RU2787202C1 - Штамм Methylococcus capsulatus - продуцент высокобелковой биомассы - Google Patents
Штамм Methylococcus capsulatus - продуцент высокобелковой биомассы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787202C1 RU2787202C1 RU2022125127A RU2022125127A RU2787202C1 RU 2787202 C1 RU2787202 C1 RU 2787202C1 RU 2022125127 A RU2022125127 A RU 2022125127A RU 2022125127 A RU2022125127 A RU 2022125127A RU 2787202 C1 RU2787202 C1 RU 2787202C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- methane
- biomass
- methylococcus capsulatus
- cultivation
- Prior art date
Links
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 241000589346 Methylococcus capsulatus Species 0.000 title claims abstract description 33
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 29
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 40
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 20
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 17
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 abstract description 17
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000813 microbial Effects 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000002609 media Substances 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000000102 heterotrophic Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N n-butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 4
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 3
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241000589345 Methylococcus Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- -1 ammonium nitrogen Chemical compound 0.000 description 2
- 230000018867 autolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propanol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 150000003464 sulfur compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APWFTHDYKJHNEV-NDEPHWFRSA-N (19S)-10,19-diethyl-19-hydroxy-14,18-dioxo-17-oxa-3,13-diazapentacyclo[11.8.0.0²,¹¹.0⁴,⁹.0¹⁵,²⁰]henicosa-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-heptaen-7-yl 4-aminopiperidine-1-carboxylate Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N1CCC(N)CC1 APWFTHDYKJHNEV-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000046071 Aneurinibacillus sp. DB4 Species 0.000 description 1
- 241000498637 Brevibacillus agri Species 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241001634906 Cupriavidus gilardii Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000589349 Methylosinus sporium Species 0.000 description 1
- 241000589351 Methylosinus trichosporium Species 0.000 description 1
- 229910015621 MoO Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000046063 Ralstonia sp. DB3 Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 241001537924 Tetracoccus <angiosperm> Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011031 large scale production Methods 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001450 methanotrophic Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate group Chemical group [N+](=O)([O-])[O-] NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000019529 tetraterpenoid Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22, обладающий при культивировании в метано-воздушной или метано-кислородной атмосфере устойчивостью к фаголизису, к изменениям в составе микроорганизмов-спутников при нестерильном культивировании, к повышенным концентрациям азота и фосфора в среде и обладающий минимальным потреблением кислорода, депонирован под номером ВКПМ В-14282. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для получения микробной белковой биомассы в биотехнологическом производстве с повышенным выходом биомассы и продуктивностью. 3 пр.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и может быть использовано для приготовления бактериальных препаратов, кормовых добавок, белковых изолятов, продуктов, содержащих нуклеиновые кислоты, витамины, специфические ферменты для использования в пищевом производстве, медицине, ветеринарии, косметологии.
Поиск доступных субстратов является одной из проблем современной биотехнологии. Высокие издержки на компоненты питательных сред закладываются в структуре себестоимости продуктов биотехнологии. Переход на непищевой С1-субстрат - метан для производства целого ряда продуктов возможен только при использовании высокоэффективных продуцентов или сообществ микроорганизмов. В последнее время метан рассматривают как основу биоэкономики будущего. Метан-потребляющие микроорганизмы могут использоваться в производстве кормового белка, отдельных аминокислот, нуклеиновых кислот, биопластика, полисахаридов, каротиноидов, витаминов и многих других соединений с высокой добавочной стоимостью. Процессы биоконверсии метана могут в перспективе изменить существующие биотехнологии, в которых используются комплексные субстраты, содержащие белковые гидролизаты, сахара и ростовые факторы. Однако, на пути разработки таких технологий встают проблемы, среди которых низкая эффективность массопереноса метана и кислорода из газовой фазы в жидкую и далее к клеткам микроорганизмов, высокое удельное потребление кислорода клетками, а также низкая устойчивость микроорганизмов к высоким концентрациям источников азота, фосфора в питательной среде и собственным метаболитам.
