CN105861587B - 微生物发酵法高效生产l‑色氨酸的方法 - Google Patents

微生物发酵法高效生产l‑色氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵法高效生产L‑色氨酸的工艺方法，包括以下步骤：（1）、培养成熟的大肠埃希氏菌JLTrp菌种；（2）、发酵罐培养：将成熟菌种接种至发酵罐内，在温度34‑36℃，pH采用补充液氨分段控制，0‑18h7.0‑7.2，18h‑放罐6.4‑6.8，溶氧分段控制，0‑18h10‑25%，18h‑放罐15‑40%，压力0.03‑0.08MPa，风量0.3VVM‑2.0VVM，过程中残糖控制0.01‑0.5%下培养制取L‑色氨酸：本发明针对培养基成分及培养条件佳，并且对发酵过程残糖浓度控制、温度控制、pH 与溶解氧分段控制，使发酵周期缩短，发酵产量提高，工艺简单易控制，成本较低，适合大规模工业应用。

Description

微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法。
背景技术
色氨酸又名α-氨基-β-吲哚丙酸，它有D-型和L-型两种异构体，天然存在的只有L-色氨酸。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，学名：β-吲哚基丙氨酸；英文名Tryptophan，分子式C11H12N2O2,相对分子量204.21，熔点289℃。L-色氨酸为白色或微黄色结晶或结晶性粉体，无臭味微苦。在水中微溶，在乙醇中极微溶解。它广泛存在于天然蛋白质中。L-色氨酸对人体和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，被广泛用于医药和食品、饲料等领域。近年来，随着色氨酸在医药、食品和饲料等方面的应用，其市场需求量在不断增加。
L-色氨酸的生产方法包括化学合成法、蛋白质水解法、酶促转化法和发酵法。由于化学合成法和蛋白质水解法需要大量的有机溶剂，存在原料来源和环境污染等问题，在生产中极少使用。酶促转化法成本较高，污染量大。微生物发酵法生产L-色氨酸具有产率高、周期短、控制容易等优点。发酵法大体可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。近年来还出现直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸的相关报道。另外，重组DNA技术在微生物育种和工业上的应用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。随着L-色氨酸市场需求激增，越来越多的研究者和科研机构开始对L-色氨酸发酵进行全面的研究。然而，随着粮食价格的普遍上涨和国家对用粮食作物用于规模生产进行调控，使之成为影响L-色氨酸发酵的主要因素，因此寻求粮食替代品，从而降低生产成本成为新的研究目标。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法。
微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、培养成熟的菌种：先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟菌种：培养温度34-36℃，pH6.8-7.2，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
（2）、发酵罐培养：先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行实罐灭菌，实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤（1）得到的成熟菌种接种至发酵罐内，在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸：培养温度34-36℃，pH采用补充液氨分段控制，0-18h7.0-7.2，18h-放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%；
所述菌种为大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCC NO. 7.217，保藏日期为2016年5月8号。
作为本发明微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法的进一步优化：步骤（1）中所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.8%、KCl 0.05-0.3%、MgSO4 0.08-0.45%、(NH4)2SO4 0.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、 FeSO4 0.00014-0.00042%、MnSO4 0.00006-0.00036%、维生素B1 0.000065-0.00039%和生物素0.00001-0.00012%，其余为水。
作为本发明微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法的进一步优化：步骤（2）中所述液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO40.12-0.8%、KCL 0.12-0.8%、MgSO4 0.05-0.5%、(NH4)2SO4 0.08-0.48%、柠檬酸0.05-0.5%、FeSO4 0.001-0.1%、Na2SO4 0.0005-0.006%、MnSO4 0.00015-0.0009%、CuSO4 0.00002-0.00018%、CoCl2 0.00014-0.00135%和ZnSO4 0.0001-0.0018%，其余为水。
作为本发明微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法的进一步优化：所述空罐灭菌的具体操作为：罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.11-0.12MPa，温度121-123℃，时间为45-60min。
作为本发明微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法的进一步优化：所述实罐灭菌的具体操作为：开列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.11-0.12MPa，温度121-123℃，时间为10-30min。
