CN102453740A - 脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12的培养基及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基及发酵方法及利用其生产维生素B12的方法，该培养基包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有人工糖蜜，该人工糖蜜是由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成。本发明通过采用由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成的人工糖蜜替代甜菜糖蜜，优化其培养基配方，从而解决了因甜菜糖蜜质量不稳定导致发酵效价波动范围大的问题，并获得了一种稳定、有效地生产维生素B12的方法。本发明节约了原辅料用量，降低综合成本，减少废水排放。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基及发酵方法。
背景技术
维生素B12为钴胺素类化合物，主要用于治疗恶性贫血，亦与叶酸合用用于治疗各种巨幼红细胞性贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻。还用于神经系统疾病（如神经炎、神经萎缩）的治疗等。
目前国内外商品化的维生素B12几乎都是通过微生物发酵进行生产的。其中以脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的生产原辅料主要利用甜菜糖蜜、蔗糖等碳、氮源及少量无机盐组成的培养基进行液体深层发酵，中间采用流加补料方式，再经多步提炼、精制而成。甜菜糖蜜作为维生素B12生产的主要原料，对维生素B12的正常发酵生产起着重要作用。但是，一直以来，甜菜糖蜜由于受人工种植及采收季节的影响，产品质量波动大。甜菜糖蜜生产的季节性也特别强，每年的十月至次年的三月为甜菜糖蜜的产出季节，供应量较充足，糖蜜新鲜，质量较好，剩余的6个月时间甜菜糖蜜的产出量明显不足，这严重制约着维生素B12的工业化生产；而且甜菜糖蜜因甜菜产地不同而质量差异较大，对维生素B12的发酵单位影响较大；另外，糖蜜的贮存、运输成本也较高。
因此，提供一种可替代甜菜糖蜜的原料对于稳定维生素B12工业化生产具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可替代甜菜糖蜜，质量稳定，来源不受季节限制，供应充足，实现维生素B12稳定、有效生产的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基；
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产维生素B12的发酵方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有人工糖蜜，该人工糖蜜是由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成；
上述一级种子培养基的组成为：麦芽糖2.0～2.2kg/m3，硫胺素0.007～0.008kg/m3，核黄素0.007～0.008 kg/m3，生物素0.007～0.008kg/m3，5, 6-二甲基苯并咪唑0.018～0.022 kg/m3，硫酸锌0.04～0.05 kg/m3，氧化镁0.018～0.022kg/m3，玉米浆14.0～16.0L/m3，磷酸氢二铵0.040～0.045 kg/m3，碳酸钙0.02～0.03 kg/m3和甜菜碱0.10～0.11 kg/m3；
上述二级种子培养基的组成为：麦芽糖2.6～2.7kg/m3，硫胺素0.008～0.009kg/m3，核黄素0.008～0.009 kg/m3，生物素0.008～0.009kg/m3，5, 6-二甲基苯并咪唑0.07～0.08kg/m3，硫酸锌0.005～0.006kg/m3，氧化镁0.02～0.03kg/m3，玉米浆20.0～22.0L/m3，甜菜碱0.30～0.32kg/m3，磷酸氢二铵0.04～0.05kg/m3，碳酸钙0.08～0.09kg/m3和尿素0.004～0.005 kg/m3；
上述发酵培养基的组成为：麦芽糖4.2～4.3kg/m3，硫胺素0.013～0.015kg/m3，核黄素0.013～0.015 kg/m3，生物素0.013～0.015 kg/m3，5, 6-二甲基苯并咪唑0.09～0.10kg/m3，甘油磷酸0.50～0.55kg/m3，硫酸锌0.005～0.006 kg/m3，氯化钴0.0001～0.0002kg/m3，玉米浆30.0～32.0L/m3，碳酸钙0.07～0.08kg/m3，尿素0.01～0.02kg/m3，磷酸氢二铵0.04～0.06 kg/m3，甜菜碱2.4～2.6kg/m3和氧化镁0.04～0.06kg/m3；
一种利用上述培养基的发酵方法，其工艺步骤包括：
1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子接入其中进行培养，接种量控制在培养基体积的5－10％；培养条件为：罐压0.04～0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量3～8m3/h；培养时间20～30小时；
2）二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养；培养条件为：罐压0.04～0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量3～8m3/h；培养时间60～80小时；
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养；培养条件为：罐压0.05～0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量10～15m3/h；培养时间约为160～200小时，在发酵过程中，当总糖含量低于7%时进行补料，补料时加入人工糖蜜，维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
本发明是基于下面阐述的甜菜糖蜜影响维生素B12发酵效价的因素而设计的：
1）甜菜糖蜜中的粗蛋白主要是由氨、酰胺及硝酸盐等组成。当粗蛋白含量过高超过4%以上时，会促使菌体细胞加速生长，减少了代谢产物的合成。
2）甜菜糖蜜中的氨基酸是维生素B12发酵过程中非必需的氨基酸，因此其蛋白质对合成维生素B12生物学价值较低。
3）甜菜糖蜜中的胶体主要为木糖胶、阿拉伯糖胶和果胶等，不是维生素B12发酵过程中所需的有用物质。
