CN110205350A - 一种基于氨氮指标调控提高维生素b12产量的方法 - Google Patents
一种基于氨氮指标调控提高维生素b12产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,在维生素B12发酵过程中进行阶段性分批补料,发酵前期通过补加酵母浸出汁,使氨氮在一定阶段保持一定的含量,保证菌体的生长代谢所需的氮源。本发明发酵过程中进行阶段性分批补料,发酵前期补加酵母浸出汁,控制氨氮浓度,解决了高浓度氨氮在维生素B12发酵中菌体生长和生物合成的矛盾,在发酵前期保证了菌体生长代谢所需的营养成分,促进了菌体的生长,避免了后期菌体提前衰老,代谢停滞的现象,从而提高维生素B12发酵单位。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高维生素B12产量的方法,尤其涉及一种基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法。
背景技术
自然界中的维生素B12都是微生物合成的,高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12通过菌种培养、发酵提炼而得。维生素B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞,防止恶性贫血,防止大脑神经受到破坏。
目前维生素B12的生产利用好氧粘着剑菌(Ensifer adhaerens)通过发酵提纯方式获得,发酵培养基的主要成分包括:有机氮源、碳源、甜菜碱、前体及部分无机盐和微量元素等。培养基中氮源的主要功能是构成微生物细胞和含氮的代谢产物。经过研究发现,高浓度的氨氮明显有利于菌体的生长,但高浓度的氨氮会降低维生素B12的生物合成。
现有发酵工艺仅是在基础料中添加氮源,对发酵过程的氨氮未进行有效控制。在发酵代谢过程中,随着发酵时间的延长,氨氮浓度逐渐降低,氨氮代谢有快有慢,有的罐批在发酵周期30h左右氨氮就代谢到20mg/100mL,氨氮浓度过早降低影响了后期代谢,造成菌体提前衰老,代谢停滞。在维生素B12发酵工艺控制中,对氮源的控制水平目前是一项空白。
发明内容
本发明针对现有技术问题,提供一种基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,本发明方法在发酵过程中进行阶段性分批补料,发酵前期补加酵母浸出汁,控制氨氮含量,解决了高浓度氨氮在维生素B12发酵中菌体生长和生物合成的矛盾,在发酵前期保证了菌体生长代谢所需的营养成分,促进了菌体的生长,避免了后期菌体提前衰老,代谢停滞的现象,从而提高维生素B12发酵单位。
本发明所述的技术问题是以如下技术方案解决的:
一种基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,其特征在于:在维生素B12发酵过程中进行阶段性分批补料,发酵前期通过补加酵母浸出汁,氨氮浓度控制为50-60mg/100mL,保证菌体的生长代谢所需的氮源,所述酵母浸出汁的配制为:将酵母浸粉加水溶解,配制为浓度为10%±1%的酵母浸出汁。
上述基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,所述维生素B12发酵过程包括如下步骤:
a、培养基的配制:培养基包括种子培养基和发酵培养基,所述种子培养基包括:浓度为20%±2%的麦芽糖53-55m3/m3、玉米浆25-27Kg/m3、甜菜碱3.7-3.9Kg/m3、氧化镁300-320g/m3、硫酸铵920-940g/m3、磷酸氢二铵2.4-2.6g/m3、氯化钴25-27g/m3、前体7.6-7.8g/m3、硫酸锌24-26g/m3及碳酸钙3.0-3.2Kg/m3;所述发酵培养基包括:浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素:450-470g/m3、三氯化铁:0.6-0.7Kg/m3及碳酸钙1.1-1.3Kg/m3;
b、种子培养:将培养好的菌种接种到所述种子培养基内,进行种子培养,培养条件为:罐压为0.04-0.05MPa,罐温为29-32℃,空气流量为6-8m3/h,培养周期为30-40h,移种;
c、发酵培养:将待移种的种子液接种到已灭菌待用的发酵培养基内,进行发酵培养,接种量为10%,培养条件:罐压为0.04-0.05MPa,罐温为30-33℃,空气流量为15-20m3/h,培养周期为180-200h;
d、补料:发酵过程中结合氨氮、总糖和甜菜碱的含量补加酵母浸出汁、浓度为50%±2%的葡萄糖和甜菜碱。