作为本发明微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法的进一步优化：所述步骤（1）中接种的具体操作为：采用压差法进行接种，调pH至6.9，温度35℃，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa ，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上。
作为本发明微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法的进一步优化：所述步骤（2）中接种的具体操作为：调pH至6.9，温度35℃，压力0.06MPa，将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内。
作为本发明微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法的进一步优化：所述步骤（1）中接种用菌液的制备方法为：取已经菌种生长饱满的茄型瓶，用生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
有益效果
一、申请人针对目前发酵方法中的不足，在天津科技大学、中国氨基酸技术服务中心的帮助指导下，根据大肠埃希氏菌JLTrp的特点，从培养基成分及培养条件出发，通过将磷酸氢二钾用廉价的磷酸氢二铵和氯化钾进行替代，并选择合适的用量，缓解了磷过量时细胞对葡萄糖的利用速率增加，胞内DNA、RNA和蛋白质的量增加，呼吸速率上升，次级代谢物的合成受阻，或使进行中的次级代谢中止的情况，并增加呼吸链中酶的活性；
二、本发明采用大肠埃希氏菌JLTrp的特性进行发酵，在本发明中的工艺和培养基等条件的协同作用下，且发酵过程中对残糖浓度进行控制、温度控制、pH与溶解氧分段控制，使发酵周期缩短，发酵产量提高，工艺简单易控制，成本较低，非常适合大规模工业应用，并且，通过pH 与溶解氧分段控制，人为的区分了菌体生长期及产酸期，使得菌体生长期菌体生长健壮，为后续产酸提供了保障，从而使发酵周期由原来的 50小时缩短至30-35小时，产酸水平由20-25g/L提高到45-50g/L，转化率由12-15%提高到20-25%，效果十分显著，生产稳定；在工业生产中取得了较大的进步，具有较好的应用前景。
生物材料的保藏
大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏日期为2016年5月8号，保藏单位及其简称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCC No. 7.217。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、培养成熟的菌种
菌液的制备：取已经菌种生长饱满的茄型瓶，将生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
所述菌种为大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCC NO. 7.217，保藏日期为2016年5月8号。
成熟的种子的培养：
a、空罐灭菌：种子培养罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min;
b、实罐灭菌：将液体种子培养基用泵泵入种子培养罐中，将种子培养罐的列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水;
d、接种：采用压差法进行接种，调pH6.9，温度35℃，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa ，此时种液在压差下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火焰灼烧约1min；
e、培养：培养温度36℃，pH通过补充液氨自动控制7.0，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基的各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
（2）、发酵罐培养
a、空罐灭菌：发酵罐罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min；
b、实罐灭菌：将液体发酵培养基用泵泵入种子培养罐中，将发酵罐的列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水；
d、接种：将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内；
e、培养：培养温度36℃，pH采用补充液氨自动控制6.4-6.8，溶氧分段控制20-25%，压力0.03-0.05MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%。
使用的培养基为液体发酵培养基，各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.8%、KCL 0.28%、MgSO4 0.2%、(NH4)2SO4 0.16%、柠檬酸0.2%、 FeSO40.00756%、Na2SO4 0.002%、MnSO4 0.00045%、CuSO4 0.00006%、CoCl2 0.00045%、ZnSO40.00064%，其余为水。
通过该种方式培养，发酵周期为33h，产L-色氨酸率3.78%，转化率18.2%。
实施例2
微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、培养成熟的菌种
菌液的制备：取瓶内大肠埃希氏菌JLTrp生长饱满的茄型瓶，将生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
成熟的种子的培养：
a、空罐灭菌：罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min;
b、实罐灭菌：将液体种子培养基充分溶解后用泵泵入种子培养罐中，开列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水;
d、接种：采用压差法进行接种，调pH6.9，温度35℃，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa ，此时种液在压差下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火焰灼烧约1min；
e、培养：培养温度36℃，pH通过补充液氨自动控制7.0，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
（2）、发酵罐培养
a、空罐灭菌：罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min;