4）甜菜糖蜜所含糖类主要是蔗糖，是维生素B12发酵中的基础碳源，是构成菌体细胞和代谢产物的主要营养元素。甜菜糖蜜中合理的总糖含量是决定维生素B12效价的关键因素之一。目前，国内市场购买的甜菜糖蜜中总糖的含量偏低。
5）甜菜糖蜜的生产厂家为了保证其微生物含量控制在一定的范围内，通常加入防腐剂。该防腐剂能够抑制脱氮假单胞菌的菌体生长。
故而，本发明通过采用由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成的人工糖蜜替代甜菜糖蜜，优化其培养基配方，从而解决了因甜菜糖蜜质量不稳定导致发酵效价波动范围大的问题，并获得了一种稳定、有效地生产维生素B12的方法。其发酵单位达到180mg/L，而采用甜菜糖蜜，其它原辅料配伍比例不变，维生素B12的发酵单位为仅为140～160mg/L。本发明节约了原辅料用量，降低综合成本，减少废水排放。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例为脱氮假单胞杆菌母瓶种子采用目前常规的培养方法。
实施例1
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖2.0kg、硫胺素7g、核黄素7g、生物素7g）、玉米浆14L、氧化镁18g、5, 6-二甲基苯并咪唑18g、磷酸氢二铵40g、硫酸锌4g、碳酸钙20g，甜菜碱100g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖26kg、硫胺素80g、核黄素80g、生物素80g）、玉米浆200L、甜菜碱3kg、氧化镁200g、磷酸氢二铵400g、硫酸锌50g、碳酸钙800g、5, 6-二甲基苯并咪唑700g、尿素40g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖420kg、硫胺素1.3kg、核黄素1.3kg、生物素1.3kg）、玉米浆3000L、5, 6-二甲基苯并咪唑9kg、磷酸氢二铵40kg、硫酸锌500g、碳酸钙7kg、甘油磷酸50kg、氧化镁4kg、氯化钴100kg、尿素1kg，甜菜碱240kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（无杂菌，OD为0.198，摇瓶效价234mg/L）的脱氮假单胞菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的5.4%,罐压控制在0.04－0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量：6m3/h；培养时间约为24.7小时。种子培养基OD：0.210；pH：7.3。
二级种子培养过程控制：符合移种条件（无杂菌，OD为0.210）的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件：罐压0.04－0.05MPa；罐温29～32℃；空气流量：7m3/h；培养时间71.4h。种子培养基OD：0.394；pH：7.2。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件（无杂菌，OD为0.394）的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件：罐压控制在0.05－0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量：14.3 m3/h；培养时间为185.4h。
补料控制：发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜（麦芽糖2.6～2.7 kg/m3，硫胺素0.008～0.009kg/m3，核黄素0.008～0.009kg/m3，生物素0.008～0.009 kg/m3）。发酵过程中每隔6～7h检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
发酵结束，维生素B12发酵单位为183mg/L。
实施例2
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖2.1kg、硫胺素7.5g、核黄素7.5g、生物素7.5g）、玉米浆15L、氧化镁20g、5, 6-二甲基苯并咪唑20g、磷酸氢二铵42g、硫酸锌4.5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖26.5kg、硫胺素85g、核黄素85g、生物素85g）、玉米浆210L、甜菜碱3.1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5, 6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖425kg、硫胺素1.4kg、核黄素1.4kg、生物素1.4kg）、玉米浆3100L、5, 6-二甲基苯并咪唑9.5kg、磷酸氢二铵41kg、硫酸锌550g、碳酸钙7.5kg、甘油磷酸52kg、氧化镁5kg、氯化钴150kg、尿素1.5kg，甜菜碱250kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（无杂菌，OD为0.214，摇瓶效价236mg/L）的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的5.8%,罐压控制在0.04－0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量：6m3/h；培养时间约为24.2小时。种子培养基OD：0.283；pH：7.2。
二级种子培养过程控制：符合移种条件（无杂菌，OD为0.283）的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件：罐压0.04－0.05MPa；罐温29～32℃；空气流量：7m3/h；培养时间71.7h。种子培养基OD：0.421；pH：7.3。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件（无杂菌，OD为0.421）的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件：罐压控制在0.05－0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量：14.5m3/h；培养时间为178.6h。
