CN111484959A - 一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基和培养方法 - Google Patents

一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基和培养方法，本发明确认了刺糖多孢菌以三级发酵模式发酵生产多杀菌素的一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。利用本发明中提供的培养基配方和发酵控制工艺，能够提高米多杀菌素发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现多杀菌素稳定、高效的生产。

Description

一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基和培养方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基和培养方法。
背景技术
多杀菌素是刺糖多孢菌有氧发酵的胞内次级代谢产物，成品为白色或浅灰白色的固体结晶，是多杀菌素A组份和多杀菌素D组份的混合物。多杀菌素是一种新型的具有触杀及摄食毒性的广谱生物杀虫剂，为微生物源生物化学农药。由于多杀菌素具有的低毒、低残留等特点，美国环保局把多杀菌素归类为低风险杀虫剂产品，并在1999年授予其美国“总统绿色化学品挑战奖”。目前，多杀菌素已成为国内研究开发的热点。
目前，国内对于多杀菌素的发酵生产普遍采用三级发酵模式，具体工艺是：多杀菌素生产菌种经摇瓶培养，接入一级种子罐进行培养，符合移种条件后转入二级种子罐进行培养，菌体浓度达到20～40%后，接入发酵罐进行发酵培养，当发酵单位达到6g/L左右，停止发酵。该方式存在的主要问题有以下几点：
1发酵技术水平较低，其发酵水平维持在6g/L左右。
2 国内生产企业普遍使用葡萄糖作为碳源发酵生产多杀菌素。由于葡萄糖高温条件下容易碳化，含葡萄糖的培养基经高温灭菌后，容易产生有害物质，影响了多杀菌素生产菌种的发酵技术水平。
3 多杀菌素培养基中的碳源是葡萄糖，氮源主要是黄豆饼粉、棉籽饼粉、酵母粉或蛋白胨或牛肉膏，造成发酵生产成本较高。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种能够有效提高发酵水平，降低生产成本，实现多杀菌素稳定、高效生产的利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基。
本发明的另一目的是提供上述利用培养基制备多杀菌素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
糖蜜粉30～35kg/m3、大豆糖蜜14～18kg/m3、肉骨粉12～16 kg/m3、水解羽毛粉16～20kg/m3、玉米浸粉18～22kg/m3、硫酸铵0.4～0.8kg/m3、轻质碳酸钙1～5kg/m3；
所述二级种子培养基的组成为：
糖蜜粉40～50kg/m3、大豆糖蜜16～20kg/m3、肉骨粉14～18 kg/m3、水解羽毛粉19～23kg/m3、玉米浸粉24～28kg/m3、硫酸铵0.6～1kg/m3、轻质碳酸钙1～5kg/m3；
所述发酵培养基的组成为：
糖蜜粉50～55kg/m3、大豆糖蜜18～22kg/m3、肉骨粉17～21kg/m3、水解羽毛粉20～24kg/m3、玉米浸粉26～30kg/m3、细菌蛋白胨4～8kg/m3、硫酸铵0.6～1kg/m3、轻质碳酸钙1～5kg/m3、磷酸二氢钾0.09～0.13kg/m3、硫酸镁0.03～0.07kg/m3、硫酸亚铁0.06～0.1kg/m3、氯化钴0.01～0.03kg/m3、HYF水性消泡剂4～8L/m3。
一种利用上述培养基发酵生产多杀菌素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4～6.6，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度10～20%移种；
2） 二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4～6.8，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度20～25%时移入发酵培养基；
3） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.4～6.8，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至化学效价＞8g/L时终止发酵。
所述一级种子培养条件为：
罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌，6h～移种：60～80r/min；空气流速：20～40m3/h。
所述二级种子培养条件为：
罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量60～80m3/h；搅拌转速70～90r/min。
发酵培养条件为：
a pH：发酵过程中pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺，
发酵时间0～17h：转速控制0r/min，
发酵时间18～52h：转速控制在60～80r/min，
发酵时间53～96h：转速控制在100～120r/min，
发酵时间97h～发酵结束：转速控制在140～160r/min；
d 压力控制：罐压0.02～0.06MPa；
e 空气流量：
发酵时间0～48h：100～150m3/h，
发酵时间49h～发酵结束：200～300m3/h；
f 溶氧控制：
发酵前48h内，不控制溶氧，
发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。
所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a补水工艺控制：
当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在30～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
b 发酵过程pH控制工艺：
发酵前48h，pH不进行控制，
发酵时间在49h～发酵结束，若pH＜5，加入质量浓度10～20%的氢氧化钠，调节pH6～7；若pH＞7，加入质量浓度30%的硫酸溶液，调节pH至6～7；
c 补入糖蜜粉：
发酵201h至发酵结束：当总糖含量＜5%时，补入已灭菌的质量浓度10～20%糖蜜粉溶液，使总糖的含量控制在5～8%，
上述糖蜜粉溶液中加入蔗糖转化酶，其浓度控制在0.001～0.003%；
d 补硫酸铵：
发酵液中氨氮含量＜0.5%时，补入已灭菌的20-30%硫酸铵溶液，使氨氮的含量控制在0.6～1.0%。
本发明中刺糖多孢菌使用目前公开文献公开的、企业普遍使用的或者市面上可以购买到的菌株。
本发明的技术优势体现在：
1 采用糖蜜粉替代葡萄糖，避免了培养基高温消毒带来的不利因素。
2 采用糖蜜粉代替葡萄糖；肉骨粉、水解羽毛粉、玉米浸粉和大豆蛋白胨替代黄豆饼粉、棉籽饼粉、牛肉膏或蛋白胨或酵母粉，降低了培养基成本。
3 本发明确认了发酵生产多杀菌素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特别是发酵培养基中添加了肉骨粉、水解羽毛粉、玉米浸粉和大豆蛋白胨，这四种物质中含有生物合成多杀菌素的关键氨基酸，保证了多杀菌素的发酵技术效果。