b、实罐灭菌：将液体种子培养基用泵泵入种子培养罐中，开列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水；
d、接种：将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内；
e、培养：培养温度35℃，pH采用补充液氨自动分段控制，0-18h7.0-7.2，18h-放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%。
使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基各成份的质量百分比含量为：葡萄糖1%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.6%、KCL 0.4%、MgSO4 0.2%、(NH4)2SO4 0.16%、柠檬酸0.2%、 FeSO4 0.00756%、Na2SO4 0.002%、MnSO4 0.00045%、CuSO4 0.00006%、CoCl20.00045%、ZnSO4 0.00064%，其余为水。
通过该种方式培养，发酵周期为32h，产L-色氨酸率4.25%，转化率19.5%。
实施例3
微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、培养成熟的菌种
菌液的制备：取瓶内大肠埃希氏菌JLTrp已经生长饱满的茄型瓶，将生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
成熟的种子的培养：
a、空罐灭菌：罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min;
b、实罐灭菌：将液体种子培养基用泵泵入种子培养罐中，开列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水;
d、接种：采用压差法进行接种，调pH6.9，温度35℃，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa ，此时种液在压差下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火焰灼烧约1min；
e、培养：培养温度36℃，pH通过补充液氨自动控制7.0，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
（2）、发酵罐培养
a、空罐灭菌：罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min;
b、实罐灭菌：将液体种子培养基用泵泵入种子培养罐中，开列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水；
d、接种：将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内；
e、培养：培养温度35℃，pH采用补充液氨自动分段控制，0-18h7.0-7.2，18h-放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%。
使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.4%、KCL 0.6%、MgSO4 0.2%、(NH4)2SO4 0.16%、柠檬酸0.2%、 FeSO4 0.00756%、Na2SO4 0.002%、MnSO4 0.00045%、CuSO4 0.00006%、CoCl20.00045%、ZnSO4 0.00064%，其余为水。
通过该种方式培养，发酵周期为31.5h，产L-色氨酸率4.55%，转化率20.9%。
实施例4
微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、培养成熟的菌种
菌液的制备：取瓶内菌种已经生长饱满的茄型瓶，将生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
所述菌种为大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCC NO. 7.217，保藏日期为2016年5月8号。
成熟的种子的培养：
a、空罐灭菌：罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min;
b、实罐灭菌：将液体种子培养基用泵泵入种子培养罐中，开列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水;
d、接种：采用压差法进行接种，调pH6.9，温度35℃，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa ，此时种液在压差下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火焰灼烧约1min；
e、培养：培养温度36℃，pH通过补充液氨自动控制7.0，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%和生物素0.00003%，其余为水。
（2）、发酵罐培养
a、空罐灭菌：罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为45min;
b、实罐灭菌：将液体种子培养基用泵泵入种子培养罐中，开列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min；
c、降温冷却：灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36℃，关闭列管冷却水；
d、接种：将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内；
e、培养：培养温度35℃，pH采用补充液氨自动分段控制，0-18h7.0-7.2，18h-放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%。
使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.4%、KCL 0.6%、MgSO4 0.2%、(NH4)2SO4 0.16%、柠檬酸0.2%、 FeSO4 0.00756%、Na2SO4 0.002%、MnSO4 0.00045%、CuSO4 0.00006%、CoCl20.00045%和ZnSO4 0.00064%，其余为水。
通过该种方式培养，发酵周期为31h，产L-色氨酸率4.75%，转化率23.5%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
