CN103215322A - 一种提高l-缬氨酸产率的发酵方法 - Google Patents

一种提高l-缬氨酸产率的发酵方法 Download PDF

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徐庆阳
万红兵
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曹文杰
江衍哲
龙辉
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Abstract

本发明公开了一种提高L-缬氨酸产率的发酵方法，将缬氨酸生产菌接种至含有甜菜碱的发酵培养基中进行发酵，得到L-缬氨酸，其中所述甜菜碱在发酵培养基中的含量为0.1-10g/L。本发明的甜菜碱可作为缬氨酸生产菌的甲基供体，用于调节细胞内的渗透压、促进脂肪代谢及蛋白质合成等，此外还能够刺激菌体生长、促进产酸等，添加甜菜碱进行发酵后L-缬氨酸的产率高达67.3g/L，糖酸转化率高达27.5%，相对于未添加甜菜碱的发酵培养基发酵分别提高了8.5%和6.2%。

Description

一种提高L-缬氨酸产率的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及一种L-缬氨酸发酵的方法。
背景技术
缬氨酸（Valine），中文名为2-氨基-3-甲基丁酸，属于分支链氨基酸，是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八种必须氨基酸之一，具有多种生理功能，被广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等领域。特别是在医药领域，缬氨酸可用于与其他必需氨基酸配制成复合氨基酸输液，尤其是高支链氨基酸输液及口服液，不仅可以提高人体免疫力，还能促进病人康复及手术后复原。此外，其还应用于血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，肿瘤患者的营养支持治疗等。
L-缬氨酸生产方法主要有化学合成法、提取法和发酵法。提取法和化学合成法由于存在原料来源受限制、生产成本高、污染环境等缺陷而难以实现工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。微生物发酵法生产L-缬氨酸包括微生物转化和直接发酵两种方式，其中前者使用葡萄糖作为碳源，在添加特异性前体的基础上通过微生物作用将其转化为缬氨酸，而后者是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过选育营养缺陷型突变株以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到积累缬氨酸的目的。
如公开号为CN1844356A的中国发明专利提供了一种黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产L-缬氨酸的工艺，其以黄色短杆菌HL41(CICC10135)为出发菌种，选育具有遗传标记(Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)的突变株TV230，使其具有L-缬氨酸的生物合成能力。突变株经扩培、发酵培养、提取、纯化等步骤可得到L-缬氨酸纯品，其中L-缬氨酸的发酵产率大大提高，最高产量可达55g/L。
又如公开号为CN101962664A的中国发明专利公开了一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺，其以营养缺陷型和缬氨酸渗漏型菌株为生产菌株，以一些营养组分按一定比例配制成营养丰富且均衡的培养基作为发酵培养基，发酵过程中,通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上,通过流加液氨控制pH,并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平,发酵60h后L-缬氨酸的产量(55g/L以上)和转化率(25%以上)大幅度提高。
黄色短杆菌是生产L-缬氨酸的主要生产菌种，其代谢主要由EMP和HMP途径进入TCA。PEP通过CO2固定反应生成OAA，而OAA是合成L-苏氨酸等杂酸的前体，通过添加柠檬酸或盐可以有效减少TCA循环的回补反应，从而使更多的PEP参与L-缬氨酸的合成。公开号为CN101979626A的中国发明专利公开了一种提高L-缬氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，其根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐的方法，来有效提高L-缬氨酸发酵过程糖酸转化率和产率，L-缬氨酸的产量达到61.2g/L，糖酸转化率达到28.3％。
甜菜碱是在甜菜糖蜜中发现的季铵型生物碱，其是细胞代谢的中间产物，具有提供甲基、调节细胞内渗透压、促进脂肪代谢和蛋白质合成等作用，此外其作为细胞内一种重要的渗透压缓冲物质，能防止细胞中离子浓度的激变，特别是当细胞内渗透压激变时（如外部渗透压升高时），细胞开始产生或吸收甜菜碱以维持正常的渗透压的平衡，同时防止细胞水分的流出和盐分的入侵。公开号为CN101705262A的中国发明专利公开了利用甜菜碱或磷酸盐甜菜碱来提高L-谷氨酸的发酵产率，然而还没有应用于L-缬氨酸发酵方面的相关研究。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种利用甜菜碱提高L-缬氨酸产率的发酵方法，本发明方法工艺简单、生产成本低、L-缬氨酸的产量及糖酸转化率有较大提高，特别适合用于工业化生产。
为了达到上述目的，本发明一方面提供一种提高L-缬氨酸产率的发酵方法，将缬氨酸生产菌接种至含有甜菜碱的发酵培养基中进行发酵，得到L-缬氨酸。
其中，所述甜菜碱在发酵培养基中的含量为0.1-10g/L，优选为0.5-5g/L，进一步优选为1-3g/L。本发明的甜菜碱可作为菌体甲基供体、调节体内渗透压、促进细胞内脂肪代谢和蛋白质合成等，具有刺激菌体生长、促进产酸等作用，因而可以通过在发酵培养基添加甜菜碱的方法提高缬氨酸生产菌L-缬氨酸的发酵产率。
其中，所述缬氨酸生产菌为黄色短杆菌（Brevibacterium flavum），所述黄色短杆菌为黄色短杆菌HL41，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC10135。
其中，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖70-90g/L，豆饼水解液20-30ml/L，玉米浆15-25ml/L，(NH4)2SO41-3g/L，K2HPO4·3H2O1-2g/L，MgSO4·7H2O0.1-1g/L，MnSO4·7H2O0.01-0.02g/L，甜菜碱0.1-10g/L，发酵培养基的pH值为6.7-7.0。
