 100 л
τ, ч n, об/мин KLa, n·10-3 моль O2/л·мин рO2, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C
0 203 0,37 100 7,1 1,54 0,33 н/опр н/о
3 203 0,37 1,2 7,1 1,47 0,42 н/опр н/о
6 302 0,52 1,1 6,9 1,75 0,78 н/опр н/о
9 321 0,55 1,4 6,9 1,75 1,62 н/опр н/о
12 350 0,61 1,0 6,8 1,75 2,62 0,454 9,3
15 400 0,72 1,0 6,8 1,75 3,66 0,611 8,4
18 450 0,85 1,2 6,6 1,75 5,64 0,881 8,4
21 502 1,02 1,5 6,6 1,61 7,32 1,437 9,7
24 485 0,96 1,4 6,6 1,61 10,00 1,844 10,0
27 491 0,98 1,3 6,6 1,54 13,10 2,352 9,4
30 502 1,02 1,1 6,6 1,54 15,69 2,747 8,0
33 502 1,02 1,1 6,6 1,40 19,66 3,136 8,1
36 502 1,02 1,2 6,6 1,26 23,01 3,532 8,6
39 494 0,99 1,1 6,6 0,91 27,20 4,173 8,3
42 502 1,02 26,3 6,6 0,56 27,60 4,267 8,0
Данные табл.10 показывают, что выращивание продуцента в 100-литровом ферментере производили в течение 41 часа в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 502 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рO2 на уровне 1,0-1,5. В процессе выращивания скорость массопередачи возрастала с 0,37·10-3 моль O2/л·мин до 1,02·10-3 моль O2/л·мин. Начиная с 8-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO2 (0-10%) и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,75 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.
Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 2 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 27,6 г/л биомассы и 4,267 г/л грамицидина С с содержанием примесей 8,0%.
Источники информации
1. Коршунов В.В. Физиология обмена веществ Bacillus brevis subsp. G.-B. в связи с биосинтезом грамицидина С. - Канд. дисс., 1962, М., МГУ.
2. Коршунов В.В., Егоров Н.С. Синтетическая среда для развития Bacillus brevis и образование граммидина. Микробиология, 1962; 31:3, 515-519.
3. Шапошников В.Н., Работнова И.Л., Силаев А.Б. и др. Способ получения кристаллического грамицидина С. - Авторское свидетельство на изобретение №187243, 1963.
4. Куплетская М.Б. Влияние аэрации на развитие и образование граммидина культурой Bacillus brevis var. G.-B. Микробиология, 1965; 34:5, 905-909.
5. Жарикова Г.Г. Естественная изменчивость споровых бактерий и биосинтез полипептидных антибиотиков. - Докт. дисс., 1972, М., МГУ.
6. Березовская А.И., Выпияч А.Н., Егоров Н.С. и др. Штамм Bacillus brevis 101 - продуцент грамицидина С. - Авторское свидетельство на изобретение №686463, 1978.
7. Юдина Т.П. Физиолого-биохимические особенности продуцентов граммидина Bacillus brevis subsp. G.-B. и их вариантов. - Канд. дисс., 2002, М., МГУ.
8. Удалова Т.П. Особенности роста и развития Bacillus brevis var. G.-B в связи с биосинтезом грамицидина S. - Канд. дисс., 1979, М., МГУ.
9. Дербышев В.В., Глухов Н.Н., Клыков С.П., Набокова А.П., Щербаков Г.Я. Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов. - Патент РФ №2111246, 1992.

Claims (1)

  1. Способ культивирования Bacillus brevis штамм 101 для получения грамицидина С, включающий глубинное выращивание культуры на синтетической питательной среде, содержащей автолизат дрожжей и гидролизат казеина в концентрациях 0,1 г/л и 0,2 г/л по аминному азоту соответственно, отличающийся тем, что выращивание производят на среде, в которой концентрации глицерина, пищевой 40%-ной молочной кислоты, хлористого и двузамещенного фосфорно-кислого аммония, фосфорно-кислого однозамещенного калия, сернокислого 7-водного магния и лимонно-кислого натрия составляют 20 мл/л; 2,0-4,0 мл/л; 0-3,4 г/л; 0,85-4,5 г/л; 0-1,0 г/л; 0,9 г/л и 1,0 г/л соответственно, и при содержании аминного азота в исходной среде 1,3-1,6 г/л с подпиткой концентрированным питательным раствором, в состав которого входят глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорно-кислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1÷(0,008-0,032)÷(0,027-0,036)÷(0-0,008)÷(0,002-0,008), подаваемым в ферментационную среду при значениях аминного азота в культуральной жидкости ниже 1,4 г/л до достижения концентрации не более 1,75 г/л, при ограничении роста недостатком кислорода в условиях повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25·10-3 моль O2/(л·мин) до 1,0·10-3 моль О2/(л·мин), достигаемого повышением скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин, при поддержании значений рН в диапазоне 6,5-6,8 введением стерильных растворов едкого калия или натрия и при остановке процесса выращивания через 2-6 ч после начала стационарной фазы.
RU2008146193/10A 2008-11-24 2008-11-24 СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С RU2447143C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008146193/10A RU2447143C2 (ru) 2008-11-24 2008-11-24 СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008146193/10A RU2447143C2 (ru) 2008-11-24 2008-11-24 СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008146193A RU2008146193A (ru) 2010-05-27
RU2447143C2 true RU2447143C2 (ru) 2012-04-10

