CN108018324A - 一种生产多拉菌素的发酵培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵工程领域，具体公开了一种生产多拉菌素的发酵培养基及其制备方法与应用。所述发酵培养基采用经40～60℃预热处理且粒度为10目～40目的棉籽饼粉与玉米蛋白粉作为发酵培养基的联合氮源，相比单一氮源能够更好的供阿维链霉菌代谢利用，有利于多拉菌素的产生，本发明通过对棉籽饼粉和玉米蛋白粉的粒度进行控制，并结合前预热处理，能够有效避免发酵过程中(尤其是发酵中后期)出现料液发糊的现象，并显著提高多拉菌素的发酵水平。

Description

一种生产多拉菌素的发酵培养基及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，具体地说，涉及生产多拉菌素的发酵培养基。

背景技术

多拉菌素是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物，由突变阿维链霉菌采用发酵模式进行生物合成，为阿维菌素第三代衍生物，与其它阿维菌素类产品比较，其抗寄生虫范围更广泛、杀虫活性更高，预防寄生虫再感染有效时间更长，作为兽用抗寄生虫新药具有很高的开发潜力。

目前发酵生产多拉菌素的过程中存在很多问题导致多拉菌素的发酵产量低，成本居高不下。其中，氮源对发酵产量的影响比较明显。在多拉菌素的生产成本中，氮源的成本占到发酵成本的30％左右。

氮源方面的问题，包括动物性氮源质量不稳定对发酵液质量和发酵效果的不利影响，以及培养基发酵过程后期容易出现发酵液粘度较高，从而降低了提取收率。

因此，亟需提供一种可提高多拉菌素发酵水平及提取收率的植物性氮源培养基。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种生产多拉菌素的发酵培养基及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种生产多拉菌素的发酵培养基，采用经40～60℃预热处理后，且粒度为10目～40目的棉籽饼粉与玉米蛋白粉作为发酵培养基的氮源。

经设置对比实验对比后发现，本发明通过选择棉籽饼粉和玉米蛋白粉组合作为氮源，相比单一氮源能够更好的供阿维链霉菌代谢利用，有利于多拉菌素的产生；对棉籽饼粉和玉米蛋白粉的粒度进行控制，能够有效避免发酵过程中(尤其是发酵中后期)出现料液发糊的现象；对氮源进一步进行前预热处理能够显著提高多拉菌素的发酵水平。

进一步地，所述发酵培养基还包括碳源和无机盐。碳源可以为：麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、糊精、麦芽糊精、淀粉中的一种或多种，无机盐可以为：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、碳酸钙中的一种或多种。

进一步地，对上述原料进行优化选择后，所述发酵培养基优选包括：棉籽饼粉30～50g/L、玉米蛋白粉15～20g/L、麦芽糖100～200g/L、磷酸二氢钾0.5～5g/L，氯化钠0.2～5g/L，硫酸镁1～5g/L、碳酸钙0.5～1g/L、泡敌1g/L和水。

更进一步地，对上述原料的浓度进行优选后，所述发酵培养基优选包括：棉籽饼粉40g/L、玉米蛋白粉20g/L、麦芽糖200g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠3/L，硫酸镁2.5g/L、碳酸钙1g/L、泡敌1g/L和水。

进一步地，在所述发酵培养基的制备过程中，将配方中的水分为两批进行添加。第一批水的添加量约为总用量的50～70％，目的在于使棉籽饼粉和玉米蛋白粉充分吸水膨胀，并使料液能够在水中能较好的翻滚分散；第二批水用于发酵培养基的定容。

具体地说，前述发酵培养基的制备方法包括如下步骤：

(1)将粒度为10目～40目的棉籽饼粉和玉米蛋白粉投料至发酵罐，加水(第一批水)使其充分吸水膨胀得到料液，通气搅拌；通气流量大小控制在保证料液完全翻滚状态；

(2)对发酵罐进行预热，使发酵罐中的料液达到40～60℃，并保持30～90min；

(3)向预热处理后的发酵罐内加入其余发酵培养基所需的原料(包括第二批水)，搅拌均匀，调节pH为6.8～7.2，灭菌。

第二方面，本发明提供了前述发酵培养基在发酵生产多拉菌素中的应用。

可选地，所述应用表现为一种提高多拉菌素发酵水平的发酵方法，即利用前述发酵培养基进行多拉菌素的发酵。

具体为：向所述发酵培养基中接种产多拉菌素菌株的种子培养液进行发酵。

作为优选，所述种子培养液中的菌液浓度为20～25％，接种比例(v/v)为7～15％，优选10％。该接种比例下，可保证菌种在发酵培养基中快速生长并有利于次级代谢的进行。