В то же время у микроорганизмов-продуцентов существует высокая требовательность к чистоте метана, а особенности реализации и неустойчивость культивирования, низкий выход продуктов влияют на экономическую эффективность. Создание новых эффективных штаммов микроорганизмов, потребляющих метан из природного газа, является актуальной задачей.
Стабильное непрерывное культивирование на природном газе возможно при использовании ассоциативной культуры метанокисляющих микроорганизмов и гетеротрофных микроорганизмов - спутников, использующих продукты неполного окисления гомологов метана, и, возможно, продуктов автолиза клеток микроорганизмов.
В патенте SU 603348 предлагается для повышения выхода биомассы использовать смешанную культуру, содержащую бактерии, способные усваивать метан, в частности, Methylococcus capsulatus, и бактерии, которые способны усваивать метанол. В патенте приведены примеры смешанных культур.
В патенте WO 2020/076191 А1 (п. RU 2687137 С1) предлагается использовать смешанную культуру, содержащую бактерии, способные усваивать метан Methylococcus capsulatus, и гетеротрофные бактерии Klebsiella pneumonia 1-17, которые способны усваивать продукты соокисления гомологов метана. При концентрации биомассы 18,5 г АСВ/л доминирование метанокисляющих бактерий составляет 93%.
В патенте RU 2687135 С1-ассоциативную культуру, состоящую из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 и гетеротрофные бактерии Cupriavidus gilardii GBS-15-1 предлагается выращивать в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л при температуре 40-45°С, рН 5,0-6,0 и непрерывной подаче газовой смеси, содержащей метан и кислород. При концентрации биомассы 15 г АСВ/л доминирование метанокисляющих бактерий составляет 90%.
В патенте SU 676177 для повышения выхода биомассы микроорганизмов, способных усваивать метан, предлагается использовать либо чистую культуру штамма Methylococcus 999 N CIB 011083, либо смешанные культуры, в которых культивирование штамма Methylococcus 999 N CIB №11083 ведут в присутствии штамма Pseudomonas N CIB №11112 и/или по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов: штаммов Pseudomonas N CIB №11062, №11063 или №11065 и Micobacterium N CIB №11061.
В авторском свидетельстве SU 460745 предлагается для увеличения выхода биомассы и увеличении содержания белка в микробной биомассе использовать симбиотическую культуру, содержащую виды Methylococcus capsulatus штамм 2, Methylosinus sporium var. incoloratus штамм 4, Methylosinus trichosporium var. rosaceus штамм 5, Flavobacterium gasotypicus штамм 1. При скорости протока равной 0,13 ч-1 концентрация биомассы достигает 11 г/л.
В патентах US 2004/0265431 А1, ЕР 1497409 В1, предлагается для повышения выхода биомассы и увеличении содержания белка в микробной биомассе использовать смешанную культуру, содержащую Methylococcus capsulatus (Bath) (штамм NCIMB 11132), Ralstonia sp.DB3 (штамм NCIMB 13287), Brevibacillus agri DB5 (штамм NCIMB 13289) и дополнительно возможно включение Aneurinibacillus sp.DB4 (штамм NCIMB 13288). В патенте RU 2343192 С2 предлагается использовать данную смешанную культуру для дальнейшего получения субстрата для роста гетеротрофных водорослей или гетеротрофных бактерий.
Общими недостатками культивирования подобных ассоциаций являются сбои непрерывного культивирования из-за спонтанных изменений в сообществе микроорганизмов, неустойчивости отдельных микроорганизмов сообщества к изменениям параметров культивирования.
Известны патенты, касающиеся получения новых штаммов метанотрофных бактерий Methylococcus capsulatus - продуцентов белка и других биологически активных веществ. Штаммы вида Methylococcus capsulatus являются одними из наиболее известных и распространенных метанокисляющих микроорганизмов. Их предлагают использовать для получения белоксодержащей биомассы как в российских, так и в зарубежных патентах. Некоторые из них при оптимальных условиях роста (см. SU 770200 А) и скорости протока 0,18 ч-1, показывают выход биомассы 14 г/л и продуктивности 2,5 г/л ч.