上述基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,所述步骤d中,补料控制标准为:补加酵母浸出汁:在发酵60h前氨氮浓度控制在50-60mg/100mL,出现氨氮浓度低于50mg/100mL,则开始补加酵母浸出汁,保证发酵培养基中的氨氮控制在50-60mg/100mL;补加浓度为50%±2%的葡萄糖和甜菜碱:发酵过程中每6h取样进行生化检测,补加浓度为50%±2%的葡萄糖和甜菜碱,保证总糖浓度控制在4.0g/100mL-5.0g/100mL,甜菜碱浓度控制在0.1%-0.2%。
上述基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,所述步骤d中,酵母浸出汁采用间接流加的方式补加,少量多次进行补加。
上述基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,所述步骤b中,移种条件为:菌体光密度值OD值在0.3以上。
本发明在维生素B12发酵过程中进行阶段性分批补料,发酵前期对氨氮浓度进行检测,采用间接流加的方式补加酵母浸出汁,保证在发酵过程中的前60h内,发酵培养基内氨氮浓度控制在50-60mg/100mL,解决了高浓度氨氮在维生素B12发酵中菌体生长和生物合成的矛盾,保证了菌体的生长代谢所需的氮源,促进了菌体生长,实现了高密度发酵,避免了后期菌体提前衰老,代谢停滞的现象,从而提高维生素B12发酵单位;发酵过程中补加葡萄糖和甜菜碱,保证菌体生长所需的营养成分。
具体实施方式
将市售的酵母浸粉加水配置为浓度为10%的酵母浸出汁,酵母浸出汁作为有机氮源,既能补充氮源,又富含有发酵代谢中所需的微量元素,对菌体生长具有积极的促进作用。氮源的主要功能是构成微生物细胞和含氮的代谢产物,而微量元素对微生物发酵起着重要的作用,是微生物发酵不可缺的营养成分。本发明在发酵过程中前60h内进行间接补加酵母浸出汁的补料工艺,不仅解决了高浓度氨氮在维生素B12发酵中菌体生长和生物合成的矛盾,在发酵前期保证了发酵培养基中含有一定的氨氮浓度,促进菌体生长,实现了高密度发酵。
下面结合具体实施来进一步阐述本发明。
实施例1
针对酵母浸出汁添加实验,进行摇瓶实验:
在300mL摇瓶中进行种子培养,装液量50mL,种子培养基为:浓度为20%±2%的麦芽糖53-55m3/m3、玉米浆25-27Kg/m3、甜菜碱3.7-3.9Kg/m3、氧化镁300-320g/m3、硫酸铵920-940g/m3、磷酸氢二铵2.4-2.6g/m3、氯化钴25-27g/m3、前体7.6-7.8g/m3、硫酸锌24-26g/m3、碳酸钙3.0-3.2Kg/m3。种子培养基pH为7.0,温度120℃-122℃,灭菌时间30min,接入2mL菌悬液,于29℃,250rpm振荡培养至种子液中菌体光密度值(OD700)达到0.3以上,移种。
在300mL摇瓶中进行发酵培养,装液量25mL,发酵培养基为浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素450-470g/m3、三氯化铁0.6-0.7Kg/m3、碳酸钙1.1-1.3Kg/m3。发酵培养基pH值为7.0,温度120℃-122℃,灭菌时间30min,按接种量为10%接入培养好的种子液,于31℃,250rpm振荡培养。在发酵过程中每个摇瓶分别在发酵30h、40h、50h补加酵母浸出汁,维持发酵培养基中在60h前氨氮控制在50mg/100mL-60mg/100mL,发酵过程中还补加浓度为50%±2%的葡萄糖和甜菜碱,培养周期为190h,定时取样检测。对比例则只补加液糖和甜菜碱,不补加酵母浸出汁。实施例和对比例分别做5个平行样,最终发酵情况见表1:
表1实施例与对比例发酵情况对比表
参看表1,补加酵母浸出液的实施例,其OD值远高于对比例,平均增长值为0.053,增加了9.3%;实施例的放瓶效价也高于对比例,效价平均增长12μg/mL。说明适当的补加酵母浸出液有利于菌体的生长,提高维生素B12产量。
实施例2
在5m3发酵罐中加入浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素450-470g/m3、三氯化铁0.6-0.7Kg/m3、碳酸钙1.1-1.3Kg/m3。发酵培养基调pH值为7.00,完成配料后,进行蒸汽灭菌,灭菌条件:压力0.10-0.13MPa,温度120℃-122℃,灭菌时间30min,灭菌结束,冷却并用无菌空气保压,等待移种。
将培养好的种子液移入发酵培养基中进行培养,接种量控制在10%。培养条件:罐压0.04-0.05MPa,罐温30℃-33℃,空气流量15-20m3/h,培养周期180h-200h。