4 本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了多杀菌素素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产多杀菌素，其发酵单位达到7.5g/L以上，同国内技术相比，发酵单位提高了25%以上。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用刺糖多孢菌LWL-SS：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
下述实施例中，HYF水性消泡剂来源于南京恒耀高分子材料科技有限公司。
下述实施例中使用的玉米浸粉是玉米经洗涤、中温浸润、水提、酶解、超滤、浓缩、喷雾干燥而得。
下述实施例中，摇瓶发酵液的接种量按照常规技术的接种量，通常为1-2L/m3。
实施例1
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉30kg、大豆糖蜜14kg、肉骨粉14kg、水解羽毛粉18kg、玉米浸粉20kg、硫酸铵0.4kg、轻质碳酸钙1kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：60r/min；空气流速20m3/h，至菌体浓度10%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉225kg、大豆糖蜜90kg、肉骨粉80kg、水解羽毛粉95kg、玉米浸粉120kg、硫酸铵3kg、轻质碳酸钙5kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量60m3/h；搅拌转速70r/min。至菌体浓度20%时停止培养。
发酵培养：
发酵培养基组成：糖蜜粉2500kg、大豆糖蜜950kg、肉骨粉900kg、水解羽毛粉1000kg、玉米浸粉1300kg、细菌蛋白胨200kg、硫酸铵30kg、轻质碳酸钙50kg、磷酸二氢钾5kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁3.5kg、氯化钴0.5kg、HYF水性消泡剂200L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.4，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在60r/min，发酵时间11～48h：转速控制在100r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在140r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：100m3/h，发酵时间49h～发酵结束：200m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.2g/L时停止发酵。
实施例2
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉31kg、大豆糖蜜15kg、肉骨粉12kg、水解羽毛粉16kg、玉米浸粉18kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙2kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.5，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：65r/min；空气流速25m3/h，至菌体浓度12%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉200kg、大豆糖蜜80kg、肉骨粉70kg、水解羽毛粉100kg、玉米浸粉125kg、硫酸铵3.5kg、轻质碳酸钙10kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.5，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量65m3/h；搅拌转速75r/min。至菌体浓度22%时停止培养。
发酵培养：
发酵培养基组成：糖蜜粉2550kg、大豆糖蜜1000kg、肉骨粉950kg、水解羽毛粉1050kg、玉米浸粉1350kg、细菌蛋白胨250kg、硫酸铵35kg、轻质碳酸钙100kg、磷酸二氢钾5.5kg、硫酸镁2.5kg、硫酸亚铁4kg、氯化钴0.75kg、HYF水性消泡剂250L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在65r/min，发酵时间11～48h：转速控制在105r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在145r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：110m3/h，发酵时间49h～发酵结束：220m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.5g/L时停止发酵。
实施例3
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉33kg、大豆糖蜜16kg、肉骨粉13kg、水解羽毛粉17kg、玉米浸粉19kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙3kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.6，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：70r/min；空气流速30m3/h，至菌体浓度15%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉210kg、大豆糖蜜85kg、肉骨粉75kg、水解羽毛粉105kg、玉米浸粉130kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙15kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.6，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量70m3/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度25%时停止培养。
发酵培养
发酵培养基组成：糖蜜粉2650kg、大豆糖蜜900kg、肉骨粉850kg、水解羽毛粉1100kg、玉米浸粉1400kg、细菌蛋白胨300kg、硫酸铵40kg、轻质碳酸钙150kg、磷酸二氢钾4.5kg、硫酸镁1.5kg、硫酸亚铁3kg、氯化钴1kg、HYF水性消泡剂300L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.6，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在70r/min，发酵时间11～48h：转速控制在110r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在150r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：130m3/h，发酵时间49h～发酵结束：250m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.8g/L时停止发酵。
实施例4