В патенте RU 2728345 С1 предложен новый устойчивый к агрессивной среде штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479, обладающий способностью продуцировать белковую массу. Производство биомассы проводилось в непрерывном режиме при скорости протока питательной среды 0,27 ч-1 и концентрация биомассы на выходе около 10,2-11,3 г/л. Данный штамм обладает устойчивостью к пероксиду водорода в концентрациях 0,01 г в литре ферментационной среды без снижения скорости роста в условиях непрерывного культивирования.
Штамм Methyllococcus capsulatus ВСБ-874 описан в авторском свидетельстве SU 770200 А. Штамм обладает способностью расти при повышенном давлении, устойчив к примесям гомологов метана и сернистых соединений. Данный штамм выращивали в ферментере турбо-эжекционного типа, в качестве источника азота и регулятора рН использовали аммиачную воду. Выращивание проводили при атмосферном давлении, температуре 45°С, величине рН 5,0 и скорости протока 0,25 ч-1. При этом концентрация биомассы составляла 11 г/л. Этот же штамм выращивали под давлением 7 ата, при расходе природного газа и воздуха 25 и 100 м3/ч на 1 м3 соответственно. При скорости протока 0,27 ч-1 была получена концентрация биомассы 23 кг/м3. Следует отметить, что степень инфицированности посторонней микрофлорой была 10%.
В патенте RU 2706074 С1 предложен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКМ В-3289Д (CONCEPT-8) с высоким содержанием белка. Производство биомассы проводится в ферментере с рабочим объемом 1,7 л при давлении 0,2 МПа, температуре 42°С, рН среды 6,7, при скорости протока питательной среды 0,28 ч-1. Концентрация биомассы составляет 11,4-12,3 г/л, содержание сырого протеина в биомассе - 79,4%.
В патенте RU 2720121 С1 предложен процесс выращивания культуры штамма Methyllococcus capsulatus ГБС-15 в непрерывном процессе и ферментере эжекционного типа с непрерывной подачей раствора солей, подготовленной воды и отработанной культуральной жидкости, возвращаемой в процесс ферментации, в количестве от 10 до 95%. Процесс осуществляется при температуре 41-43°С, рН среды 5,6-5,8 и атмосферном давлении, скорость протока 0,25 ч-1, концентрация биомассы в ферментере составляет 10-11 г/л. Коррекция минеральных компонентов, подаваемых в ферментер в составе отработанной культуральной жидкости, позволяет повысить продуктивность процесса получения микробного белка на 10-30%.
В патенте RU 2032737 С1 указано, что при культивировании микроорганизмов в условиях аэрации на водной минеральной питательной среде, содержащей источники азота, фосфора и других макро- и микроэлементов, а также метан в качестве источника углерода, в культуральной среде поддерживается концентрация фосфора на уровне 20-60 мг/л, а отношение концентраций калия, магния, железа, меди, марганца и цинка к концентрации фосфора соответственно на уровне 1:2, 1:4, 1:40, 1:60, 1:80 и 1:100.
В патенте RU 2745093 С1 указано, что еще одним вариантом использования метанокисляющих бактерий для получения микробной биомассы является штамм Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы, регистрационный номер ВКПМ В-13764. Особенностями данного штамма являются минимальная минеральная среда, фагоустойчивость, высокая скорость роста (D=0,34 ч-1), определенная устойчивость к перепадам температуры, рН, изменениям в концентрациях солей, устойчивость к примесям гомологов метана и сернистых соединений. Недостатками штамма являются: высокая концентрация сопутствующей микрофлоры при нестерильном культивировании (35%), низкая концентрация биомассы на выходе в метано-кислородном варианте (17,6 г/л), высокая потребность в кислороде, неустойчивость к повышенным концентрациям азота и фосфора в среде.
