CN104357586B

CN104357586B - 基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素sv的发酵生产方法

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Publication number: CN104357586B
Application number: CN201410632469.7A
Authority: CN
Inventors: 史守坤; 刘爱军; 岳晓明
Original assignee: HEBEI XINGANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI XINGANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2014-11-11
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2034-11-11
Also published as: CN104357586A

Abstract

一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法，是由地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis？mediterranei)作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生成利福霉素SV的，具体工艺步骤包括斜面的制备工序、母瓶种子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、发酵制备工序，其特点是在母瓶种子制备工序，在母瓶培养基上添加1～2g/L的磷酸甜菜碱；在发酵制备工序，通过连续流加补料的方式即采用连续流加发酵控制磷酸甜菜碱浓度为0.4～0.5g/L，直到放罐终点。本发明的生产方法能够大幅度提升利福霉素SV的合成速率，提高了生产水平，同时降低了底物葡萄糖的消耗。

Description

基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法

技术领域

本发明涉及一种利福霉素SV的发酵生产方法，具体是一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法。

背景技术

利福霉素类抗生素是由地中海链丝菌产生的一类抗生素，它具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。对某些革兰氏阴性菌也有效。利福霉素类药物有：利福霉素B二乙酰胺、利福平等。目前在临床应用的有利福平、利福喷汀及利福布汀。利福霉素SV的生物合成是从七碳氨单位开始的，由两个乙酸单位和八个丙酸单位，利用I型聚酮酶(PKS)经过一系列缩聚反应首先合成利福霉素SV的聚酮链骨架，在经过一些后修饰反应合成完整的利福霉素SV。在聚酮链的修饰过程中，其中部分酶的编码基因已经被推定，但部分相关的编码基因可能并不存在于合成基因簇中，暂时无法确定。如最终的链的释放所需硫酯酶的编码基因，目前还无法确定。在该菌的基因工程研究中，相关资料已报道了利福霉素SV的部分合成基因簇和调控基因。不过这些基因的具体作用及相互关系还需要进一步的研究。为了提高利福霉素SV产量，强化参与生物合成途径的基因表达，在重组菌中增加基因拷贝数，是常用的一种手段。但利福霉素SV产量并没有得到明显增加。虽然在多个方面都进行了有益的尝试，但目前的研究并没有获得可用于实际生产的高产重组菌。在利福霉素SV次级代谢合成的众多步骤中都是通过转甲基作用进行的，转甲基作用的重要前体是S腺苷甲硫氨酸，因此S腺苷甲硫氨酸的快速合成在促进利福霉素SV合成的过程中起着非常重要的作用。

在现行的利福霉素SV批培养发酵工艺中，大多采pH、DO、温度等作为控制策略的依据和手段,也有很多研究从福霉素发酵过程的溶氧控制来进行发酵过程优化，并将活细胞传感仪用于发酵过程活菌体浓度的检测与控制，并通过控制搅拌转速和空气流量可以有效的控制供氧水平。

甜菜碱又名N,N,N-三甲基甘氨酸(分子式为C₅H₁₂NO₂)，广泛存在于动植物中，在微生物培养过程中，甜菜碱作为一种良好的渗透压调节剂被广泛使用，同时，甜菜碱在甲基化反应中具有重要的作用，它为甲硫氨酸的形成提供甲基。作为甲基供体，甜菜碱的分解情况见图1。

在甲基化反应中，甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基，分别形成二甲基甘氨酸(N,N-dimethylglycine)和甲硫氨酸。甲硫氨酸进一步形成胞内甲基化底物S腺苷甲硫氨酸。之前已报到的研究工作很少有关注甲基化前体供应情况对利福霉素SV合成的影响，也缺乏甜菜碱对菌体的动态生理代谢的影响，根本没有相关的最优化控制工艺的提出。

通过检索，发明人查到了以下相关专利文献：CN102197827A公开了一种甜菜碱复合制剂及用于提高作物抗逆性及产量中的应用，采用甜菜碱浓度为8-20g/L，以配制1000ml溶液为计量单位，依次称取七水合硫酸锌0.1-1g/L，氯化胆碱2-10g/L，L-萘乙酸0.05-0.5g/L，硼酸0.05-0.2g/L溶于水中，搅拌溶解后加入5-10ml吐温80，搅拌混匀制备获得甜菜碱复合制剂成品。CN102176892A公开了一种甜菜碱的应用，涉及甜菜碱保护皮肤使其免受生物刺激的应用，还涉及甜菜碱作为化妆和/或盥洗制剂中的保护剂的应用。