本发明中所述大肠埃希氏菌JLTrp的筛选方法如下：
菌悬液的制备：菌体培养，取斜面菌种一环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，36℃振荡培养（120rpm）16-18h取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，36℃振荡培养（120rpm）6-8h细胞菌悬液的制备，取10ml培养液，3500r/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。
所述大肠杆菌出发菌株为氨基酸技术服务中心受让的大肠杆菌，名称为：Escherichia coli K-12 W3110变种。
2、紫外诱变：取10ml菌液于Ф90mm的培养皿中（带有磁棒），将培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌器上；开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖分别照射30s。
3、紫外诱变处理液在含有β-内酰胺类抗生素平板上的选择性生长。β-内酰胺类抗生素优选青霉素、苯唑西林、万古霉素。抗生素浓度为100μg/ml。
选择生长良好的菌种进行培养，制备菌悬液进行硫酸二乙酯（DES）化学诱变。
4、硫酸二乙酯（DES）化学诱变：配制硫酸二乙酯溶液，浓度为处理浓度的2倍与等体积的菌悬液混合诱变结束时加入，过滤灭菌后的硫代硫酸钠中止反应。
5、经硫酸二乙酯（DES）化学诱变后的处理液在含有大环内酯类抗生素平板上的选择性生长。大环内酯类抗生素优选罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福平。抗生素浓度为100μg/ml。选择生长良好的菌种进行培养。
6、抗生素抗性的鉴定
将待测菌种斜面一环接于5ml生理盐水中，充分混匀， 3500r/min离心10min，收集菌体，将菌体充分悬浮于5ml生理盐水中；
取1ml菌悬液于平皿中，倾入约15ml熔化并冷却至45-50℃的基本培养基，摇匀，待凝固后即为待测平板；
将待测平板底背面划分为七个区域，在培养基表面分别贴上蘸有青霉素、苯唑西林、万古霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福平的滤纸片，观察滤纸片周围菌落的生长情况；
36℃培养24h后显示，除罗红霉素周围无菌落生长外，其他集中均有菌落生长，表明该菌种对青霉素、苯唑西林、万古霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福平均有耐药性；
对该菌种进行传代保藏，命名为大肠埃希氏菌JLTrp，保藏于中国科学院微生物研究所。该菌种其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其CGMCC保藏号登记号为：7.217，保藏日期为2016年5月8号。
以上所述的发酵罐培养基配方为：葡萄糖 0.75%，酵母粉 0.05%，磷酸氢二钾0.75%，硫酸镁 0.2%，硫酸铵 0.16%，柠檬酸0.2%，硫酸亚铁0.01%，生物素0.005%，硫酸锰0.025%，硫酸锌0.0013%。
培养条件为：温度36℃，pH7.0-7.2，压力0.05MPa，通风比0.3-0.8VVM。
中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌JLTrp进行了形态、生理形态、16RS基因，以及Antibiotics sensitivity检测，检测报告号：NO.(2015）IMCAS 449；结果显示：
大肠埃希氏菌JLTrp完整的16srDNA序列（其基因序列如SEQ NO.1所示）进行NCBIblast分析，比对结果与大肠埃希氏菌有100%的相似性。序列比对的结果结合形态和生理生化特征，表明属于菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。
大肠埃希氏菌JLTrp的抗生素抗性检测及检测结果：
本发明所筛选出的大肠埃希氏菌JLTrp，经K-B法实验检测对30种抗生素的敏感性，其中对测试的21种抗生素表现为敏感或中度敏感，具体内容参见表1；
表1：
本发明相关对比实验：
分两组进行实验：B组：采用本发明中的工艺，将大肠埃希氏菌JLTrp作为菌种进行发酵生产L-色氨酸；A组采用常规工艺，将大肠杆菌Escherichia coli K-12 W3110变种 作为菌种进行发酵生产L-色氨酸；发酵结束后，计算产酸率和糖转发率；具体计算方法为；产酸率=发酵液中总酸量/发酵液体积；糖酸转化率=（发酵液体积L*产酸量g/L）/发酵总耗糖量g。结果如表2所示：
表2：
实验结果显示，本发明中的工艺方法普通的工艺相比较其产酸率和糖酸转化率均有大幅度的提高，具有显著的进步，更适合于工艺生产。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南巨龙生物工程股份有限公司
<120> 微生物发酵法高效生产L-色氨酸的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1374
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）
<400> 1
aagctaccta cttcttttgc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgtgg cattctgatc cacattacta gcgattccga cttcatggag 120
tcgagttgca gactccaatc cggactacga cgcactttat gaggtccgct tgctctcgcg 180
aggtcgcttc tctttgtatg cgccattgta gcacgtgtgt agccctgtcg taagggccat 240
gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc agtttatcac tggcagtctc ctttgagttc 300
ccggccggac cgctggcaac aaaggataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac 360
atttcacaac acgagctgac gacagccatg cagcacctgt ctcacggttc ccgaaggcac 420
attctcatct ctgaaaactt ccgtggatgt caagaccagg taaggttctt cgcgttgcat 480
cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcatt tgagttttaa 540