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉34kg、大豆糖蜜17kg、肉骨粉16kg、水解羽毛粉20kg、玉米浸粉22kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙4kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.7，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：75r/min；空气流速35m3/h，至菌体浓度18%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉250kg、大豆糖蜜100kg、肉骨粉90kg、水解羽毛粉110kg、玉米浸粉135kg、硫酸铵4.5kg、轻质碳酸钙20kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.7，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量75m3/h；搅拌转速85r/min。至菌体浓度27%时停止培养。
发酵培养
发酵培养基组成：糖蜜粉2700kg、大豆糖蜜1050kg、肉骨粉1000kg、水解羽毛粉1150kg、玉米浸粉1500kg、细菌蛋白胨400kg、硫酸铵50kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾6kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁4.5kg、氯化钴1.25kg、HYF水性消泡剂350L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.7，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在75r/min，发酵时间11～48h：转速控制在115r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在155r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：140m3/h，发酵时间49h～发酵结束：280m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.7g/L时停止发酵。
实施例5
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉35kg、大豆糖蜜14kg、肉骨粉14kg、水解羽毛粉19kg、玉米浸粉21kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙5kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.7，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：80r/min；空气流速40m3/h，至菌体浓度20%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉240kg、大豆糖蜜95kg、肉骨粉85kg、水解羽毛粉115kg、玉米浸粉140kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙25kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.8，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量80m3/h；搅拌转速90r/min。至菌体浓度30%时停止培养。
发酵培养
发酵培养基组成：糖蜜粉2750kg、大豆糖蜜1100kg、肉骨粉1050kg、水解羽毛粉1200kg、玉米浸粉1450kg、细菌蛋白胨350kg、硫酸铵45kg、轻质碳酸钙250kg、磷酸二氢钾6.5kg、硫酸镁3.5kg、硫酸亚铁5kg、氯化钴1.5kg、HYF水性消泡剂400L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.8，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在80r/min，发酵时间11～48h：转速控制在120r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在160r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：150m3/h，发酵时间49h～发酵结束：300m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.5g/L时停止发酵。
实施例6
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉32kg、大豆糖蜜14kg、肉骨粉15kg、水解羽毛粉20kg、玉米浸粉22kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙5kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：70r/min；空气流速30m3/h，至菌体浓度13%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉200kg、大豆糖蜜80kg、肉骨粉80kg、水解羽毛粉110kg、玉米浸粉140kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙25kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.6，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量75m3/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度23%时停止培养。
发酵培养
发酵培养基祖成：糖蜜粉2500kg、大豆糖蜜900kg、肉骨粉1000kg、水解羽毛粉1100kg、玉米浸粉1400kg、细菌蛋白胨400kg、硫酸铵45kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾6kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁5kg、氯化钴1.4kg、HYF水性消泡剂380L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.8，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在80r/min，发酵时间11～48h：转速控制在110r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在150r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：140m3/h，发酵时间49h～发酵结束：290m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.1g/L时停止发酵。
实施例7