特别是，所述发酵培养基的配方优选为：葡萄糖80g/L，豆饼水解液25ml/L，玉米浆20ml/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO4·3H2O1.2g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·7H2O0.015g/L，甜菜碱3g/L。
其中，采用分段供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，其中所述分段供氧具体包括：在发酵0-20h期间控制发酵液中的溶氧浓度为20-30%，在发酵20h至发酵结束期间控制发酵液中的溶氧浓度为10-20%。
特别是，在发酵过程中通过调节通气量（1-2L/min）和搅拌转速（500r/min-880r/min）来进行所述分段供氧。本发明在发酵过程中将溶氧浓度控制在恰当的水平上，既不因溶氧浓度过低导致TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，从而刺激了乳酸脱氢酶的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累；也不因溶氧浓度过高导致TCA循环流量加大生成大量CO2而造成碳源的大量流失、引起乙酰乳酸合成酶酶活明显降低而致使L-缬氨酸产量下降。
特别是，所述发酵为补料分批发酵，其具体包括：视所述发酵的发酵液中残留葡萄糖的情况来流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1.0-1.5%，其中所述葡萄糖溶液的浓度为80-90wt%。尤其是，自发酵液中残留葡萄糖的浓度为3-1%时开始流加所述葡萄糖溶液。本发明通过流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在合适的水平，既不会构成底物限制，又不会引起“葡萄糖效应”，菌种的生产能力得到最大限度的发挥。
其中，将所述缬氨酸生产菌扩大培养后再接种至含有甜菜碱的发酵培养基中进行发酵，得到L-缬氨酸。
特别是，所述扩大培养包括将所述缬氨酸生产菌接种至种子培养基中进行培养，得到种子液，其中所述种子培养基配方为：葡萄糖20-30g/L，玉米浆15-25mL/L，豆饼水解液10-20mL/L，酵母粉2-8g/L，尿素0.1-1g/L，K2HPO4·3H2O0.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O0.1-1g/L，MnSO4·7H2O0.005-0.02g/L，VB10.1-1mg/L，生物素0.1-1mg/L，种子培养基的pH值为6.7-7.0。
尤其是，所述种子培养基配方优选配方为：葡萄糖25g/L，玉米浆20mL/L，豆饼水解液15mL/L，酵母粉4g/L，尿素0.6g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·7H2O0.01g/L，VB10.3mg/L，生物素0.2mg/L。
其中，所述扩大培养的温度为30-34℃，优选为32℃，时间为12-16小时，优选为14小时，扩大培养过程中培养液溶氧浓度为20-30%；所述发酵的接种量为5-15%，优选为10%，发酵温度为30-34℃，优选为32℃，发酵时间为50-70小时，优选为60小时。
其中，所述发酵还包括：流加一定浓度的氨水，使发酵液的pH维持在6.7-7.0。特别是，所述氨水的浓度为20-30%，优选为25%。
其中，所述发酵还包括：根据发酵罐中的泡沫情况流加15-25%，优选为20%的泡敌进行消泡。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
1、本发明通过在L-缬氨酸发酵培养基添加甜菜碱来提高缬氨酸生产菌L-缬氨酸发酵产率及糖酸转化率，其中L-缬氨酸产率高达67.3g/L，糖酸转化率为27.5%，L-乳酸产量为2.5g/L，相对于未添加甜菜碱的发酵培养基发酵，L-缬氨酸产率提高了8.5%，糖酸转化率提高了6.2%，L-乳酸产量降低了28.5%；
2、本发明进一步优化了L-缬氨酸的发酵工艺，通过流加葡萄糖使发酵液中残糖含量控制在1-1.5%，既不会构成底物限制，又不会引起“葡萄糖效应”，菌种的生产能力得到最大限度的发挥；同时通过分段供氧控制发酵液中的溶氧，既不会造成乳酸积累，也不会浪费碳源，L-缬氨酸得以大量积累；
3、本发明发酵方法可以通过发酵罐进行自动控制，工艺操作简便、设备要求低、发酵时间短、生产成本低、经济效益显著，特别适合工业化大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一、配制培养基
种子培养基：葡萄糖25g/L，玉米浆20mL/L，豆饼水解液15mL/L，酵母粉4.0g/L，尿素0.6g/L(分消)，K2HPO4·3H2O1.0g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·7H2O0.01g/L，VB10.3mg/L，生物素0.2mg/L，pH值6.7-7.0，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中尿素进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵培养基Ⅰ：葡萄糖80.0g/L(分消)，豆饼水解液25mL/L，玉米20mL/L，(NH4)2SO42.0g/L，K2HPO4·3H2O1.2g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·7H2O0.015g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵培养基Ⅱ：向上述发酵培养基Ⅰ中添加甜菜碱0.5g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
二、L-缬氨酸发酵
将摇瓶活化的黄色短杆菌HL41按10%接种量接入装有上述种子培养基的5L自动控制发酵罐中，于32℃、pH值7.0和溶氧浓度为30%条件下培养14h至对数期，制得种子液；
将种子液按10%接种量分别接入装有上述发酵培养基Ⅰ和发酵培养基Ⅱ的5L自动控制发酵罐中，控制发酵温度为32℃,初始通气量为2L/min，初始搅拌转速为800r/min，在发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速来分段供氧，使发酵0-20h发酵液中的溶氧浓度为30%，发酵20-60h溶氧浓度为20%，通过自动流加25%的氨水控制发酵液的pH在6.7～7.0，通过流加20%的泡敌进行消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将发酵液中残糖控制在1.0%-1.5%；