ccttgcggcc gtactcccca ggcggtcgac ttaacgcgtt agctccggaa gccacgcctc 600
aagggcacaa cctccaagtc gacatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct 660
gtttgctccc cacgctttcg cacctgagcg tcagtcttcg tccagggggc cgccttcgcc 720
accggtattc ctccagatct ctacgcattt caccgctaca cctggaattc tacccccctc 780
tacgagactc aagcttgcca gtatcagatg cagttcccag gttgagcccg gggatttcac 840
atctgactta acaaaccgcc tgcgtgcgct ttacgcccag taattccgat taacgcttgc 900
accctccgta ttaccgcggc tgctggcacg gagttagccg gtgcttcttc tgcgggtaac 960
gtcaatgagc aaaggtatta actttactcc cttcctcccc gctgaaagta ctttacaacc1020
cgaaggcctt cttcatacac gcgggcatgg gctgcatcag gcttgcgccc attgtgcaat1080
attccccact gctgcctccc gtaggagtct ggaccgtgtc tcagttccag tgtggctggt1140
catcctctca gaccagctag ggatcgtcgc ctaggtgagc cgttacccca cctactagct1200
aatcccatct gggcacatcc gatggcaaga ggcccgaagg tccccctctt tggtcttgcg1260
acgttatgcg gtattagcta ccgtttccag tagttatccc cctccatcag gcagtttccc1320
agacattact cacccgtccg ccactcgtca gcaaagaagc aagcttgctt gcgc 1374

Claims (6)

1.微生物发酵法生产L-色氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、培养成熟的菌种：先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟菌种：培养温度34-36℃，pH6.8-7.2，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
（2）、发酵罐培养：先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤（1）得到的成熟菌种接种至发酵罐内，在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸：培养温度34-36℃，pH采用补充液氨分段控制，0-18h7.0-7.2，18h-放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%；
所述菌种为大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）JLTrp，菌种保藏编号为CGMCC NO. 7.217；
步骤（1）中所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.8%、KCl 0.05-0.3%、MgSO4 0.08-0.45%、(NH4)2SO4 0.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、 FeSO4 0.00014-0.00042%、MnSO4 0.00006-0.00036%、维生素B10.000065-0.00039%和生物素0.00001-0.00012%，其余为水；
步骤（2）中所述液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.12-0.8%、KCL 0.12-0.8%、MgSO4 0.05-0.5%、(NH4)2SO4 0.08-0.48%、柠檬酸0.05-0.5%、 FeSO4 0.001-0.1%、Na2SO4 0.0005-0.006%、MnSO4 0.00015-0.0009%、CuSO4 0.00002-0.00018%、CoCl2 0.00014-0.00135%和ZnSO4 0.0001-0.0018%，其余为水。
2.如权利要求1所述微生物发酵法生产L-色氨酸的方法，其特征在于：所述空罐灭菌的具体操作为：罐体清洗干净，检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.11-0.12MPa，温度121-123℃，时间为45-60min。
3.如权利要求1所述微生物发酵法生产L-色氨酸的方法，其特征在于：所述实罐灭菌的具体操作为：将种子培养罐或发酵罐的列管升温至80℃后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.11-0.12MPa，温度121-123℃，时间为10-30min。
4.如权利要求1所述微生物发酵法生产L-色氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（1）中接种的具体操作为：采用压差法进行接种，调pH至6.9，温度35℃，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa ，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上。
5.如权利要求1所述微生物发酵法生产L-色氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（2）中接种的具体操作为：调pH至6.9，温度35℃，压力0.06MPa，将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内。
6.如权利要求1所述微生物发酵法生产L-色氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（1）中接种用菌液的制备方法为：取瓶内菌种生长饱满的茄型瓶，在火焰保护下向茄型瓶内注入生理盐水50ml，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
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