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉35kg、大豆糖蜜19kg、肉骨粉14kg、水解羽毛粉16kg、玉米浸粉18kg、硫酸铵0.4kg、轻质碳酸钙3kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.5，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：65r/min；空气流速25m3/h，至菌体浓度16%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉250kg、大豆糖蜜100kg、肉骨粉70kg、水解羽毛粉95kg、玉米浸粉120kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙23kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.7，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量70m3/h；搅拌转速75r/min。至菌体浓度27%时停止培养。
发酵培养
发酵培养基组成：糖蜜粉2750kg、大豆糖蜜1100kg、肉骨粉850kg、水解羽毛粉1000kg、玉米浸粉1300kg、细菌蛋白胨200kg、硫酸铵30kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾5kg、硫酸镁2.8kg、硫酸亚铁4.6kg、氯化钴1.3kg、HYF水性消泡剂370L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.7，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在70r/min，发酵时间11～48h：转速控制在120r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在140r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：130m3/h，发酵时间49h～发酵结束：270m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.5g/L时停止发酵。
实施例8
一级种子培养：
一级种子培养基组成：糖蜜粉30kg、大豆糖蜜14kg、肉骨粉16kg、水解羽毛粉20kg、玉米浸粉22kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙5kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.8，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液按照2.5L的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：70r/min；空气流速30m3/h，至菌体浓度13%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：糖蜜粉200kg、大豆糖蜜80kg、肉骨粉90kg、水解羽毛粉115kg、玉米浸粉140kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙20kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量80m3/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度24%时停止培养。
发酵培养
发酵培养基组成：糖蜜粉2500kg、大豆糖蜜900kg、肉骨粉1050kg、水解羽毛粉1200kg、玉米浸粉1500kg、细菌蛋白胨400kg、硫酸铵40kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾5.5kg、硫酸镁2.8kg、硫酸亚铁4.4kg、氯化钴1.4kg、HYF水性消泡剂400L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在75r/min，发酵时间11～48h：转速控制在110r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在150r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：130m3/h，发酵时间49h～发酵结束：270m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。多杀菌素含量达到8.3g/L时停止发酵。
上述实施例1～8中，补料的发酵过程中，根据检测情况，采用流加法进行补料，补料包括补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a补水工艺控制：
当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在30～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度。
b 发酵过程pH控制工艺：
发酵前48h，pH不进行控制，
发酵时间在49h～发酵结束，若pH＜5，加入10～20%的氢氧化钠，调节pH控至6～7；若pH＞7，加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～7；
c 补入糖蜜粉：
发酵201h至发酵结束：总糖含量＜5%时，补入已灭菌的10～20%糖蜜粉溶液，使总糖的含量控制在5～8%，
上述糖蜜粉溶液中加入蔗糖转化酶，其浓度控制在0.001～0.003%；
d 补硫酸铵：
在发酵180h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
对比实施例（培养工艺及控制参数、补料控制均依据实施例3）
对比实施例1
一级种子培养：
一级种子培养基组成：可溶性淀粉50kg、豆饼粉17kg、棉籽饼粉21kg、玉米浆20kg、硫酸铵0.3kg、轻质碳酸钙2kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.5，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：70r/min；空气流速30m3/h，至菌体浓度15%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：可溶性淀粉320kg、豆饼粉90kg、棉籽饼粉80kg、玉米浆105kg、酵母提取物130kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙15kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.3，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量70m3/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度22%时停止培养。
发酵培养：
发酵培养基祖成：可溶性淀粉3100kg、豆饼粉950kg、棉籽饼粉1100kg、玉米浆1400kg、酵母提取物300kg、硫酸铵30kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾5.5kg、硫酸镁2.5kg、硫酸亚铁4kg、氯化钴1kg、HYF水性消泡剂300L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.2，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在70r/min，发酵时间11～48h：转速控制在110r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在150r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：130m3/h，发酵时间49h～发酵结束：250m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。发酵培养结束，多杀菌素含量达到5.7g/L。