发酵至60h结束，其中发酵培养基Ⅱ的培养液中L-缬氨酸的产量为64.2g/L，糖酸转化率为26.1%，L-乳酸产量为2.8g/L；发酵培养基Ⅰ的培养液中L-缬氨酸的产量为62.0g/L，糖酸转化率为25.9%，L-乳酸产量为3.5g/L，由此可见添加甜菜碱后L-缬氨酸的产量提高了3.5%，糖酸转化率提高了0.8%，副产物L-乳酸产量降低了20%。
实施例2
一、配制培养基
种子培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆25mL/L，豆饼水解液10mL/L，酵母粉6.0g/L，尿素0.2g/L(分消)，K2HPO4·3H2O0.6g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，MnSO4·7H2O0.006g/L，VB10.8mg/L，生物素0.5mg/L，pH值6.7-7.0，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中尿素进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵培养基Ⅰ：葡萄糖75g/L(分消)，豆饼水解液20mL/L，玉米24mL/L，(NH4)2SO41.0g/L，K2HPO4·3H2O1.8g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，MnSO4·7H2O0.01g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵培养基Ⅱ：向上述发酵培养基Ⅰ中添加甜菜碱1.0g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
二、L-缬氨酸发酵
将摇瓶活化的黄色短杆菌HL41按12%接种量接入装有上述种子培养基的5L自动控制发酵罐中，于32℃、pH值6.8和溶氧浓度为20%条件下培养14h至对数期，制得种子液；
将种子液按15%接种量分别接入装有上述发酵培养基Ⅰ和发酵培养基Ⅱ的5L自动控制发酵罐中，控制发酵温度为32℃,初始通气量为1L/min，初始搅拌转速为500r/min，在发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速来分段供氧，使发酵0-20h发酵液中的溶氧浓度为20%，发酵20-60h溶氧浓度为10%，通过自动流加25%的氨水控制发酵液的pH在6.7～7.0，通过流加20%的泡敌进行消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将发酵液中残糖控制在1.0%-1.5%，发酵至60h结束，其中发酵培养基Ⅱ的培养液中L-缬氨酸的产量为65.5g/L，糖酸转化率为26.7%，副产物L-乳酸产量为2.7g/L，发酵培养基Ⅰ的培养液中L-缬氨酸的产量为61.2g/L，糖酸转化率为25.1%，副产物L-乳酸产量为3.6g/L，添加甜菜碱后L-缬氨酸的产量提高了7.0%，糖酸转化率提高了6.4%，L-乳酸产量降低了25.0%。
实施例3
一、配制培养基
种子培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆16mL/L，豆饼水解液18mL/L，酵母粉2.0g/L，尿素0.8g/L(分消)，K2HPO4·3H2O1.2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·7H2O0.015g/L，VB10.1mg/L，生物素0.8mg/L，pH值6.7-7.0，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中尿素进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵培养基Ⅰ：葡萄糖90g/L(分消)，豆饼水解液28mL/L，玉米15mL/L，(NH4)2SO43.0g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4·7H2O0.02g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵培养基Ⅱ：向上述发酵培养基Ⅰ中添加甜菜碱6.0g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
二、L-缬氨酸发酵
将摇瓶活化的黄色短杆菌HL41按8%接种量接入装有上述种子培养基的5L自动控制发酵罐中，于32℃、pH值7.0和溶氧浓度为25%条件下培养14h至对数期，制得种子液；
将种子液按8%接种量分别接入装有上述发酵培养基Ⅰ和发酵培养基Ⅱ的5L自动控制发酵罐中，控制发酵温度为32℃,初始通气量为1.5L/min，初始搅拌转速为650r/min，在发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速来分段供氧，使发酵0-20h发酵液中的溶氧浓度为25%，发酵20-60h溶氧浓度为15%，通过自动流加25%的氨水控制发酵液的pH在6.7～7.0，通过流加20%的泡敌进行消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将发酵液中残糖控制在1.0%-1.5%，发酵至60h结束，其中发酵培养基Ⅱ的培养液中L-缬氨酸的产量为66.8g/L，糖酸转化率为27%，副产物L-乳酸产量为2.6g/L，发酵培养基Ⅰ的培养液中L-缬氨酸的产量为61.6g/L，糖酸转化率为25.5%，副产物L-乳酸产量为3.6g/L，添加甜菜碱后L-缬氨酸的产量提高了8.4%，糖酸转化率提高了5.9%，L-乳酸产量降低了27.8%。
实施例4
种子培养基和发酵培养基Ⅰ同实施例1；
发酵培养基Ⅱ：向上述发酵培养基Ⅰ中添加甜菜碱3.0g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵工艺控制及相关参数同实施例1，其中发酵培养基ⅡⅠ的培养液中L-缬氨酸的产量为67.3g/L，糖酸转化率为27.5%，副产物L-乳酸产量为2.5g/L，添加甜菜碱后L-缬氨酸的产量提高了8.5%，糖酸转化率提高了6.2%，L-乳酸产量降低了28.5%。
实施例5
种子培养基和发酵培养基Ⅰ同实施例1；
发酵培养基Ⅱ：向上述发酵培养基Ⅰ中添加甜菜碱8.0g/L，于0.75kg/cm2灭菌20min，其中葡萄糖进行分消（0.5kg/cm2，30min）；
发酵工艺控制及相关参数同实施例1，其中发酵培养基Ⅱ的培养液中L-缬氨酸的产量为66.9g/L，糖酸转化率为27.1%，副产物L-乳酸产量为2.6g/L，添加甜菜碱后L-缬氨酸的产量提高了8.0%，糖酸转化率提高了4.6%，L-乳酸产量降低了25.7%。

