CN112410270A - 利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法 - Google Patents
利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用兽疫链球菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法,本发明在培养基中引入了脱脂蚕蛹粉、鱼熔浆蛋白粉和产朊假丝酵母蛋白粉,利用这三种物质组成新的培养基配方,确认了利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例利,以此为基础,其大生产的发酵技术水平是32000μg/ml,处于国内领先水平。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域,特别是涉及一种利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法。
背景技术
利福霉素是由地中海拟无枝酸菌产生的一类安莎大环内酯类抗生素。这类抗生素的毒性低、疗效高且抗菌谱较广,广泛应用于治疗G+(革兰氏阳性菌)、结核病、麻风病和与艾滋病有关的分枝杆菌感染。
从20世纪50年代末期发现利福霉素之后,国际国内很多专家学者对其结构性质及其发酵工艺进行了大量的研究,促使其发酵单位有了很大的提升,但近年来我国利福霉素的工业化水平提高缓慢,主要原因是我国利福霉素的生产采用三级发酵模式,该方式存在如下问题:
1 目前,相关文献资料报道了国内利福霉素发酵单位一般在10000~20000μg/ml。各个利福霉素生产企业发酵技术水平差别较大。
2 现有技术中,利福霉素培养基的碳源主要采用葡萄糖,葡萄糖1)在培养基高温灭菌过程中容易被碳化;2)生产反应过程中易产生“美拉德反应”,即产生抑制菌体的有毒物质,从而影响发酵效价。
3 国内利福霉素发酵技术中,有些在培养基组成中加入了动物蛋白胨,发酵培养结束,发酵液中残留了部分动物蛋白,增加了发酵液的粘度,增加了该产品下游工艺提取和纯化的难度。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷,提供一种可有效提高发酵单位,同时降低生产成本,降低提取纯化难度的利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基发酵生产利福霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基,其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基,其中
所述一级培养基组成为:木薯淀粉28~32g/L、脱脂蚕蛹粉23~27g/L、鱼熔浆蛋白粉42~46g/L、玉米浆干粉53-57g/L、硫酸铵0.4~0.8g/L、轻质碳酸钙1~5g/L;
所述二级种子培养基的组成为:
木薯淀粉37~41g/L、脱脂蚕蛹粉24~28g/L、鱼熔浆蛋白粉43~48g/L、玉米浆干粉55~59g/L、硫酸铵0.5~0.9g/L、轻质碳酸钙1~5g/L;
所述发酵培养基的组成为:
木薯淀粉48~52g/L、脱脂蚕蛹粉20~24g/L、鱼熔浆蛋白粉31~35g/L、玉米浆干粉62~66g/L、产朊假丝酵母蛋白粉18~22g/L、硫酸铵0.5~0.9g/L、轻质碳酸钙1~5g/L、磷酸二氢钾0.1~0.5g/L、氯化钠0.002~0.006g/L、硫酸锌0.03~0.07g/L、硫酸亚铁0.1~0.5g/L、硫酸锰0.003~0.007g/L,椰油酰胺基丙基甜菜碱0.1~0.5g/L、硝酸钾0.2~0.6g/L、聚醚改性硅油2~6ml/L。
2、一种利用权利要求1所述培养基发酵生产利福霉素的培养方法,其特征在于其工艺步骤为:
1) 一级种子培养:先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行种子培养,至菌体浓度17~21%移种;
2) 二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,至菌体浓度18~22%移种;
3) 发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
3、按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述培养好的利福霉素摇瓶发酵液菌体浓度为22~26%;镜检无杂菌。
4、按照权利要求3所述的培养方法,其特征在于
所述一级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温27~28℃;空气流量20~40m3/h,搅拌转速60~80r/min;
所述二级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温27~28℃;空气流量40~60m3/h;搅拌转速60~80r/min;
所述发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.3-7.4;
b 温度:27~28℃;
c 搅拌转速:转速控制在80-100r/min;
d 压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.2-7.9;
f 空气流量:150~200m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
40h~120h:溶氧控制在40%以上。
5、按照权利要求3所述的培养方法,其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补丙酸铵、补水、补木薯淀粉,其中
a 补丙酸铵工艺控制:
发酵周期40h时,补入丙酸铵,控制其在发酵液中的浓度控制在0.01~0.05g/L。
b 补水工艺控制:
发酵时间在40~120h,当菌体浓度超过26%时,加入灭菌水,补入量以控制菌体浓度在22~25%为宜;
发酵时间在120h~发酵结束,加入灭菌水,补入量以控制发酵液体积为发酵罐的75-80%为宜;
c 补入木薯淀粉:
发酵40-120h,当总糖含量<10mg/100ml时,补入已灭菌的木薯淀粉溶液,使总糖的含量控制在10~15mg/100ml。
本发明的技术优势体现在:
1 本发明确认了利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。
众所周知,由于碳源和氮源在生物生长过程中有着十分重要的影响,尤其是培养基中碳氮比的影响极为明显。氮源过多,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累;氮源不足,则菌体繁殖量少,从而影响产量。碳源过多,则容易形成较低的pH;若碳源不足,易引起菌体衰老和自溶。另外碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质,直接影响菌体的生长和产物的形成。而且菌体在不同的生长阶段,其对碳氮比的最适要求也不一样。
本发明所用的地中海拟无枝酸菌属于放线菌,其碳氮比约为3-5:5-7,所以氮比就要相对高一些。本发明通过开展一些列研究,最终确认了利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例利,以此为基础,其大生产的发酵技术水平是32000μg/ml,处于国内领先水平。