Обычно процесс культивирования ведут, используя в качестве источника азотного питания аммиачную воду, которая одновременно служит регулятором рН, при этом содержание аммонийного азота в биореакторе может варьироваться в очень широких пределах. Чувствительность штаммов к источнику фосфора в среде культивирования может быть даже больше, чем к источнику азота. Отклонение содержания азота или фосфора от оптимума приводит к голоданию или ингибированию избытком компонента питания, снижению продуктивности или полной остановке процесса.
Общими недостатками штаммов, описанных выше является низкая скорость роста, малый экономический коэффициент, высокая удельная потребность в кислороде, нестабильность при непрерывном длительном культивировании, чувствительность к гомологам метана, фаголизис или автолиз штаммов при сбоях оборудования и смещении параметров культивирования в неоптимальную сторону, чувствительность к повышенным концентрациям источников азота и фосфора в среде, что определяет возможность применения штамма в крупнотоннажных производственных процессах.
Задачей настоящего изобретения является получение нового более технологичного штамма для использования в биотехнологическом производстве с повышенным выходом биомассы и продуктивностью, обладающего способностью усваивать метанол как дополнительный субстрат, стимулирующий рост, при культивировании в метано-воздушной или метано-кислородной атмосфере, устойчивостью к фаголизису; устойчивого к изменениям в составе микробного сообщества при нестерильном культивировании, к изменениям в составе природного газа, к повышенным концентрациям азота и фосфора в среде, повышенным концентрациям метанола и других спиртов, обладающего минимальным потреблением кислорода.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является увеличение продуктивности до 15,75 г/лхч по биомассе с высоким - до 80% (по Кьельдалю) содержанием белка у штамма Methylococcus capsulatus ACR-22, регистрационный номер ВКПМ В-14282 за счет способности усваивать метанол как дополнительный субстрат, пониженного потребления кислорода, способности стабильно расти при непрерывном культивировании с высокой скоростью протока до 0,35 час-1, в том числе, в составе ассоциации микроорганизмов, доля которых не превышала 5%, способности расти при высоких концентрациях азота и фосфора в среде: концентрации азота - до 400-500 мг/л, концентрации фосфора - до 500-600 мг/л.
Для достижения указанного технического результата штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 был получен из коллекционного штамма Methylococcus capsulatus ВСБ-874. Заявляемый штамм получен в процессе длительной автоселекции штамма Methylococcus capsulatus ВСБ-874 при непрерывном культивировании в нестерильных условиях с использованием метано-воздушной газовой смеси и специфических сред с содержанием метанола, этанола, пропанола, бутанола, повышенным содержанием ионов аммония, фосфатов и совместно с различными микроорганизмами-спутниками. Штамм получен без использования генно-инженерных методов, применения химических мутагенов и воздействия жесткого ультрафиолета
Штамм хранится в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт», коллекционный номер ВКПМ В-14282. Адрес БРЦ ВКПМ: 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1. БРЦ ВКПМ приняло штамм Methylococcus capsulatus ACR-22, регистрационный номер В-14282 на национальное патентное депонирование 21 июля 2022 года. Депозитер: ООО «НПЦ «Акрон инжиниринг».
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма.
Морфологические признаки: клетки штамма в оптимальных условиях имеют форму кокка или диплококка, окружены микрокапсулой, не подвижны, грам-отрицательны. В зависимости от условий культивирования диаметр кокков варьируется от 0,7 до 1,4 мкм. В условиях не оптимальных для роста клетки имеют форму тетракокка, диаметром до 2 мкм, могут образовывать макрокапсулу.
Культуральные признаки: на минеральной агаризованной среде в метано-воздушной атмосфере образуют колонии округлые с ровным краем, слегка выпуклые, кремовые, гладкие, блестящие, диаметр 1 мм, в среду не врастают. Водорастворимого пигмента не выделяется.