Claims (10)

1.一种提高L-缬氨酸产率的发酵方法，其特征在于，将缬氨酸生产菌接种至含有甜菜碱的发酵培养基中进行发酵，得到L-缬氨酸。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述甜菜碱在发酵培养基中的含量为0.1-10g/L。
3.如权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述缬氨酸生产菌为黄色短杆菌。
4.如权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖70-90g/L，豆饼水解液20-30ml/L，玉米浆15-25ml/L，(NH4)2SO41-3g/L，K2HPO4·3H2O1-2g/L，MgSO4·7H2O0.1-1g/L，MnSO4·7H2O0.01-0.02g/L，甜菜碱0.1-10g/L，发酵培养基的pH值为6.7-7.0。
5.如权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，采用分段供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，其中所述分段供氧具体包括：在发酵0-20h期间控制发酵液中的溶氧浓度为20-30%，在发酵20h至发酵结束期间控制发酵液中的溶氧浓度为10-20%。
6.如权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵为补料分批发酵，其具体包括：视所述发酵的发酵液中残留葡萄糖的情况来流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1.0-1.5%。
7.如权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，将所述缬氨酸生产菌扩大培养后再接种至含有甜菜碱的发酵培养基中进行发酵，得到L-缬氨酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述扩大培养包括将所述缬氨酸生产菌接种至种子培养基中进行培养，得到种子液，其中所述种子培养基配方为：葡萄糖20-30g/L，玉米浆15-25mL/L，豆饼水解液10-20mL/L，酵母粉2-8g/L，尿素0.1-1g/L，K2HPO4·3H2O0.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O0.1-1g/L，MnSO4·7H2O0.005-0.02g/L，VB10.1-0.5mg/L，生物素0.1-0.5mg/L，种子培养基的pH值为6.7-7.0。
9.如权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵的温度为30-34℃，发酵时间为50-70小时。
10.如权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵还包括：流加一定浓度的氨水，使发酵液的pH维持在6.7-7.0。
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