2 本发明在培养基中引入了脱脂蚕蛹粉、鱼熔浆蛋白粉和产朊假丝酵母蛋白粉,这三种原料含有独特的氨基酸群。其中脱脂蚕蛹粉蛋白质含量高,氨基酸组成较好,蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸含量高,富含亮氨酸、异亮氨酸和B族维生素;鱼溶浆蛋白粉参与利福霉素生化合成过程中形成的大量游离氨基酸,如谷氨酸、脯氨酸,鱼溶浆蛋白粉中大量的未知生长因子,还有些寡肽和多肽在蛋白质代谢中发挥着重要作用;产朊假丝酵母蛋白粉中含有丰富的蛋白质、维生素和氨基酸,其氨基酸组成达到了联合国粮农组织推荐的理想氨基酸组成值。
依据利福霉素生化合成原理,本发明培养基配方中引入了上述三种关键有机氮源,它们能提供生物合成过程中所需的关键物质和营养物质,保证了利福霉素发酵的技术效果。
3 本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述,确认了利福霉素最佳的发酵工艺和控制参数。通过采用本工艺发酵生产利福霉素,发酵单位达到32000μg/ml以上,发酵技术水平处于国内领先水平。
4 本发明培养基中使用木薯淀粉代替葡萄糖,避免出现“美拉德反应”,从而提高了发酵效价。
5 采用本发明阐述的工艺生产利福霉素,同国内生产水平比较,发酵单位提高了45%,生产成本下降,提高了产品市场竞争力。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例中所用地中海拟无枝酸菌(菌种号:CGMCC4.5720),摇瓶发酵液质量要求为:pH6~7;菌体浓度25~30%;镜检无杂菌。
实施例1
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉28kg、脱脂蚕蛹粉24kg、鱼熔浆蛋白粉42kg、玉米浆干粉53kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙1kg。
一级种子培养:先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液40L接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温28℃;空气流量20m3/h,搅拌转速60r/min;至菌体浓度17%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:木薯淀粉370kg、脱脂蚕蛹粉270kg、鱼熔浆蛋白粉440kg、玉米浆干粉570kg、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙10kg。
二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温28℃;空气流量40m3/h;搅拌转速60r/min,菌体浓度至18%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉4800kg、脱脂蚕蛹粉2000kg、鱼熔浆蛋白粉3500kg、玉米浆干粉6500kg、产朊假丝酵母蛋白粉1800kg、硫酸铵50kg、轻质碳酸钙100kg、磷酸二氢钾10kg、氯化钠0.2kg、硫酸锌3kg、硫酸亚铁10kg、硫酸锰0.3kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱30kg、硝酸钾20kg、聚醚改性硅油200L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.3;
b 温度:28℃;
c 搅拌转速:转速控制在80r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.2;
f 空气流量:150m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h,溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32134μg/ml。
实施例2
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉29kg、脱脂蚕蛹粉24kg、鱼熔浆蛋白粉43kg、玉米浆干粉57kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙2kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液45L接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温27℃;空气流量25m3/h,搅拌转速65r/min;至菌体浓度18%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉380kg、脱脂蚕蛹粉240kg、鱼熔浆蛋白粉430kg、玉米浆干粉560kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙20kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温27℃;空气流量45m3/h;搅拌转速65r/min,菌体浓度至19%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉4900kg、脱脂蚕蛹粉2100kg、鱼熔浆蛋白粉3200kg、玉米浆干粉6300kg、产朊假丝酵母蛋白粉1900kg、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾20kg、氯化钠0.3kg、硫酸锌4kg、硫酸亚铁20kg、硫酸锰0.4kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱10kg、硝酸钾30kg、聚醚改性硅油300L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.3;
b 温度:27℃;
c 搅拌转速:转速控制在85r/min;
d 压力控制:罐压0.05MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.6;
f 空气流量:160m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32250μg/ml。
实施例3
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉30kg、脱脂蚕蛹粉23kg、鱼熔浆蛋白粉46kg、玉米浆干粉55kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙3kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液50L接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温28℃;空气流量30m3/h,搅拌转速70r/min;至菌体浓度19%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉390kg、脱脂蚕蛹粉260kg、鱼熔浆蛋白粉450kg、玉米浆干粉550kg、硫酸铵9kg、轻质碳酸钙30kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温28℃;空气流量45m3/h;搅拌转速70r/min,菌体浓度至20%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉5000kg、脱脂蚕蛹粉2200kg、鱼熔浆蛋白粉3300kg、玉米浆干粉6400kg、产朊假丝酵母蛋白粉2000kg、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙300kg、磷酸二氢钾30kg、氯化钠0.4kg、硫酸锌7kg、硫酸亚铁30kg、硫酸锰0.5kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱30kg、硝酸钾40kg、聚醚改性硅油400L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.4;