补料控制：发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜（麦芽糖2.6～2.7 kg/m3，硫胺素0.008～0.009kg/m3，核黄素0.008～0.009kg/m3，生物素0.008～0.009kg/m3）。发酵过程中每隔6～7h检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
发酵结束，维生素B12发酵单位为196mg/L。
实施例3
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖2.2kg、硫胺素8g、核黄素8g、生物素8g）、玉米浆16L、氧化镁22g、5, 6-二甲基苯并咪唑22g、磷酸氢二铵45g、硫酸锌5g、碳酸钙30g，甜菜碱110g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖27kg、硫胺素90g、核黄素90g、生物素90g）、玉米浆220L、甜菜碱3.2kg、氧化镁300g、磷酸氢二铵500g、硫酸锌60g、碳酸钙900g、5, 6-二甲基苯并咪唑800g、尿素50g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖430kg、硫胺素1.5kg、核黄素1.5kg、生物素1.5kg）、玉米浆3200L、5, 6-二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氢二铵42kg、硫酸锌600g、碳酸钙8kg、甘油磷酸55kg、氧化镁6kg、氯化钴200kg、尿素2kg，甜菜碱260kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（无杂菌，OD为0.205，摇瓶效价231mg/L）的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6.1%,罐压控制在0.04－0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量：6m3/h；培养时间约为25小时。种子培养基OD：0.225；pH：7.3。
二级种子培养过程控制：符合移种条件（无杂菌，OD为0.433）的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件：罐压0.04－0.05MPa；罐温29～32℃；空气流量：7m3/h；培养时间71.4h。种子培养基OD：0.278；pH：7.4。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件（无杂菌，OD为0.433）的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件：罐压控制在0.05－0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量：14.8 m3/h；培养时间为181h。
补料控制：发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜（麦芽糖2.6～2.7，硫胺素0.008～0.009，核黄素0.008～0.009，生物素0.008～0.009）。发酵过程中每隔6～7h检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
发酵结束，维生素B12发酵单位为185mg/L。
实施例4
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖2.1kg、硫胺素7.5g、核黄素7.5g、生物素7.5g）、玉米浆15L、氧化镁20g、5, 6-二甲基苯并咪唑20g、磷酸氢二铵42g、硫酸锌4.5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖26.5kg、硫胺素85g、核黄素85g、生物素85g）、玉米浆210L、甜菜碱3.1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5, 6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖425kg、硫胺素1.4kg、核黄素1.4kg、生物素1.4kg）、玉米浆3100L、5, 6-二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氢二铵41kg、硫酸锌550g、碳酸钙7.4kg、甘油磷酸53kg、氧化镁5.5kg、氯化钴140kg、尿素1.5kg，甜菜碱260kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间37分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（无杂菌，OD为0.216，摇瓶效价234mg/L）的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6.2 %,罐压控制在0.04－0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量：6.2m3/h；培养时间约为24.6小时。种子培养基OD：0.290；pH：7.3。
二级种子培养过程控制：符合移种条件（无杂菌，OD为0.290）的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件：罐压0.04－0.05MPa；罐温29～32℃；空气流量：7.2m3/h；培养时间70.8h。种子培养基OD：0.417；pH：7.4。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件（无杂菌，OD为0.417）的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件：罐压控制在0.05－0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量：14.1m3/h；培养时间为177h。
补料控制：发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜（麦芽糖2.6～2.7 kg/m3，硫胺素0.008～0.009 kg/m3，核黄素0.008～0.009 kg/m3，生物素0.008～0.009 kg/m3）。发酵过程中每隔6～7h检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
发酵结束，维生素B12发酵单位为198mg/L。
实例5