Физиологические свойства: облигатный метанотроф. Использует в качестве источника углерода чистый метан, метан из природного газа и метанол. Метан ассимилирует гексулозофосфатным путем. На органических средах (сусло-агар, картофельный и мясо-пептонный агар) не растет. Способен использовать в качестве источника углерода природный газ, содержащий помимо метана его гомологи: этан - до 3%, пропан - до 1%, бутан - до 1%. Аэроб. Оптимальные параметры культивирования: температура 40-42°С и рН=5,6-5,8 ед. Способен расти при рН=4,4 и повышенных температурах (42-47°С). Штамм баротолерантен, способен развиваться при высоком давлении (до 12 атм), устойчив к примесям гомологов метана (С2, С3, С4) в природном газе. Может использовать метанол в концентрации до 0,3% (v/v) как дополнительный субстрат, стимулирующий рост, при культивировании в метано-воздушной или метано-кислородной атмосфере. Устойчив к концентрациям этанола, н-пропанола, н-бутанола до 0,1% (v/v). Отношение к источникам азота: использует аммонийную, нитратную формы азота, способен фиксировать азот атмосферы. Способен расти при высоких концентрациях азота и фосфора в среде: концентрации азота - до 400-500 мг/л, концентрации фосфора - до 500-600 мг/л. Штамм не нуждается в витаминах и других стимуляторах роста, конкурентоспособен по отношению к метанокисляющим микроорганизмам других видов. Штамм характеризуется стабильностью роста при непрерывном культивировании с высокой скоростью протока до 0,35 час-1, обеспечивает высокую продуктивность в метано-кислородном варианте-до 15,75 г/л×ч по биомассе с высоким содержанием белка - до 80% (по Кьельдалю) и нуклеиновых кислот - до 12% (по Спирину), а также экономичность процесса. Methylococcus capsulatus ACR-22 потребляет около 2,3-2,5 г O2/г биомассы, тогда как исходный Methylococcus capsulatus ВСБ-874 тратит 3,2-3,4 г О2/г биомассы. Штамм непатогенен.
Состав минимальной среды для поддержания чистой культуры и культивирования на чашках Петри и в колбах (на 1 л):
Основные компоненты, г: (NH4)2SO4, - 0,1; MgSO4×7H2O - 0,22; CaCl2 - 0,055; Na2HPO4 - 0,092; KH2PO4 - 0,07.
Метанол - 0,5 мл; H3PO4 (85%) - 0,01 мл.
Микроэлементы, мг: CuSO4×5H2O - 2,2; FeSO4×7H2O - 6,15; MnSO4×5H2O - 1,97; Н3 ВО3 - 1,25; ZnSO4×7H2O - 0,5; Na2MoO4×2H2O - 0,11; CoSO4×7H2O - 0,52; NiSO4×7H2O - 0,25; Na2EDTA - 5,00. Готовят концентрированный (в 500-1000 раз) раствор микроэлементов, куда добавляют H3PO4.
рН готовой среды 6-6,3. Для агаризованной среды используют агар в концентрации 1,6-1,7%, желательно, очищенный. Фосфаты и микроэлементы стерилизуются отдельно. Метанол и микроэлементы можно стерилизовать фильтрацией. В автоклаве стерилизацию проводят 30 минут при 1 ати.
Область применения штамма: получаемая микробная биомасса с высоким содержанием белка, нуклеиновых кислот может использоваться как кормовая белково-витаминная добавка для животных и рыбы, а также при комплексной переработке микробной биомассы для получения биологически активных препаратов в ветеринарии, пищевой, медицинской промышленности и др.
Пример 1. Культивирование Methylococcus capsulatus ACR-22 в непрерывном режиме при атмосферном давлении (метано-воздушный вариант).
Процесс проводили в ферментере с турбинными мешалками рабочим объемом 35 л в непрерывном режиме с нарастающим до D=0,35 час-1 протоком питательной среды, поддерживали температуру 40-42°С, рН 5,6-5,8 (автоматическая подтитровка аммиачной водой), и осуществляли непрерывную подачу смеси метана и воздуха в соотношении 1:4 с поддержанием уровня растворенного кислорода не ниже 5% по датчику регулированием оборотов мешалки и расхода газовой фазы.
