CN101321860A - 制备l-赖氨酸的发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸(PCA)的培养基中进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌菌株的方法以及一种通过对所述菌株进行主培养来制备L－赖氨酸的发酵工艺。

Description

制备L-赖氨酸的发酵工艺
技术领域
本发明涉及一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸(PAC)的培养基中对棒状杆菌属菌株进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌属菌株的方法，以及一种通过主培养相同菌株来制备L-赖氨酸的发酵工艺。
背景技术
L-赖氨酸是一种基本氨基酸，已经被用于动物饲料添加剂、食物添加剂和药物成分。特别在2005年，作为动物饲料添加剂的L-赖氨酸在市场中增加到大约有860,000吨，显示了L-赖氨酸是生产发酵产品的重要因素。
L-赖氨酸通过直接发酵进行工业化生产，其利用添加有碳源诸如粗糖、葡萄糖和糖蜜(甘蔗、甜菜)和氮源诸如玉米浆液(CLS)、豆粕水解液以及硫酸铵、维生素和矿物质的培养基。
生产L-赖氨酸的常规方法已在专利文献中公开了；例如日本特许专利公开号：平4-66558描述了一种方法，其中将水中稀释的甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜通过阳离子交换树脂并且将洗脱液装载到发酵培养基中丛而增加发酵物的浓度和L-赖氨酸的产量。日本特许专利公开号1982-026594描述了一种利用棒状杆菌使转化酶与稀释的甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜在水中反应，并利用其反应产物的发酵来生产L-赖氨酸的方法。
发明内容
技术问题
发明人通过建立具有良好发酵效率的L-赖氨酸发酵的新工艺来实现本发明。这通过向在添加有吡咯烷酮羧酸的培养基中对棒状杆菌属菌株进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌属菌株的方法来实现。
技术方案
本发明的目的在于，提供一种活化用于L-赖氨酸发酵过程的棒状杆菌属菌株的方法。
本发明的另一目的在于，提供一种利用活化的棒状杆菌属菌株来发酵L-赖氨酸的工艺。
为了实现上述目的，本发明提供了一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸(PAC)的培养基中对棒状杆菌属菌株进行种前培养和种子培养来活化棒状杆菌属菌株的方法。
在本发明中，棒状杆菌属中的任何棒状杆菌属菌株都可以产生L-赖氨酸。例如，谷氨酸棒状杆菌、可於棒状杆菌、黄色棒状杆菌和乳糖发酵棒状杆菌中的菌株都可被利用。
本发明的棒状杆菌属菌株优选为谷氨酸棒状杆菌(保藏号：KFCC11043)。
本发明提供了一种活化棒状杆菌属菌株通过发酵生产L-赖氨酸的方法，其中种前培养基和种子培养基添加有吡咯烷酮羧酸或者含有吡咯烷酮羧酸的物质，并且棒状杆菌属菌株在上述培养基中培养。种前培养或种子培养之后，在主发酵工艺过程中没有必要向培养基中添加吡咯烷酮羧酸，因为在种后培养中添加吡咯烷酮羧酸对发酵效率没有影响。
一般说来，发酵过程由种前培养、种子培养和主发酵(主培养)三个步骤组成。
进行种前培养目的在于，为了高效生产在种子培养之前保证培养是纯化的，并保持细菌的连续的活性。
种子培养是种前培养和主发酵之间的中间过程，其目的在于增加细胞密度和菌株活性。为了增加发酵工艺的效率，培养液的体积必须是主发酵初始体积的5～30％，所以优选在主发酵工艺之前进行种子培养。种子培养是培养种前培养纯化的培养物菌株，直到这些菌株完全被活化并且其数量增加到足够用于主培养为止。种子培养液被直接用于主发酵工艺。
根据批量发酵工艺中，纯化分离的菌株可在小体积反应器中培养。当菌株的数量达到一定水平时，将它们转移到大体积反应器中(在一些情况下，该过程必须重复数次)。经过上述过程之后，产生了足够的用于主培养的细胞和培养液，并且具有稳定的细胞活性。
根据本发明，在主发酵工艺之前，将被认为是天然潮湿因子的吡咯烷酮羧酸或者含有吡咯烷酮羧酸的物质添加到用于棒状杆菌属菌株的种前培养或/和种子培养的培养基中，从而活化菌株。结果，主发酵工艺中L-赖氨酸的产量也增加了。
本发明中，单独加入吡咯烷酮羧酸，或者加入含有吡咯烷酮羧酸的物质。
本发明中，种前培养和种子培养基中吡咯烷酮羧酸的含量优选为0.1g/l到5g/l。
含有吡咯烷酮羧酸的物质例如为动物皮肤、芦荟、甜菜等，且优选为甜菜糖蜜。种前培养和种子培养基中优选的甜菜糖蜜含量为5g/l到100g/l。甜菜糖蜜中吡咯烷酮羧酸的含量大约为2％到3％。
除了吡咯烷酮羧酸以外，诸如碳源、氮源和矿物质等都多种成分可加入到种前培养基、种子培养基和主发酵培养基中。