在发酵培养过程中,结合总糖、甜菜碱含量进行补料控制。每6h取样进行生化检测,通过补加浓度为50%±2%的葡萄糖、甜菜碱进行调控,发酵过程中总糖控制在4.0g/100mL-5.0g/100mL,甜菜碱控制在0.1%-0.2%;前60h检测氨氮,通过补加酵母浸出汁进行调控。发酵过程中,前60h内氨氮控制在50mg/100mL-60mg/100mL,本批25h氨氮指标为53mg/100mL,开始补加酵母浸出汁控制氨氮。本批共补加酵母浸出汁3次,60小时时OD700值达到0.613。
发酵放瓶情况:周期:192h,OD值:0.653,发酵单位:275μg/mL。
实施例3
在5m3发酵罐中加入浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素450-470g/m3、三氯化铁0.6-0.7Kg/m3、碳酸钙1.1-1.3Kg/m3。发酵培养基调pH值为7.00,完成配料后,进行蒸汽灭菌,灭菌条件:压力0.10-0.13MPa,温度120℃-122℃,灭菌时间30min,灭菌结束,冷却并用无菌空气保压,等待移种。
将培养好的种子液移入发酵培养基中进行培养,接种量控制在10%。培养条件:罐压0.04-0.05MPa,罐温30℃-33℃,空气流量15-20m3/h,培养周期180h-200h。
在发酵培养过程中,结合总糖、甜菜碱含量进行补料控制。每6h取样进行生化检测,通过补加浓度为50%±2%的葡萄糖和甜菜碱进行调控,发酵过程中总糖控制在4.0g/100mL-5.0g/100mL,甜菜碱控制在0.1%-0.2%;前60h检测氨氮,通过补加酵母浸出汁进行调控。发酵过程中,前60h内氨氮控制在50mg/100mL-60mg/100mL,本批27h氨氮指标为50mg/100mL,开始补加酵母浸出汁控制氨氮。本批共补加酵母浸出汁4次,62小时时OD700值达到0.608。
发酵放瓶情况:周期:195h,OD值:0.660,发酵单位:278μg/mL。
实施例4
在5m3发酵罐中加入浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素450-470g/m3、三氯化铁0.6-0.7Kg/m3、碳酸钙1.1-1.3Kg/m3。发酵培养基调pH值为7.00,完成配料后,进行蒸汽灭菌,灭菌条件:压力0.10-0.13MPa,温度120℃-122℃,灭菌时间30min,灭菌结束,冷却并用无菌空气保压,等待移种。
将培养好的种子液移入发酵培养基中进行培养,接种量控制在10%。培养条件:罐压0.04-0.05MPa,罐温30℃-33℃,空气流量15-20m3/h,培养周期180h-200h。
在发酵培养过程中,结合总糖、甜菜碱含量进行补料控制。每6h取样进行生化检测,通过补加浓度为50%±2%的葡萄糖、甜菜碱进行调控,发酵过程中总糖控制在4.0g/100mL-5.0g/100mL,甜菜碱控制在0.1%-0.2%;前60h检测氨氮,通过补加酵母浸出汁进行调控。发酵过程中,前60h内氨氮控制在50mg/100mL-60mg/100mL,本批31h氨氮指标为49mg/100mL,开始补加酵母浸出汁控制氨氮。本批共补加酵母浸出汁4次,60小时时OD700值达到0.606。
发酵放瓶情况:周期:195h,OD值:0.660,发酵单位:281μg/mL。
实施例5
在5m3发酵罐中加入浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素450-470g/m3、三氯化铁0.6-0.7Kg/m3、碳酸钙1.1-1.3Kg/m3。发酵培养基调pH值为7.00,完成配料后,进行蒸汽灭菌,灭菌条件:压力0.10-0.13MPa,温度120℃-122℃,灭菌时间30min,灭菌结束,冷却并用无菌空气保压,等待移种。
将培养好的种子液移入发酵培养基中进行培养,接种量控制在10%。培养条件:罐压0.04-0.05MPa,罐温30℃-33℃,空气流量15-20m3/h,培养周期180h-200h。
在发酵培养过程中,结合总糖、甜菜碱含量进行补料控制。每6h取样进行生化检测,通过补加浓度为50%±2%的葡萄糖、甜菜碱进行调控,发酵过程中总糖控制在4.0g/100mL-5.0g/100mL,甜菜碱控制在0.1%-0.2%;前60h检测氨氮,通过补加酵母浸出汁进行调控。发酵过程中,前60h内氨氮控制在50mg/100mL-60mg/100mL,本批34h氨氮指标为50mg/100mL,开始补加酵母浸出汁控制氨氮。本批共补加酵母浸出汁3次,59小时时OD700值达到0.602。
发酵放瓶情况:周期:197h,OD值:0.653,发酵单位:276μg/mL。