以上这些专利文献对于本发明如何能够大幅度提升利福霉素SV的合成速率，提高生产水平，并未给出具体的技术指导方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法，该生产方法能够大幅度提升利福霉素SV的合成速率，提高生产水平，同时降低底物葡萄糖的消耗。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法，是由地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生成利福霉素SV的，具体工艺步骤包括斜面的制备工序、母瓶种子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、发酵制备工序，其技术方案在于：在母瓶种子制备工序，在母瓶培养基上添加1～2g/L的磷酸甜菜碱(即每升母瓶培养基上添加1～2克的磷酸甜菜碱)；在发酵制备工序，通过连续流加补料的方式即采用连续流加发酵控制磷酸甜菜碱浓度为0.4～0.5g/L(即发酵罐中每升培养基水溶液中含有磷酸甜菜碱0.4～0.5克)，直到放罐终点。

上述技术方案中，在母瓶种子制备工序，母瓶培养基上可以添加1g/L的磷酸甜菜碱。在发酵制备工序，通过连续流加补料的方式控制磷酸甜菜碱浓度可以为0.5g/L，直到放罐终点。上述利福霉素SV的产物合成量≥7700U/mL--7900U/mL。

本发明从利福霉素次级代谢合成途径前体物质需求的角度研究了甲基化供体物质甜菜碱对发酵过程的影响，结果表明合适的磷酸甜菜碱的添加能提升利福霉素SV的发酵合成速率。

本发明从甲基化前体供应的角度研究了甜菜碱对利福霉素SV合成的影响，并提出了最优化控制工艺，弥补了以往研究的不足，进一步提升了利福霉素发酵水平，进一步促进了生产的稳定性以及产率的提升和纯度的增加，同时降低了生产成本。

以下为本发明的生产过程：

1、材料和方法

1.1、菌种和培养基

菌种：地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)由河北欣港药业有限公司提供。

种子培养基(g/L)：葡萄糖40g，蛋白胨20g，鱼粉4.6g，硝酸钾5.8g，碳酸钙2.6g，泡敌1mL，其中葡萄糖单独灭菌后加入培养基中。

原发酵培养基(g/L)：葡萄糖55g，蛋白胨10g，豆饼粉34g，鱼粉6.6g，硝酸钾10.6g，碳酸钙5.3g，泡敌1mL，其中葡萄糖单独灭菌后加入培养基中。

1.2仪器和试剂

仪器：发酵罐：上海国强生化装备有限责任公司15L和50L自动发酵罐；ExtralMAX30—LG过程质谱仪；国家生化工程中心Biostar软件包；722型紫外一可见分光光度计；旋转式摇床。

磷酸甜菜碱、盐酸甜菜碱、一水甜菜碱：山东祥维斯化学品有限公司生产。

1.3培养方法

利福霉素发酵采用三级发酵，其中包括二级种子发酵。

母瓶种子培养：在1L三角瓶中装种子培养基100mL，斜面接种后摇床培养，培养温度28℃，转速180—220rpm培养约30小时。

种子罐：15L种子罐中装量8L，将母瓶种子按10％-15％接种量接种，培养温度29℃，用转速和空气控制溶氧水平不低于35％，自然pH控制，培养周期约50小时。

发酵罐：50L发酵罐装量30L，用经过蒸汽灭菌的一种管道从15L种子罐中移种5L，温度控制在29℃，用转速和空气控制溶氧水平不低于35％，自然pH控制，过程中补加葡萄糖和水，培养周期约130-140小时。

1.4测定方法：

还原糖测定：DNS方法。

生物量测定：离线测定采用湿体积法，将10mL发酵液置于离心管，3000rpm离心15min，将离心上清倒入量筒，根据上清的体积计算出发酵液的体积。在线采用美国Aber公司的活细胞传感器，其原理是根据细胞在电场下被极化，形成多个电容，电容值的大小与活菌量成正比。所以，可以采用电容值大小来估计活菌的量。

效价测定：采用国家药典方法。

pH、DO在线测定：采用Mettler Toledo耐高温电极进行在线测定。

温度：铂温度电极在线测定。

进气和尾气中氧和二氧化碳的测定:采用美国Extrel过程质谱MAX300-LG对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分析。