进一步地，所述产多拉菌素菌株优选为阿维链霉菌菌株。

需要说明的是，由于本发明对发酵方法的改进主要体现在发酵培养步骤，尤其体现在对发酵培养基的改进，因此未对发酵生产多拉菌素的完整工艺进行限定，本领域技术人员可采用本领域的常规技术手段进行。

例如：

(1)斜面培养：将菌株接种到新鲜斜面上，26～28℃下培养8～10天；其中：斜面培养基：甘露醇20g/L、黄豆饼粉20g/L，琼脂粉20g/L；纯化水定容，pH7.0～7.2，119～123℃灭菌30min。

(2)种子培养：将步骤(1)所得孢子接入种子培养基，培养温度26～28℃，摇床转速220～260r/min的条件下培养40～48h；其中，种子培养基：麦芽糖20g/L，玉米蛋白粉5g/L，棉籽饼粉10g/L，饮用水定容，5％(w/v)NaOH溶液调节pH6.8～7.2。119～123℃灭菌30min。

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中(50L罐，消后体积30升)，接种量10％，培养温度26～28℃，压力0.03～0.06MPa，DO控制在50％以上，转速250～500rpm。培养周期15天。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，组合后所得到的技术方案均属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种可提高多拉菌素发酵水平的发酵培养基，通过选择棉籽饼粉和玉米蛋白粉组合作为氮源，相比单一氮源能够更好的供阿维链霉菌代谢利用，有利于多拉菌素的产生；对棉籽饼粉和玉米蛋白粉的粒度进行控制，能够有效避免发酵过程中(尤其是发酵中后期)出现料液发糊的现象；对氮源进一步进行前预热处理能够显著提高多拉菌素的发酵水平。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明生产多拉菌素的方法如下：

1、菌株：

本发明利用常规用于生产多拉菌素的阿维链霉菌菌株，以环己烷羧酸为前体发酵生产阿维菌素类抗生素。

2、所用培养基：

(1)斜面培养基：甘露醇20g/L、黄豆饼粉20g/L，琼脂粉20g/L；纯化水定容，pH7.0～7.2，119～123℃灭菌30min。

(2)种子培养基：麦芽糖20g/L，玉米蛋白粉5g/L，棉籽饼粉10g/L，饮用水定容，5％NaOH溶液调节pH6.8～7.2。119～123℃灭菌30min。

(3)本发明所述发酵培养基：棉籽饼粉30～50g/L、玉米蛋白粉15～20g/L、麦芽糖100～200g/L、磷酸二氢钾0.5～5g/L，氯化钠0.2～5g/L，硫酸镁1～5g/L、碳酸钙0.5～1g/L、泡敌1g/L，饮用水定容。5％NaOH溶液调节pH6.8～7.2。119～123℃灭菌30min。

3、菌种培养：

(1)斜面培养：将菌株接种到新鲜斜面上，26～28℃下培养8～10天；

(2)种子培养：将步骤(1)所得孢子接入种子培养基，培养温度26～28℃，摇床转速220～260r/min的条件下培养40～48h；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中(50L罐，消后体积30升)，接种量10％，培养温度26～28℃，压力0.03～0.06MPa，DO控制在50％以上，转速250～500rpm。培养周期15天。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述发酵培养基的配方与制备方法。

1、配方：

棉籽饼粉40g/L、玉米蛋白粉20g/L、麦芽糖200g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠3/L，硫酸镁2.5g/L、碳酸钙1g/L、泡敌1g/L。饮用水定容。

5％NaOH溶液调节pH6.8～7.2。119～123℃灭菌30min。

2、制备方法：

(1)按照上述配方，将粒度为10目～40目的棉籽饼粉、玉米蛋白粉投料至发酵罐，加入饮用水至定容体积的70％，通入空气搅拌，通气流量控制在保证料液完全翻滚状态即可。