碳源例如为碳氢化合物如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和淀粉，以及有机酸如醋酸和乳酸。碳源可单独加入或者与其它物质组合加入。氮源例如为有机氮源如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦汁、玉米浆液和大豆糖蜜，以及无机氮源诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵和硝酸铵。氮源可单独加入或者与其它物质组合加入。培养基另外添加有磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾以及与其相应的磷酸钠盐作为磷酸源。金属盐如硫酸镁或者硫酸铁可加入到培养基中。另外，也可加入氨基酸、维生素和适当的前体。这样的培养基或者前体可通过分批型或者连续地添加到培养液中。
为了调节培养基的pH，在培养过程中可加入氢氧化钠、氢氧化钾或者氨水。在培养过程中气泡的产生通过消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制。为了保持需氧状态，将氧气或者含氧气体(例如空气)加入到培养基中。培养基的优选温度为20℃到45℃，更优选为25℃到40℃。培养周期取决于L-赖氨酸的产生期间，优选为10小时到160小时。
产生上述培养物的方法选自如下组方法中，分批培养、连续培养和补料培养。补料培养包括补料分批培养和重复补料分批培养，但不局限于此。
本发明涉及一种生产L-赖氨酸的发酵工艺，其中活化的棒状杆菌属菌株如上述被培养。
本发明发酵工艺中，从培养基中分离L-赖氨酸可通过任何本领域技术人员已知的现有技术来进行，如离心、膜过滤、离子交换色谱法和结晶。例如可通过低速离心从培养基中分离L-赖氨酸，或者通过离子交换色谱法对利用膜消除生物质的上清液进行分离。
具体实施方式
以下实施例将对本发明的实践和优选实施方式进行详细描述。
但是，应当理解，在考虑所公开内容的基础上，本领域技术人员可在本发明的精神和范围内可以进行修改和补充。
实施例1
在本发明的优选实施例中，研究了吡咯烷酮羧酸(PCA)对棒状杆菌属菌株活性的影响。
将从冻干细胞中分离并测试滴定量的谷氨酸棒状杆菌(在1998年7月30日保藏，保藏号KFCC 11043，从2008年5月26日开始在布达佩斯条约下保藏在韩国微生物保存中心，保藏号：KCCM 10951P，韩国首尔市西大门区弘济1洞友林大厦361-221)在LB(Luria Bertani)液体培养基中培养20小时，然后用灭菌盐水洗涤三次。在含PAC浓度分别为0g/l、0.1g/l、0.25g/l、0.5g/l和1.0g/l的最低培养基中接种上述培养液，然后在30℃下以200rpm摇瓶培养20小时。
最低培养基的成分(灭菌前pH为7.0)：
葡萄糖10g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1.0g，K2HPO4 3.0g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，MnSO4·5H2O 10mg，生物素100μg，硫胺素·HCl 100μg，烟酰氨1mg，泛酸钙1mg，CaCl2·2H2O 0.1g，Na2B4O7·10H2O 80μg，(NH4)6MoO27·4H2O4 40μg，ZnSO4·7H2O 10μg，CuSO4·7H2O 300μg，MnCl2·4H2O 10μg，FeCl3·6H2O 1mg(1L蒸馏水中)。
将反应液稀释并涂布到LB固体培养基上，然后30℃到32℃下继续培养2天，计算产生的克隆数。
为了计数活菌，培养液用0.85％的灭菌盐水稀释并加载到LB培养基(蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 5g/l，琼脂糖20g/l)并计算克隆数。等同物由Bertrand方法定量。
表1
  PCA浓度(g/l)   0   0.1   0.25   0.5   1.0
  细胞数(细胞/ml)   5×106   6×108   7×108   3×108   5×108
如表1中所示，通过添加PCA提高了谷氨酸棒状杆菌KFCC 11043的活性。通过上述结果，可以推断PCA在生理上影响了细胞膜，从而增加了对外部环境的抗性(培养基中的pH，渗透性改变等)，最终导致菌株数量的增加。
实施例2：在烧瓶中和小发酵罐中发酵
在本发明的优选实施方式中，谷氨酸棒状杆菌KFCC 11043，一种生产L-赖氨酸的菌株在烧瓶和小发酵罐中发酵。
(1)在烧瓶中发酵
将25ml种前培养基加入到250ml挡板烧瓶中，然后进行摇瓶培养。将50ml发酵培养基加入到500ml挡板烧瓶中，然后进行摇瓶培养。
将PCA加入到种前培养基和发酵培养基使浓度分别为0g/l、0.5g/l、1.0g/l和2.5g/l。含PCA的培养基的成分如下。
种前培养基的成分(灭菌前pH为7.0)：
粗糖50g/l，豆粕水解液10g/l，酵母提取物1g/l，KH2PO4 1.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，尿素5g/l，生物素50μg/l。