b 温度: 28℃;
c 搅拌转速:转速控制在90r/min;
d 压力控制:罐压0.05MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.5;
f 空气流量:180m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32408μg/ml。
实施例4
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉31kg、脱脂蚕蛹粉26kg、鱼熔浆蛋白粉45kg、玉米浆干粉56kg、硫酸铵0.4kg、轻质碳酸钙4kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液55L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温27℃;空气流量35m3/h,搅拌转速75r/min;至菌体浓度20%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉400kg、脱脂蚕蛹粉280kg、鱼熔浆蛋白粉470kg、玉米浆干粉590kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙40kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温27~28℃;空气流量55m3/h;搅拌转速75r/min,菌体浓度至21%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉5100kg、脱脂蚕蛹粉2300kg、鱼熔浆蛋白粉3400kg、玉米浆干粉6600kg、产朊假丝酵母蛋白粉2100kg、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙400kg、磷酸二氢钾40kg、氯化钠0.5kg、硫酸锌6kg、硫酸亚铁40kg、硫酸锰0.6kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱40kg、硝酸钾50kg、聚醚改性硅油500L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.3;
b 温度:27℃;
c 搅拌转速:转速控制在95r/min;
d 压力控制:罐压0.05MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.2;
f 空气流量:190m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32340μg/ml。
实施例5
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉32kg、脱脂蚕蛹粉27kg、鱼熔浆蛋白粉44kg、玉米浆干粉54kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙5kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液60L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温28℃;空气流量40m3/h,搅拌转速80r/min;至菌体浓度21%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉410kg、脱脂蚕蛹粉250kg、鱼熔浆蛋白粉480kg、玉米浆干粉580kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙50kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温28℃;空气流量60m3/h;搅拌转速80r/min,菌体浓度至22%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉5200kg、脱脂蚕蛹粉2400kg、鱼熔浆蛋白粉3100kg、玉米浆干粉6200kg、产朊假丝酵母蛋白粉2200kg、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙500kg、磷酸二氢钾50kg、氯化钠0.6kg、硫酸锌7kg、硫酸亚铁50kg、硫酸锰0.7kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱50kg、硝酸钾60kg、聚醚改性硅油600L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.4;
b 温度:28℃;
c 搅拌转速:转速控制在100r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.8;
f 空气流量:200m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32416μg/ml。
实施例6
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉28kg、脱脂蚕蛹粉27kg、鱼熔浆蛋白粉46kg、玉米浆干粉57kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙5kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液50L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温28℃;空气流量30m3/h,搅拌转速80r/min;至菌体浓度29%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉370kg、脱脂蚕蛹粉280kg、鱼熔浆蛋白粉480kg、玉米浆干粉590kg、硫酸铵7kg、轻质碳酸钙40kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温27℃;空气流量45m3/h;搅拌转速70r/min,菌体浓度至20%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉4800kg、脱脂蚕蛹粉2400kg、鱼熔浆蛋白粉3500kg、玉米浆干粉6600kg、产朊假丝酵母蛋白粉2200kg、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙400kg、磷酸二氢钾30kg、氯化钠0.4kg、硫酸锌5kg、硫酸亚铁20kg、硫酸锰0.3kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱30kg、硝酸钾40kg、聚醚改性硅油500L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.3;
b 温度: 28℃;