Family

ID=42680051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008146193/10A RU2447143C2 (ru) 2008-11-24 2008-11-24 СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2447143C2 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2627182C1 (ru) * 2016-06-01 2017-08-03 Открытое акционерное общество "Валента Фармацевтика" (ОАО "Валента Фарм") Штамм Aneurinibacillus migulanus и его применение для получения грамицидина С
EA030630B1 (ru) * 2016-06-01 2018-09-28 Акционерное Общество "Валента Фармацевтика" (Ао "Валента Фарм") Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение
RU2743396C1 (ru) * 2019-08-30 2021-02-18 Федеральное казенное предприятие "Армавирская биологическая фабрика" Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110272931A (zh) * 2019-05-31 2019-09-24 贵州医科大学 一种促进抗菌多肽短杆菌肽合成的培养基及其培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU187243A1 (ru) *
SU686463A1 (ru) * 1978-05-03 1987-04-30 МГУ им.М.В.Ломоносова Штамм @ @ 101-продуцент грамицидина @
RU2111246C1 (ru) * 1992-06-03 1998-05-20 Дербышев Виктор Викторович Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU187243A1 (ru) *
SU686463A1 (ru) * 1978-05-03 1987-04-30 МГУ им.М.В.Ломоносова Штамм @ @ 101-продуцент грамицидина @
RU2111246C1 (ru) * 1992-06-03 1998-05-20 Дербышев Виктор Викторович Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КОРШУНОВ В.В. Синтетическая среда для развития Bacillus brevis и образования граммидина. - Микробиология, 1962, т.31, №3, с.515-519. КУПЛЕТСКАЯ М.Б. Влияние аэрации на развитие и образование граммидина культурой Bacillus brevis var. G.-B. - Микробиология, 1965, т.34, №5, с.905-909. УДАЛОВА Т.П. Рост Bacillus brevis var. G.-B. и образование граммидина в зависимости от интенсивности аэрации. - Микробиология, 1972, т.41, №2, с.280-284. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2627182C1 (ru) * 2016-06-01 2017-08-03 Открытое акционерное общество "Валента Фармацевтика" (ОАО "Валента Фарм") Штамм Aneurinibacillus migulanus и его применение для получения грамицидина С
WO2017209651A1 (ru) * 2016-06-01 2017-12-07 Публичное Акционерное Общество "Валента Фармацевтика" Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение
EA030630B1 (ru) * 2016-06-01 2018-09-28 Акционерное Общество "Валента Фармацевтика" (Ао "Валента Фарм") Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение
EP3660141A1 (en) 2016-06-01 2020-06-03 Joint Stock Company "Valenta Pharmaceuticals" Method for producing and purification of gramicidin s
RU2743396C1 (ru) * 2019-08-30 2021-02-18 Федеральное казенное предприятие "Армавирская биологическая фабрика" Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах

Also Published As

Publication number Publication date
RU2008146193A (ru) 2010-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101712970B (zh) 一种发酵制备丁二酸的方法
CN102168115A (zh) 一种辅酶q10工业化生产方法
CN104487582A (zh) 通过分批添加碳源底物和碱来制备有机酸的方法
RU2447143C2 (ru) СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С
JP2008054688A (ja) アカルボースの製造のためのオスモル濃度制御発酵方法
CN103614447A (zh) 一种利用甘蔗糖蜜替代部分玉米淀粉的金霉素发酵生产方法
CN110205350A (zh) 一种基于氨氮指标调控提高维生素b12产量的方法
SK902006A3 (sk) Spôsob fermentácie polymyxínu B pomocou produkčného mikroorganizmu Bacillus polymyxa
CN106190885A (zh) 一种枯草芽孢杆菌发酵培养基及其应用
US9580738B2 (en) Method for producing extracellular proteins from genus Tepidimonas
NO161811B (no) Fremgangsmaate til fremstilling av etanol ved hjelp av fermentering i to trinn.
EP1613759B1 (en) Fermentation processes with low concentrations of carbon- and nitrogen-containing nutrients
RU2096461C1 (ru) Штамм дрожжей yarrowia lipolytica - продуцент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты
RU1314667C (ru) Способ выращивания метанолокислящих бактерий
CN108148770A (zh) 一种发酵培养基及高效表达蛋白的发酵方法
RU2743396C1 (ru) Способ получения биомассы энтеробактерий escherichia coli или salmonella в производственных биореакторах
CN112795487B (zh) 一种生产夫西地酸的发酵培养基及发酵方法
JP6391956B2 (ja) ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法
CN105506040B (zh) 一种发酵生产恩拉霉素的方法
SU912753A1 (ru) Способ получени глюкоамилазы
SU644827A1 (ru) Способ получени фосфолипазы
SU500767A3 (ru) Способ производства биомассы
SU452236A1 (ru) Способ выращивани микроорганизмов
JP6391957B2 (ja) ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法
SU615130A1 (ru) Способ получени 5- инозиновой кислоты

Legal Events

Date Code Title Description
FA92 Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted)

Effective date: 20110202

FZ9A Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal)

Effective date: 20110721

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20121125

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20130827

PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20131105

PD4A Correction of name of patent owner