发酵培养基的成分(灭菌后pH为7.0)：
粗糖或者葡萄糖100g，豆粕水解液10g，(NH4)2SO4 40g，尿素4g，KH2PO4 1g，NaCl 2.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，MnSO4·5H2O 10mg，生物素100μg，硫胺素·HCl 200μg，CaCO440g(1L生产用水中)。
每次培养都在32℃下以222rpm培养72小时。
培养完成时，通过高效液相色谱(HPLC)分析培养液，从而测定L-赖氨酸的浓度和OD。通过Bertrand方法测定剩余的糖，结果如下：
表2
Figure A20068004577900101
(2)小发酵罐中发酵
在摇瓶培养箱中种前培养之后，在5L发酵罐中进行种子培养，通过补料分批发酵在30L发酵罐中进行主发酵工艺。
特别地，种前培养在摇瓶培养箱(25ml培养基/250ml挡板摇瓶)中32℃下以220rpm在20小时里，往种前培养基中添加PCA使培养基浓度分别为0g/l(不添加)、1.0g/l和2.5g/l，或者添加甜菜糖蜜使培养基浓度分别为10g/l和20g/l。
种前培养基的成分(灭菌前pH为7.0)：
粗糖50g/l，豆粕水解液10g/l，酵母提取物1g/l，KH2PO4 1.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，尿素5g/l，生物素50μg/l。
在种前培养后，种子培养在30℃下、pH7.2(用氨气调节)和以600rpm在24小时里，在5L发酵罐中添加PCA使浓度分别为0g/l(不添加)、1.0g/l和2.5g/l，或者添加甜菜糖蜜使浓度分别为10g/l和20g/l，通风条件为1vvm。
种子培养基成分：
粗糖70g/l，豆粕水解液5g/l，(NH4)2SO4 10g/l，KH2PO4 1.0g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，生物素300μg/l，硫胺素·HCl 1000μg/l，烟酰氨2000μg/l，泛酸钙500μg/l，消泡剂3ml/l。
在种子培养后，主发酵培养在30℃下、pH为7.0(用氨气调节)和以600rpm在50小时到80小时里，在30L发酵罐中添加PCA使浓度分别为0g/l(不添加)、1.0g/l和2.5g/l，通风条件为1vvm。
发酵培养基的成分(灭菌后pH为7.0)：
粗糖360g/l，糖蜜(还原糖)10g/l，豆粕水解液30g/l(pH2-3，用氨气调节，在灭菌后单独加入)，(NH4)2SO4 55g/l，KH2PO4 2.0g/l，MgSO4·7H2O 1.5g/l，FeSO4·7H2O 50mg/l，MnSO4·5H2O 50mg/l，生物素300μg/l，硫胺素·HCl 1000μg/l，烟酰氨2000μg/l，泛酸钙500μg/l，消泡剂3ml/l。
当完成培养后，通过高效液相色谱(HPLC)分析培养液，测定L-赖氨酸浓度，其结果显示在表3和表4中。
表3
Figure A20068004577900111
Figure A20068004577900121
表4
Figure A20068004577900122
如表3中所示，在种前培养基/种子培养基中添加PCA使浓度分别为0.5g/l、1.0g/l和2.5g/l时，与主发酵培养基中是否添加PCA无关地与常规方法相比，其发酵产率增加了15％、产量增加了2％。
当添加含有吡咯烷酮羧酸的甜菜糖蜜时得到类似效果(表4)。
工业实用性
如上文所述，本发明中制备L-赖氨酸的发酵工艺提供了以糖为基础的非常高的产率和产量。
对本领域技术人员来说，前述说明书中所公开的构思和具体实施方式可以很容易被用作修改或者设计其它实施方式的基础以实现与本发明相同的目。对本领域技术人员来说，所述等效实施方式不偏离所附的权利要求书中所阐明的本发明的精神和保护范围。

Claims (6)

1、一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸的培养基中进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌菌株的方法。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于，培养基中吡咯烷酮羧酸的浓度为0.1g/l到5g/l。
3、根据权利要求1的方法，其特征在于，吡咯烷酮羧酸以甜菜糖蜜的形式添加到培养基中。
4、根据权利要求3的方法，其特征在于，培养基中甜菜糖蜜的浓度为5g/l到100g/l。
5、根据权利要求1的方法，其特征在于，棒状杆菌属菌株优选为谷氨酸棒状杆菌(保藏号：KFCC 11043)。
6、一种制备L-赖氨酸的发酵工艺，其特征在于，包括权利要求1至5中的一种活化的棒状杆菌属菌株的主培养步骤。
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