c 搅拌转速:转速控制在90r/min;
d 压力控制:罐压0.05MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.9;
f 空气流量:180m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32107μg/ml。
实施例7
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉32kg、脱脂蚕蛹粉23kg、鱼熔浆蛋白粉42kg、玉米浆干粉53kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙2kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液40L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温28℃;空气流量35m3/h,搅拌转速65r/min;至菌体浓度19%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉410kg、脱脂蚕蛹粉240kg、鱼熔浆蛋白粉430kg、玉米浆干粉550kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙20kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温27℃;空气流量45m3/h;搅拌转速60r/min,菌体浓度至19%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉5200kg、脱脂蚕蛹粉2000kg、鱼熔浆蛋白粉3100kg、玉米浆干粉6200kg、产朊假丝酵母蛋白粉1800kg、硫酸铵50kg、轻质碳酸钙100kg、磷酸二氢钾10kg、氯化钠0.1kg、硫酸锌1kg、硫酸亚铁10kg、硫酸锰0.3kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱10kg、硝酸钾20kg、聚醚改性硅油200L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.4;
b 温度: 28℃;
c 搅拌转速:转速控制在80r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.5;
f 空气流量:150m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32197μg/ml。
实施例8
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉29kg、脱脂蚕蛹粉26kg、鱼熔浆蛋白粉45kg、玉米浆干粉56kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙4kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液45L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温28℃;空气流量25m3/h,搅拌转速70r/min;至菌体浓度20%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉380kg、脱脂蚕蛹粉270kg、鱼熔浆蛋白粉470kg、玉米浆干粉580kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙40kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。
二级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温27℃;空气流量50m3/h;搅拌转速65r/min,菌体浓度至18%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉4900kg、脱脂蚕蛹粉2300kg、鱼熔浆蛋白粉3400kg、玉米浆干粉6500kg、产朊假丝酵母蛋白粉2100kg、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾50kg、氯化钠0.6kg、硫酸锌7kg、硫酸亚铁50kg、硫酸锰0.7kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱40kg、硝酸钾50kg、聚醚改性硅油500L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.4;
b 温度: 28℃;
c 搅拌转速:转速控制在85r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.8;
f 空气流量:160m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32243μg/ml。
实施例9
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:木薯淀粉31kg、脱脂蚕蛹粉23kg、鱼熔浆蛋白粉43kg、玉米浆干粉54kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙2kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液48L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。
一级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温28℃;空气流量30m3/h,搅拌转速70r/min;至菌体浓度17%移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:木薯淀粉400kg、脱脂蚕蛹粉250kg、鱼熔浆蛋白粉440kg、玉米浆干粉560kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙10kg。
二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。二级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温28℃;空气流量55m3/h;搅拌转速60r/min,菌体浓度至19%移种。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:木薯淀粉5100kg、脱脂蚕蛹粉2100kg、鱼熔浆蛋白粉3200kg、玉米浆干粉6300kg、产朊假丝酵母蛋白粉1900kg、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙300kg、磷酸二氢钾20kg、氯化钠0.4kg、硫酸锌5kg、硫酸亚铁20kg、硫酸锰0.3kg,椰油酰胺基丙基甜菜碱30kg、硝酸钾30kg、聚醚改性硅油400L。
发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.4;
b 温度: 28℃;
c 搅拌转速:转速控制在85r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.2;
f 空气流量:170m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