Использовали среду следующего состава:
Микроэлементы из списка готовили на основе Н3РО4 в виде концентрата. При стерильном культивировании микроэлементы стерилизовали отдельно от остальных компонентов 30 минут при 1 ати.
Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 использовал метанол в концентрации 0,3% (v/v) как дополнительный субстрат, стимулирующий рост и накопление биомассы, что отличает его от Methylococcus capsulatus ВСБ-874, штамм-прототипа и других штаммов, не обладающих устойчивостью к высоким концентрациям метанола.
Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 культивировали и в стерильных условиях, и в составе ассоциации. В процессах культивирования на природном газе с разным содержанием гомологов метана штамм также хорошо рос в составе ассоциативной культуры. Содержание гетеротрофных сопутствующих микроорганизмов в стабильном процессе культивирования составляло не более 5% по отношению к общей массе микробных клеток.
В непрерывном режиме культивирования при атмосферном давлении и высокой скорости протока D=0,35 час-1 Methylococcus capsulatus ACR-22 накапливал до 11 г/л биомассы с содержанием сырого протеина 77-80% (по Кьельдалю), нуклеиновых кислот - до 12% (по Спирину).
Пример 2. Культивирование Methylococcus capsulatus ACR-22 в нестерильных условиях в составе ассоциации микроорганизмов.
В течение длительного стабильного непрерывного культивирования состав ассоциации микроорганизмов в части доминирующих сопутствующих микроорганизмов практически не изменяется. Однако, при непредвиденных остановках оборудования, сбоях в приготовлении питательной среды, изменении качества солей, воды может происходить смена состава сопутствующих микроорганизмов. Для Methylococcus capsulatus ВСБ-874 это приводило к падению содержания сырого протеина в биомассе и длительному процессу реактивации, адаптации основной культуры к новым условиям, а иногда и к полному угнетению основной культуры. У штамма Methylococcus capsulatus ACR-22 при культивировании на среде из примера 1 при тех же параметрах культивирования в длительном непрерывном процессе с описанными выше сбоями в технологическом процессе происходила смена доминирующих сопутствующих микроорганизмов: обычно одни виды микроорганизмы родов Pseudomonas и Cupriviadus заменялись на другие виды тех же родов, что подтверждалось данными 16S рРНК-анализа. Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 быстрее чем Methylococcus capsulatus ВСБ-874 реактивируется после восстановления работы оборудования для ферментации и других сбоев, и устойчив к смене состава сообщества сопутствующих микроорганизмов, а также к фаголизису, показывая те же уровни активности, что и в примере 1, а именно: в непрерывном режиме культивирования при атмосферном давлении и высокой скорости протока D=0,35 час-1 Methylococcus capsulatus ACR-22 накапливал до 11 г/л биомассы с содержанием сырого протеина 77-80% (по Кьельдалю), нуклеиновых кислот - до 12% (по Спирину).
Пример 3. Высокоплотностное культивирование Methylococcus capsulatus ACR-22 в непрерывном режиме (метано-кислородный вариант).
Процесс проводили в ферментере с турбинными мешалками рабочим объемом 35 л под давлением 6 ати в непрерывном режиме с нарастающим до D=0,35 час-1 протоком питательной среды, поддерживали температуру 40-42°С, рН 5,6-5,8 (автоматическая подтитровка аммиачной водой), и осуществляли непрерывную раздельную подачу природного газа и кислорода с поддержанием уровня растворенного кислорода на грани лимита по датчику регулированием оборотов мешалки, расхода газовой фазы и показаниям датчиков на метан и кислород на входе и выходе ферментера.
Питательная среда в системе высокоплотностного культивирования содержит повышенные концентрации источников азота и фосфора, т.к. концентрации компонентов повышаются практически пропорционально накоплению биомассы, и любой сбой процесса может привести к остановке роста из-за повышения концентраций этих элементов. Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 устойчив к высоким концентрациям азота и фосфора в среде, способен расти и не подавляется при концентрации азота - 400-500 мг/л, концентрации фосфора 500-600 мг/л. Таким образом, полученный штамм более стабилен при высокоплотностном культивировании, и достигает концентрации биомассы 43-45 г/л с содержанием сырого протеина 77-80%, нуклеиновых кислот - до 12% при протоке питательной среды D=0,35 час-1. Продуктивность процесса культивирования по биомассе составляла до 15,75 г/л×ч.