氧消耗速率OUR和二氧化碳生成速率CER测定：OUR和CER的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。以进气和尾气中惰性气体N₂维持恒定建立平衡方程，求得OUR和CER。

甜菜碱的测定方法：高压液相色谱条件：色谱柱：菲罗门(luna SCX,250mm×4.6mm×5um)，流动相：甲醇:乙酸铵水溶液(0.01mol/L)＝100：900，流速：1.0ml/min，检测波长：220nm，柱温：45℃，进样量：20μl。

2、结果与讨论

2.1 不同类型的甜菜碱对利福霉素SV发酵的影响

在摇瓶发酵初始培养基中添加不同类型的甜菜碱，添加浓度为2g/L，并同时考察了胆碱对发酵的影响。将生长好的摇瓶种子按5％的接种量接种后进行发酵培养，130小时后放瓶进行发酵单位的测定，不添加甜菜碱的原始配方作为对照，每组5个平行进行发酵结果统计。实验结果见表1。

实验结果表明甜菜碱对利福霉素的合成有较好的促进作用，磷酸甜菜碱的添加效果好于一水甜菜碱和盐酸甜菜碱，远高于对照组，分别比对照组提升了12.8％、8.98％和7.51％。而且添加磷酸甜菜碱的情况下残糖的残余量较高，说明底物葡萄糖的消耗量减少，产物对底物的的得率系数高于对照组及其它两种甜菜碱类型。而胆碱对利福霉素SV的合成和转化率并没有明显的效果。

表1

2.2 磷酸甜菜碱添加浓度对利福霉素SV发酵合成的影响

在母瓶培养基上添加不同浓度的磷酸甜菜碱(0.5、1.0、2.0、3.0、5.0g/L)，考察其对利福霉素SV合成代谢的影响。实验结果见表2。实验结果表明当磷酸甜菜碱浓度添加为1.0g/L时，利福霉素的合成单位最高，达到了6246mg/L，比对照高出了13.17％,而随着磷酸甜菜碱浓度进一步增加到2.0g/L时菌浓明显增加，但3.0g/L以上的甜菜碱添加浓度并不利于生产菌的生长，但对利福霉素SV的合成也有一定的促进作用。

表2

2.3 50L发酵罐中磷酸甜菜碱的优化控制工艺

在50L发酵罐中进行利福霉素发酵，在初始培养基中添加1.0g/L的磷酸甜菜碱，同时通过连续流加考察了发酵过程中控制不同的甜菜碱残留浓度对利福霉素发酵的影响。研究了生产菌在不同磷酸甜菜碱添加模式下的代谢过程变化，整个过程中通过补加葡萄糖来维持一定的残糖浓度，使整个发酵过程处于非糖限制状态。实验结果见表3。实验结果表明：在50升发酵培养过程中，初始添加磷酸甜菜碱量为1.0g/L的实验组能够提升发酵单位6.24％以上，当通过连续补加维持其浓度在0.5g/L的情况下，136小时放罐单位能够达到7913.2mg/mL，与对照相比提升了13.25％以上，同时底物糖的消耗与对照相比降低了4.4％以上，可显著降低单位产物的生产成本。

表3

综上所述，本发明是一种利福霉素SV的发酵新方法，在发酵过程初始培养基中添加一定浓度的磷酸甜菜碱，在发酵过程中采用连续流加的方式来控制合适的残留浓度，提升了发酵产量，控制工艺简单，能够大幅度提升利福霉素SV的合成速率，提高了生产水平，同时降低了底物葡萄糖的消耗。

附图说明

图1为甜菜碱的分解情况简图。

具体实施方式

如图1所示，图1为甜菜碱的分解情况简图。

实施例1：本发明的利福霉素SV的发酵生产方法是由地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生成利福霉素SV的，具体工艺步骤包括斜面的制备工序、母瓶种子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、发酵制备工序。除母瓶种子制备工序、发酵制备工序有改进外，其它各工序为已有技术。本发明各工序进一步的工艺步骤如下：

(1)、斜面的制备工序：①母斜面制备：按无菌操作要求，用接种针挑取适量砂土种子，均匀涂在斜面培养基上，要求均匀、稀疏，便于挑选，于27.5±0.5℃恒温培养9～10天，待生长成熟后或生长正常，保存在2～5℃冰箱内备用。②子斜面制备：按无菌要求，用接种针挑选生长好的母斜面菌落，均匀划线于空白培养基上，菌丝要分布均匀，于27.5±0.5℃恒温培养6～7天，成熟后保存于2～5℃冰箱内备用。