发酵40h~120h:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,利福霉素化学效价32306μg/ml。
上述实施例1-9的发酵过程中,根据检测情况,发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补丙酸铵、补水、补木薯淀粉,其中
a 补丙酸铵工艺控制:
发酵周期40h时,补入丙酸铵,发酵液中的浓度控制在0.05g/L。
b 补水工艺控制:
发酵时间在40~120h,当菌体浓度超过26%,加入灭菌水,水的用量以控制菌体浓度22-25%为宜。
发酵时间在120h~发酵结束,加入灭菌水,水的用量以控制发酵液体积为发酵罐的78%为宜。
c 补入木薯淀粉:
发酵40-120h,当总糖含量<10mg/100ml时,补入已灭菌的木薯淀粉溶液,使总糖的含量控制在13mg/100ml。
对比实施例1
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:葡萄糖31kg、黄豆饼粉38kg、酵母提取物25kg、玉米浆49kg、硫酸铵0.3kg、轻质碳酸钙3kg。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:葡萄糖400kg、黄豆饼粉360kg、酵母提取物265kg、玉米浆500kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙20kg。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:葡萄糖6000kg、黄豆饼粉膏3900kg、酵母提取物2700kg、玉米浆4800kg、鱼粉1400kg、硫酸铵40kg、轻质碳酸钙300kg、磷酸二氢钾35kg、氯化钠0.5kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁40kg、氯化锰0.5kg,硅油消泡剂400L。
采用实施例7提供的生产工艺,发酵结束,利福霉素化学效价19550μg/ml。
对比实施例2
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:麦芽浸粉20kg,葡萄糖25kg、牛肉膏36kg、酵母粉28kg、玉米浆54kg、硫酸铵0.4kg、轻质碳酸钙3kg。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:麦芽浸粉210kg,葡萄糖260kg、牛肉膏350kg、酵母粉270kg、玉米浆560kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙40kg。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:麦芽浸粉2200kg,葡萄糖2800kg、牛肉膏3600kg、酵母粉2700kg、玉米浆5500kg、蛋白胨1100kg,硫酸铵40kg、轻质碳酸钙250kg、磷酸二氢钾40kg、氯化钠0.5kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁40kg、氯化锰0.6kg,硅油消泡剂40L。
采用实施例7提供的生产工艺,发酵结束,利福霉素化学效价18330μg/ml。
Claims (5)
1.一种利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基,其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基,其中
所述一级培养基组成为:木薯淀粉28~32g/L、脱脂蚕蛹粉23~27g/L、鱼熔浆蛋白粉42~46g/L、玉米浆干粉53-57g/L、硫酸铵0.4~0.8g/L、轻质碳酸钙1~5g/L;
所述二级种子培养基的组成为:
木薯淀粉37~41g/L、脱脂蚕蛹粉24~28g/L、鱼熔浆蛋白粉43~48g/L、玉米浆干粉55~59g/L、硫酸铵0.5~0.9g/L、轻质碳酸钙1~5g/L;
所述发酵培养基的组成为:
木薯淀粉48~52g/L、脱脂蚕蛹粉20~24g/L、鱼熔浆蛋白粉31~35g/L、玉米浆干粉62~66g/L、产朊假丝酵母蛋白粉18~22g/L、硫酸铵0.5~0.9g/L、轻质碳酸钙1~5g/L、磷酸二氢钾0.1~0.5g/L、氯化钠0.002~0.006g/L、硫酸锌0.03~0.07g/L、硫酸亚铁0.1~0.5g/L、硫酸锰0.003~0.007g/L,椰油酰胺基丙基甜菜碱0.1~0.5g/L、硝酸钾0.2~0.6g/L、聚醚改性硅油2~6ml/L。
2.一种利用权利要求1所述培养基发酵生产利福霉素的培养方法,其特征在于其工艺步骤为:
1) 一级种子培养:先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的利福霉素摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行种子培养,至菌体浓度17~21%移种;
2) 二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,至菌体浓度18~22%移种;
3) 发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至利福霉素化学效价>32000μg/ml时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述培养好的利福霉素摇瓶发酵液菌体浓度为22~26%;镜检无杂菌。
4.按照权利要求3所述的培养方法,其特征在于
所述一级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温27~28℃;空气流量20~40m3/h,搅拌转速60~80r/min;
所述二级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温27~28℃;空气流量40~60m3/h;搅拌转速60~80r/min;
所述发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.3-7.4;
b 温度:27~28℃;
c 搅拌转速:转速控制在80-100r/min;
d 压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在7.2-7.9;
f 空气流量:150~200m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前40h,不控制溶氧;
40h~120h:溶氧控制在40%以上。
5.按照权利要求3所述的培养方法,其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补丙酸铵、补水、补木薯淀粉,其中
a 补丙酸铵工艺控制:
发酵周期40h时,补入丙酸铵,控制其在发酵液中的浓度控制在0.01~0.05g/L;
b 补水工艺控制:
发酵时间在40~120h,当菌体浓度超过26%时,加入灭菌水,补入量以控制菌体浓度在22~25%为宜;
发酵时间在120h~发酵结束,加入灭菌水,补入量以控制发酵液体积为发酵罐的75-80%为宜;
c 补入木薯淀粉:
发酵40-120h,当总糖含量<10mg/100ml时,补入已灭菌的木薯淀粉溶液,使总糖的含量控制在10~15mg/100ml。
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