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖2.1kg、硫胺素7.5g、核黄素7.5g、生物素7.5g）、玉米浆15L、氧化镁20g、5, 6-二甲基苯并咪唑20g、磷酸氢二铵42g、硫酸锌4.5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖26.5kg、硫胺素85g、核黄素85g、生物素85g）、玉米浆210L、甜菜碱3.1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5, 6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖420kg、硫胺素1.3kg、核黄素1.3kg、生物素1.3kg）、玉米浆3000L、5, 6-二甲基苯并咪唑9kg、磷酸氢二铵40kg、硫酸锌500g、碳酸钙7kg、甘油磷酸50kg、氧化镁4kg、氯化钴100kg、尿素1kg，甜菜碱240kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（无杂菌，OD为0.212，摇瓶效价233mg/L）的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6.1%,罐压控制在0.04－0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量：6.2m3/h；培养时间约为24.8小时。种子培养基OD：0.292；pH：7.3。
二级种子培养过程控制：符合移种条件（无杂菌，OD为0.292）的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件：罐压0.04－0.05MPa；罐温29～32℃；空气流量：7.1m3/h；培养时间71.2h。种子培养基OD：0.418；pH：7.4。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件（无杂菌，OD为0.418）的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件：罐压控制在0.05－0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量：14m3/h；培养时间为178.1h。
补料控制：发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜（麦芽糖2.6～2.7，硫胺素0.008～0.009kg/m3，核黄素0.008～0.009 kg/m3，生物素0.008～0.009 kg/m3）。发酵过程中每隔6～7h检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
发酵结束，维生素B12发酵单位为183mg/L。
实例6
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖2.1kg、硫胺素7.6g、核黄素7.5g、生物素7.6g）、玉米浆15.8L、氧化镁21g、5, 6-二甲基苯并咪唑22g、磷酸氢二铵42.3g、硫酸锌4.4g、碳酸钙26g，甜菜碱106g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖26.6kg、硫胺素86g、核黄素85g、生物素85g）、玉米浆211.4L、甜菜碱3.1kg、氧化镁251g、磷酸氢二铵452g、硫酸锌55g、碳酸钙851g、5, 6-二甲基苯并咪唑759g、尿素46g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入人工糖蜜（其中麦芽糖430kg、硫胺素1.5kg、核黄素1.5kg、生物素1.5kg）、玉米浆3200L、5, 6-二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氢二铵42kg、硫酸锌600g、碳酸钙8kg、甘油磷酸55kg、氧化镁6kg、氯化钴200kg、尿素2kg，甜菜碱260kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间37分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（无杂菌，OD为0.214，摇瓶效价233mg/L）的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6.3 %,罐压控制在0.04－0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量：6.4m3/h；培养时间约为24.7小时。种子培养基OD：0.296；pH：7.2。
二级种子培养过程控制：符合移种条件（无杂菌，OD为0.296）的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件：罐压0.04－0.05MPa；罐温29～32℃；空气流量：7.4m3/h；培养时间70.7h。种子培养基OD：0.409；pH：7.3。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件（无杂菌，OD为0.409）的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件：罐压控制在0.05－0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量：14.2m3/h；培养时间为178.6h。
补料控制：发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜（麦芽糖2.6～2.7，硫胺素0.008～0.009kg/m3，核黄素0.008～0.009kg/m3，生物素0.008～0.009 kg/m3）。发酵过程中每隔6～7h检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
发酵结束，维生素B12发酵单位为189mg/L。
对比实例 以甜菜糖蜜工艺为培养基配方，用脱氮假单胞杆菌发酵生产维生素B12