(2)、母瓶种子制备工序：挑选合格的生产斜面种子，用接种铲铲取大小为1×23cm生长良好的斜面菌丝，接种于母瓶培养基内，母瓶培养基上添加1g/L的磷酸甜菜碱。置于转速220～240r/min摇瓶机上，在27.5±0.5℃条件下，培养48小时，挑选外观质量正常的同一菌种号的7瓶合并为1瓶母瓶种子。

(3)、一级种子制备工序：将母瓶种子以火焰法接种到一级种子罐中，接种后按1∶0.65vvm(V/V·min)通气比通入无菌空气，罐温30～28℃，罐压0.05Mpa，周期48～52小时。

(4)、二级种子制备工序：二级种子罐采用实罐消毒，消毒压力0.1Mpa，温度120℃，灭菌30分钟。消毒后当罐温降至30℃时将培养好的一级种子移入二级种子罐中，移种后通入无菌空气，按1∶0.78vvm通气比的通气量，罐压0.04～0.05Mpa，温度28～30℃，培养48～52小时。

(5)、发酵制备工序：在发酵制备工序，发酵罐(50L发酵罐装量30L)中每升培养基水溶液中含有(或者说包括)：葡萄糖70克、鱼粉5克、硝酸钾8克、蛋白胨8克、药媒4克、黄豆饼粉12克、碳酸钙5克、磷酸二氢钾0.2～0.3克、泡敌1～1.29毫升、氯化钴1毫克。发酵罐消毒采用碳源和氮源分消(可将葡萄糖、磷酸二氢钾放在一起单独消毒，此为已有技术)，然后合罐。上述各组分的投料方式是将上述各组分放入发酵罐内即可。当发酵罐温度降至30℃时,将培养好的二级种子移入发酵罐，移种后发酵罐发酵生产采取变温控制(温度进行波段控制，温度控制在30～25℃)，0～40小时温度为28～30℃(可选择29℃)，40小时以后温度为25～27℃(可选择26℃)，直至放罐，发酵罐的工作压力为0.01～0.03Mpa(可选择0.02Mpa)，发酵罐通气比(即每分钟内通过单位体积培养液的无菌空气体积比无菌压缩空气用量)为：1∶0.6～1vvm通气比，发酵周期为120～133小时。每8小时取无菌样检测pH值、糖、菌浓、镜检菌丝，40小时后开始测效价，90小时开始测滤速，100小时后停取无菌样。发酵完成后送到提炼车间进行提取。在发酵制备工序，通过连续流加补料的方式即采用连续流加发酵控制磷酸甜菜碱浓度为0.5g/L，直到放罐终点。

实施例2：本发明的利福霉素SV的发酵生产方法是由地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生成利福霉素SV的，具体工艺步骤包括斜面的制备工序、母瓶种子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、发酵制备工序。在母瓶种子制备工序，在母瓶培养基上添加2g/L的磷酸甜菜碱。；在发酵制备工序，通过连续流加补料的方式即采用连续流加发酵控制磷酸甜菜碱浓度为0.4g/L，直到放罐终点。其它同实施例1。

上述各实施例中，利福霉素SV的产物合成量≥7700U/mL--7900U/mL。

Claims

1.一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法，是由地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生成利福霉素SV的，具体工艺步骤包括斜面的制备工序、母瓶种子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、发酵制备工序，其特征在于：

在母瓶种子制备工序，在母瓶培养基上添加1~2 g/L的磷酸甜菜碱；在发酵制备工序，通过连续流加补料的方式即采用连续流加发酵控制磷酸甜菜碱浓度为0.4~0.5 g/L，直到放罐终点。

2.根据权利要求1所述的利福霉素SV的发酵生产方法，其特征在于，在母瓶种子制备工序，母瓶培养基上添加1g/L的磷酸甜菜碱。

3.根据权利要求1所述的利福霉素SV的发酵生产方法，其特征在于，在发酵制备工序，通过连续流加补料的方式控制磷酸甜菜碱浓度为0.5 g/L，直到放罐终点。

4.根据权利要求1所述的利福霉素SV的发酵生产方法，其特征在于，上述利福霉素SV的产物合成量为7700U/mL—7900U/mL。