实施例6
在5m3发酵罐中加入浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素450-470g/m3、三氯化铁0.6-0.7Kg/m3、碳酸钙1.1-1.3Kg/m3。发酵培养基调pH值为7.00,完成配料后,进行蒸汽灭菌,灭菌条件:压力0.10-0.13MPa,温度120℃-122℃,灭菌时间30min,灭菌结束,冷却并用无菌空气保压,等待移种。
将培养好的种子液移入发酵培养基中进行培养,接种量控制在10%。培养条件:罐压0.04-0.05MPa,罐温30℃-33℃,空气流量15-20m3/h,培养周期180h-200h。
在发酵培养过程中,结合总糖、甜菜碱含量进行补料控制。每6h取样进行生化检测,通过补加浓度为50%±2%的葡萄糖、甜菜碱进行调控,发酵过程中总糖控制在4.0g/100mL-5.0g/100mL,甜菜碱控制在0.1%-0.2%;前60h检测氨氮,通过补加酵母浸出汁进行调控。发酵过程中,前60h内氨氮控制在50mg/100mL-60mg/100mL,本批31h氨氮指标为51mg/100mL,开始补加酵母浸出汁控制氨氮。本批共补加酵母浸出汁3次,63小时时OD700值达到0.612。
发酵放瓶情况:周期:192h,OD值:0.663,发酵单位:279μg/mL。
Claims (5)
1.一种基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,其特征在于:在维生素B12发酵过程中进行阶段性分批补料,发酵前期通过补加酵母浸出汁,氨氮浓度控制为50-60 mg/100mL,保证菌体的生长代谢所需的氮源,所述酵母浸出汁的配制为:将酵母浸粉加水溶解,配制为浓度为10%±1%的酵母浸出汁。
2.根据权利要求1所述的基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,其特征在于:所述维生素B12发酵过程包括如下步骤:
a、培养基的配制:培养基包括种子培养基和发酵培养基,所述种子培养基包括:浓度为20%±2%的麦芽糖53-55m3/m3、玉米浆25-27Kg/m3、甜菜碱3.7-3.9Kg/m3、氧化镁300-320g/m3、硫酸铵920-940g/m3、磷酸氢二铵2.4-2.6 g/m3、氯化钴25-27g/m3、前体7.6-7.8g/m3、硫酸锌24-26g/m3及碳酸钙3.0-3.2Kg/m3;所述发酵培养基包括:浓度为20%±2%的麦芽糖1.0-1.2m3/m3、玉米浆0.05Kg/m3、甜菜碱11-13Kg/m3、氧化镁600-620g/m3、硫酸铵1.1-1.3Kg/m3、磷酸氢二铵600-620g/m3、氯化钴90-92g/m3、前体65-67g/m3、硫酸锌24-26g/m3、尿素:450-470g/m3、三氯化铁:0.6-0.7Kg/m3及碳酸钙1.1-1.3Kg/m3;
b、种子培养:将培养好的菌种接种到所述种子培养基内,进行种子培养,培养条件为:罐压为0.04-0.05MPa,罐温为29-32℃,空气流量为6-8m3/h,培养周期为30-40h,移种;
c、发酵培养:将待移种的种子液接种到已灭菌待用的发酵培养基内,进行发酵培养,接种量为10%,培养条件:罐压为0.04-0.05MPa,罐温为30-33℃,空气流量为15-20m3/h,培养周期为180-200h;
d、补料:发酵过程中结合氨氮、总糖和甜菜碱的含量补加酵母浸出汁、浓度为50%±2%的葡萄糖和甜菜碱。
3.根据权利要求2所述的基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,其特征在于:所述步骤d中,补料控制标准为:补加酵母浸出汁:在发酵60h前氨氮浓度控制在50-60 mg/100mL,出现氨氮浓度低于50 mg/100mL,则开始补加酵母浸出汁,保证发酵培养基中的氨氮浓度控制在50-60 mg/100mL;补加液糖和甜菜碱:发酵过程中每6h取样进行生化检测,补加浓度为50%±2%的葡萄糖和甜菜碱,保证总糖浓度控制在4.0 g/100mL-5.0g/100mL,甜菜碱浓度控制在0.1%-0.2%。
4.根据权利要求3所述的基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,其特征在于:所述步骤d中, 酵母浸出汁采用间接流加的方式补加,少量多次进行补加。
5.根据权利要求4所述的基于氨氮指标调控提高维生素B12产量的方法,其特征在于:所述步骤b中,移种条件为:菌体光密度值OD值在0.3以上。
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