对比实施例2
一级种子培养：
一级种子培养基组成：玉米粉40kg、葡萄糖15kg、豆饼粉18kg、棉籽饼粉20kg、玉米浆19kg、硫酸铵0.4kg、轻质碳酸钙2kg；加水至1m3。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.8，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.05MPa，罐温27～28℃，搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：70r/min；空气流速30m3/h，至菌体浓度17%，停止培养。
二级种子培养：
二级种子培养基组成：玉米粉210kg、葡萄糖80kg、豆饼粉95kg、棉籽饼粉83kg、玉米浆102kg、酵母提取物125kg、硫酸铵3kg、轻质碳酸钙10kg，加水至5m3。
二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.3，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量70m3/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度26%时停止培养。
发酵培养
发酵培养基祖成：玉米粉2200kg、葡萄糖900kg、豆饼粉900kg、棉籽饼粉1200kg、玉米浆1300kg、酵母膏270kg、硫酸铵30kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾5.5kg、硫酸镁2.8kg、硫酸亚铁3.5kg、氯化钴0.8kg、HYF水性消泡剂320L，加水至50m3。
先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.3，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。发酵过程中pH控制在6～7；培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，发酵时间0～6h：转速控制0r/min，发酵时间7～10h：转速控制在80r/min，发酵时间11～48h：转速控制在110r/min，发酵时间49h～发酵结束：转速控制在150r/min；罐压0.02～0.06MPa；空气流量：时间0～48h：140m3/h，发酵时间49h～发酵结束：270m3/h；发酵前48h内，不控制溶氧，发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。发酵培养结束，多杀菌素含量达到5.5g/L。

Claims (6)

1.一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
糖蜜粉30～35kg/m3、大豆糖蜜14～18kg/m3、肉骨粉12～16 kg/m3、水解羽毛粉16～20kg/m3、玉米浸粉18～22kg/m3、硫酸铵0.4～0.8kg/m3、轻质碳酸钙1～5kg/m3；
所述二级种子培养基的组成为：
糖蜜粉40～50kg/m3、大豆糖蜜16～20kg/m3、肉骨粉14～18 kg/m3、水解羽毛粉19～23kg/m3、玉米浸粉24～28kg/m3、硫酸铵0.6～1kg/m3、轻质碳酸钙1～5kg/m3；
所述发酵培养基的组成为：
糖蜜粉50～55kg/m3、大豆糖蜜18～22kg/m3、肉骨粉17～21kg/m3、水解羽毛粉20～24kg/m3、玉米浸粉26～30kg/m3、细菌蛋白胨4～8kg/m3、硫酸铵0.6～1kg/m3、轻质碳酸钙1～5kg/m3、磷酸二氢钾0.09～0.13kg/m3、硫酸镁0.03～0.07kg/m3、硫酸亚铁0.06～0.1kg/m3、氯化钴0.01～0.03kg/m3、HYF水性消泡剂4～8L/m3。
2.一种利用权利要求1所述的培养基发酵生产多杀菌素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4～6.6，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的刺糖多孢菌摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度10～20%移种；
2） 二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，pH控制在6.4～6.8，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度20～25%时移入发酵培养基；
3） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，pH控制在6.4～6.8，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至化学效价＞8g/L时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为：
罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；搅拌转速：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌，6h～移种：60～80r/min；空气流速：20～40m3/h。
4.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述二级种子培养条件为：
罐压0.02～0.05MPa；罐温27～28℃；空气流量60～80m3/h；搅拌转速70～90r/min。
5.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为：
a pH：发酵过程中pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺，
发酵时间0～17h：转速控制0r/min，
发酵时间18～52h：转速控制在60～80r/min，
发酵时间53～96h：转速控制在100～120r/min，
发酵时间97h～发酵结束：转速控制在140～160r/min；
d 压力控制：罐压0.02～0.06MPa；
e 空气流量：
发酵时间0～96h：100～150m3/h，
发酵时间97h～发酵结束：200～300m3/h；
f 溶氧控制：
发酵前48h内，不控制溶氧，
发酵时间48h～发酵结束：溶氧控制在25%以上。
6.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a补水工艺控制：
当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在30～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
b 发酵过程pH控制工艺：
发酵前48h，pH不进行控制，
发酵时间在53h～发酵结束，若pH＜5，加入质量浓度10～20%的氢氧化钠，调节pH6～7；若pH＞7，加入质量浓度30%的硫酸溶液，调节pH至6～7；
c 补入糖蜜粉：
当总糖含量＜1%时，补入已灭菌的质量浓度10～20%糖蜜粉溶液，使总糖的含量控制在1～1.5%，
上述糖蜜粉溶液中加入蔗糖转化酶，其浓度控制在0.001～0.003%；
d 补硫酸铵：
发酵液中氨氮含量＜0.5%时，补入已灭菌的20-30%硫酸铵溶液，使氨氮的含量控制在0.6～1.0%。
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