Claims (1)
- Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22, депонированный в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» под регистрационным номером В-14282, как продуцент высокобелковой биомассы.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787202C1 true RU2787202C1 (ru) | 2022-12-29 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2706074C9 (ru) * | 2018-12-24 | 2020-01-09 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение Биосинтез" | Штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 - продуцент белковой биомассы |
| RU2728345C1 (ru) * | 2019-11-11 | 2020-07-29 | Публичное акционерное общество "Газпром" | Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - продуцент микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде |
| RU2760288C1 (ru) * | 2021-04-05 | 2021-11-23 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Биопрактика" | Штамм methylococcus capsulatus mc19 - продуцент белковой массы |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2706074C9 (ru) * | 2018-12-24 | 2020-01-09 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение Биосинтез" | Штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 - продуцент белковой биомассы |
| RU2728345C1 (ru) * | 2019-11-11 | 2020-07-29 | Публичное акционерное общество "Газпром" | Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - продуцент микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде |
| RU2760288C1 (ru) * | 2021-04-05 | 2021-11-23 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Биопрактика" | Штамм methylococcus capsulatus mc19 - продуцент белковой массы |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ОШКИН И.Ю. и др. "Анализ полной последовательности генома нового представителя рода Methylococcus, штамма CONCEPT-8' "; Микробиология, 2020, т.89, N 3, с.324-333. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230000125A1 (en) | Novel Microbial Biomass Based Feed Products | |
| CN1330750C (zh) | 磷酸甘油酸族氨基酸及氨基酸衍生物的发酵制造方法 | |
| US20240093141A1 (en) | Strains and processes for single cell protein or biomass production | |
| RU2728345C1 (ru) | Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - продуцент микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде | |
| CN111172058B (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| Sassano et al. | Kinetics and bioenergetics of Spirulina platensis cultivation by fed-batch addition of urea as nitrogen source | |
| RU2787202C1 (ru) | Штамм Methylococcus capsulatus - продуцент высокобелковой биомассы | |
| JP6966096B2 (ja) | 微生物タンパク質を得るための共棲菌 従属栄養細菌Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｇｉｌａｒｄｉｉ ＧＢＳ−１５−１菌株 | |
| JP4388824B2 (ja) | 生産物 | |
| CN116179356B (zh) | 高密度异养培养莱茵衣藻的方法及其应用 | |
| RU2745093C1 (ru) | Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы | |
| RU2720121C1 (ru) | Способ получения микробного белка на основе углеводородного сырья | |
| US20210337829A1 (en) | Microbial Biomass-Based Feed Products | |
| Dubencovs et al. | Medium formulation and fed-batch cultivation of Methylosinus trichosporium | |
| CN102517223A (zh) | 一种甲醇型毕赤酵母的高密度发酵工艺及设备 | |
| RU2773502C1 (ru) | Штамм метанолокисляющих бактерий Acidomonas methanolica BF 21-05М - продуцент для получения микробной белковой массы | |
| JP7514918B2 (ja) | 菌株、及び、単一細胞タンパク質又はバイオマス生産のための方法 | |
| CA3166871C (en) | Microbial biomass-based feed products | |
| EP4116409A1 (en) | Microbial biomass-based feed products | |
| RU2808127C1 (ru) | Штамм бактерий methylobacillus methanolivorans gsa - продуцент кормового белка | |
| CN101321860A (zh) | 制备l-赖氨酸的发酵工艺 | |
| RU2768401C1 (ru) | Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов | |
| CN107404904A (zh) | 用于饲料添加剂的组合物及包含其的动物饲料组合物 | |
| CN108893415B (zh) | 曲霉菌株及利用曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法 | |
| CN107118994B (zh) | 一种调控酪酸菌发酵效率的方法 |