(2)对发酵罐进行预热，并对发酵罐中的料液进行温度监控，使料液达到40～60℃，并保持30～90min，预热完成。

(3)按照上述配方，向发酵罐内加入其余原料，定容，搅拌均匀，并使用5％的NaOH溶液调节pH为6.8～7.2，119～123℃灭菌30min，即得。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：配方为：棉籽饼粉50g/L、玉米蛋白粉15g/L、蔗糖100g/L、磷酸二氢钾5g/L，氯化钠0.2/L，硫酸镁1g/L、碳酸钙0.5g/L、泡敌1g/L。饮用水定容。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：对棉籽饼粉和玉米蛋白粉的粒度不做限制，使用常规生产上使用的产品(粒度大约在60目～80目)。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于：1、对棉籽饼粉和玉米蛋白粉的粒度不做限制，使用常规生产上使用的产品(粒度大约在60目～80目)。

2、不对棉籽饼粉和玉米蛋白粉进行预热处理。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于：不对棉籽饼粉和玉米蛋白粉进行预热处理。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于：将棉籽饼粉替换为玉米蛋白粉。

对比例5

本对比例与实施例1的区别在于：将玉米蛋白粉替换为棉籽饼粉。

实验例:

分别在实施例1、对比例1～5所得的发酵培养基中接种完成种子培养阶段的种子培养液进行发酵。

在前、中、后期对发酵液进行观察并对发酵120h和360h的发酵液进行取样检测。

结果发现：

实施例1发酵全程未出现料液发糊现象，前期长势比对比例1略慢，但是中后期长势很好，120h效价700mg/L，发酵360h放罐，效价2900mg/L。

对比例1发酵120h以前单位长势正常，120h效价800mg/L；但是从发酵120h开始，料液发糊现象明显，后期长势缓慢，发酵360h放罐，效价2300mg/L。实验结果表明对于生产上常规使用的60目～80目的棉籽粉和玉米蛋白粉，水中预热浸泡的处理对发酵水平的提高效果并不明显。

对比例2发酵120h以前单位长势正常，120h效价750mg/L；但是从发酵120h开始，料液发糊现象明显，后期长势缓慢，发酵360h放罐，效价2200mg/L。

对比例3发酵全程未出现料液发糊现象，但是全程长势缓慢，120h效价500mg/L；发酵360h放罐，效价2000mg/L。可能和氮源粒度控制过粗，利用缓慢有关。

对比例4发酵全程未出现料液发糊现象，但是全程长势缓慢，120h效价600mg/L，发酵360h放罐，效价1800mg/L。

对比例5发酵全程未出现料液发糊现象，发酵120h以前单位长势正常，120h效价780mg/L；但是发酵后期长势缓慢，发酵360h放罐，效价1900mg/L。

经对比实验可知，本发明通过选择棉籽饼粉和玉米蛋白粉组合作为氮源，相比单一氮源能够更好的供阿维链霉菌代谢利用，有利于多拉菌素的产生；对棉籽饼粉和玉米蛋白粉的粒度进行控制，能够有效避免发酵过程中(尤其是发酵中后期)出现料液发糊的现象；对氮源进一步进行前预热处理能够显著提高多拉菌素的发酵水平。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种生产多拉菌素的发酵培养基，其特征在于，采用经40～60℃预热处理后，且粒度为10目～40目的棉籽饼粉与玉米蛋白粉作为发酵培养基的氮源。

2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基还包括碳源和无机盐。

3.根据权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括：棉籽饼粉30～50g/L、玉米蛋白粉15～20g/L、麦芽糖100～200g/L、磷酸二氢钾0.5～5g/L，氯化钠0.2～5g/L，硫酸镁1～5g/L、碳酸钙0.5～1g/L、泡敌1g/L。

4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括：棉籽饼粉40g/L、玉米蛋白粉20g/L、麦芽糖200g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠3/L，硫酸镁2.5g/L、碳酸钙1g/L、泡敌1g/L。

5.权利要求1～4任一项所述的发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将粒度为10目～40目的棉籽饼粉和玉米蛋白粉投料至发酵罐，加水得到料液；

(2)对发酵罐进行预热，使发酵罐中的料液达到40～60℃，并保持30～90min；

(3)向预热处理后的发酵罐内加入其余发酵培养基所需的原料，搅拌均匀，调节pH为6.8～7.2，灭菌。

6.权利要求1～4任一项所述的发酵培养基在发酵生产多拉菌素中的应用。

7.一种提高多拉菌素发酵水平的发酵方法，其特征在于，利用权利要求1～4任一项所述的发酵培养基进行多拉菌素的发酵。

8.根据权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，向所述发酵培养基中接种产多拉菌素菌株的种子培养液进行发酵。

9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，接种比例为7％～15％。

10.根据权利要求8或9所述的发酵方法，其特征在于，产多拉菌素菌株为阿维链霉菌菌株。