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入甜菜糖蜜3.4kg，玉米浆15L、氧化镁20g、5, 6-二甲基苯并咪唑20g、磷酸氢二铵42g、硫酸锌4.5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入甜菜糖蜜42kg、玉米浆210L、甜菜碱3.1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5, 6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～124℃；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入甜菜糖蜜680kg、玉米浆3000L、5, 6-二甲基苯并咪唑9kg、磷酸氢二铵40kg、硫酸锌500g、碳酸钙7kg、甘油磷酸50kg、氧化镁4kg、氯化钴100kg、尿素1kg，甜菜碱240kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（无杂菌，OD为0.211，摇瓶效价234mg/L）的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6.2%,罐压控制在0.04－0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量：6.3m3/h；培养时间约为27.2小时。种子培养基OD：0.186；pH：7.1。
二级种子培养过程控制：符合移种条件（无杂菌，OD为0.186）的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件：罐压0.04－0.05MPa；罐温29～32℃；空气流量：7.3m3/h；培养时间74.7h。种子培养基OD：0.313；pH：7.2。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件（无杂菌，OD为0.313）的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件：罐压控制在0.05－0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量：14m3/h；培养时间为189.3h。
补料控制：发酵过程中进行补料，补料时加入甜菜糖蜜。发酵过程中每隔6～7h检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
发酵结束，维生素B12发酵单位为163mg/L。
Claims (9)
1.一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有人工糖蜜，该人工糖蜜是由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成。
2.按照权利要求1所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，其特征在于上述一级种子培养基的组成为：麦芽糖2.0～2.2kg/m3，硫胺素0.007～0.008kg/m3，核黄素0.007～0.008 kg/m3，生物素0.007～0.008kg/m3，5, 6-二甲基苯并咪唑0.018～0.022 kg/m3，硫酸锌0.04～0.05 kg/m3，氧化镁0.018～0.022kg/m3，玉米浆14.0～16.0L/m3，磷酸氢二铵0.040～0.045 kg/m3，碳酸钙0.02～0.03 kg/m3和甜菜碱0.10～0.11 kg/m3。
3.按照权利要求1所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，其特征在于上述二级种子培养基的组成为：麦芽糖2.6～2.7kg/m3，硫胺素0.008～0.009kg/m3，核黄素0.008～0.009 kg/m3，生物素0.008～0.009kg/m3，5, 6-二甲基苯并咪唑0.07～0.08kg/m3，硫酸锌0.005～0.006kg/m3，氧化镁0.02～0.03kg/m3，玉米浆20.0～22.0L/m3，甜菜碱0.30～0.32kg/m3，磷酸氢二铵0.04～0.05kg/m3，碳酸钙0.08～0.09kg/m3和尿素0.004～0.005 kg/m3。
4.按照权利要求1所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，其特征在于上述发酵培养基的组成为：麦芽糖4.2～4.3kg/m3，硫胺素0.013～0.015kg/m3，核黄素0.013～0.015 kg/m3，生物素0.013～0.015 kg/m3，5, 6-二甲基苯并咪唑0.09～0.10kg/m3，甘油磷酸0.50～0.55kg/m3，硫酸锌0.005～0.006 kg/m3，氯化钴0.0001～0.0002kg/m3，玉米浆30.0～32.0L/m3，碳酸钙0.07～0.08kg/m3，尿素0.01～0.02kg/m3，磷酸氢二铵0.04～0.06 kg/m3，甜菜碱2.4～2.6kg/m3和氧化镁0.04～0.06kg/m3。
5.一种利用权利要求1至4任意一项培养基的发酵方法，其工艺步骤包括：
1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子接入其中进行培养，接种量控制在培养基体积的5－10％；
2）二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。
6.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养条件为：罐压0.04～0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量3～8m3/h；培养时间20～30小时。
7.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述二级种子培养条件为：罐压0.04～0.05MPa；罐温29～33℃；空气流量3～8m3/h；培养时间60～80小时。
8.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为：罐压0.05～0.06MPa；罐温30～33℃；空气流量10～15m3/h；培养时间约为160～200小时。
9.按照权利要求8所述的发酵方法，其特征是：在发酵过程中，当总糖含量低于7%时进行补料，补料时加入人工糖蜜，维持发酵液总糖含量控制在7～7.5%。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103642886A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-19 | 宁夏泰瑞制药股份有限公司 | 一种利用金色链霉菌发酵生产去甲基金霉素的培养基和培养方法 |
| CN108913739A (zh) * | 2018-08-04 | 2018-11-30 | 广济药业（孟州）有限公司 | 一种基于pH值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素B12的方法 |
| CN108949845A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-07 | 福建康鸿生物科技有限公司 | 一种发酵培养基及由发酵培养基制备莫匹罗星的方法 |
| CN109207469A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-01-15 | 山东泓达生物科技有限公司 | 一种高产维生素b12的突变菌株制备方法 |
| CN109321614A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-02-12 | 山东泓达生物科技有限公司 | 一种促维生素b12发酵的组合物及其应用 |
| CN109837320A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-06-04 | 山东泓达生物科技有限公司 | 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素b12的方法 |
| CN110205350A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-09-06 | 河北华荣制药有限公司 | 一种基于氨氮指标调控提高维生素b12产量的方法 |
| CN111073922A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-28 | 湖北广济药业股份有限公司 | 一种维生素b12发酵补料培养基及补料方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003012058A2 (en) * | 2001-08-02 | 2003-02-13 | North Carolina State University | Media and methods for cultivation of microorganisms |
| CN101748177A (zh) * | 2008-12-09 | 2010-06-23 | 华东理工大学 | 优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12方法与合成培养基 |
-
2011
- 2011-12-15 CN CN2011104198380A patent/CN102453740B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003012058A2 (en) * | 2001-08-02 | 2003-02-13 | North Carolina State University | Media and methods for cultivation of microorganisms |
| CN101748177A (zh) * | 2008-12-09 | 2010-06-23 | 华东理工大学 | 优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12方法与合成培养基 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李昆太等: "甜菜碱促进脱氮假单胞菌合成维生素B12", 《甜菜碱促进脱氮假单胞菌合成维生素B12》 * |
| 马蕙等: "维生素B12的生物合成、发酵生产与应用", 《生物工程学报》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103642886A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-19 | 宁夏泰瑞制药股份有限公司 | 一种利用金色链霉菌发酵生产去甲基金霉素的培养基和培养方法 |
| CN108913739A (zh) * | 2018-08-04 | 2018-11-30 | 广济药业（孟州）有限公司 | 一种基于pH值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素B12的方法 |
| CN108949845A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-07 | 福建康鸿生物科技有限公司 | 一种发酵培养基及由发酵培养基制备莫匹罗星的方法 |
| CN108949845B (zh) * | 2018-08-08 | 2021-08-10 | 福建康鸿生物科技有限公司 | 一种发酵培养基及由发酵培养基制备莫匹罗星的方法 |
| CN109207469A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-01-15 | 山东泓达生物科技有限公司 | 一种高产维生素b12的突变菌株制备方法 |
| CN109321614A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-02-12 | 山东泓达生物科技有限公司 | 一种促维生素b12发酵的组合物及其应用 |
| CN109837320A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-06-04 | 山东泓达生物科技有限公司 | 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素b12的方法 |
| CN110205350A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-09-06 | 河北华荣制药有限公司 | 一种基于氨氮指标调控提高维生素b12产量的方法 |
| CN111073922A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-28 | 湖北广济药业股份有限公司 | 一种维生素b12发酵补料培养基及补料方法 |
| CN111073922B (zh) * | 2019-12-26 | 2023-04-07 | 湖北广济药业股份有限公司 | 一种维生素b12发酵补料培养基及补料方法 |
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