CN105754913B - 一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法 - Google Patents

一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法，利用本发明中提供的种子培养基、发酵培养基配方和控制工艺，能够提高林可霉素大生产发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现林可霉素高效的生产。

Description

一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法。
背景技术
林可霉素又称林肯霉素、洁霉素，是由林可链霉菌通过好氧发酵产生的一种广谱抗生素，属于林克胺类素。作用于敏感菌核糖体的50S亚基，阻止肽链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成，对多数革兰阳性菌有较强抗菌活性，尤其对金葡菌和肺炎链球菌等敏感，由于其组织渗透性好，耐药性发展缓慢，对呼吸系统、骨骼和软骨组织的感染有较好疗效，而且毒性较低，是临床中一种重要的抗生素。
国内采用三级发酵模式生产林可霉素摇，其存在的主要问题：
1培养基加入了葡萄糖，部分葡萄糖在高温灭菌的条件下容易碳化，培养基溶液颜色变深，降低了培养质量。
2 国内相关文献报道了林可霉素种子培养基、发酵培养基配方和培养工艺的部分内容，但不能实现工业化大生产。
3 国内部分林可霉素发酵生产工艺中加入氨基酸，影响了发酵液质量，不利于脱色处理。
4 国内林可霉素生产效价一般维持在9000u/ml左右，效价较低。
5 林可霉素发酵培养的周期较长，一般在160h左右。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种林可霉素发酵培养基配方，有效提高林可霉素发酵质量和大生产发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对培养基的影响，缩短发酵周期，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现林可霉素工业化大生产，提高产品市场竞争力。
本发明的另一目的是提供一种林可霉素发酵生产的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述
一级种子培养基组成为：
小麦麸皮14-18g/L、麦芽糖6-10g/L、蚯蚓粉3-7g/L、丝素粉4-8g/L、玉米浆7-12ml/L、生物素0.08-0.12g/L、尿素0.04-0.8g/L、轻质碳酸钙1-5g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L；
二级种子培养基组成为：
小麦麸皮20-24g/L、麦芽糖9-13g/L、蚯蚓粉6-10g/L、丝素粉8-12g/L、干酪素7-11g/L、玉米浆10-14ml/L、生物素0.1-0.14g/L、尿素0.07-0.11g/L、轻质碳酸钙2-6g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L；
发酵培养基组成为：
小麦麸皮20-24g/L、麦芽糖9-13g/L、蚯蚓粉6-10g/L、丝素粉8-12g/L干酪素7-11g/L、玉米浆10-14ml/L、生物素0.1-0.14g/L、尿素0.07-0.11g/L、轻质碳酸钙2-6g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L、硫酸锌0.09-0.13g/L、硫酸镁0.02-0.06g/L、TritonX-100（ 聚乙二醇辛基苯基醚）0.003-0.007g/L、磷酸二氢钾0.008-0.012g/L。
一种利用上述培养基生产林可霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在1.6L-2L/m3；至菌体浓度20-25%、pH值7.5-8.5、培养时间30-35h时移种；
2） 二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却至25-30℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9-11%。温度控制在29-30℃，至菌体浓度30-35%、pH值7.5-8.5、培养时间17-21h时移种；
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20-25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9-11%。至菌体浓度35-40%、化学效价＞11000u/mL、pH：7.6-8.0、培养时间145-150h时终止发酵。
所述培养好的母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20-30%；镜检无杂菌；摇瓶发酵单位4500u/ml以上。
所述一级种子培养条件为：罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：50-60m3/h；搅拌转速50-60r/min。
所述二级种子培养条件为：罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，40-50m3/h；11h-移种：50-60m3/h；搅拌转速70-80r/min。
所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7-8；
b 培养温度29-30℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；
d 压力控制：罐压0.05-0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；
f 空气流量：0-60h：150-200m3/h；61-120h：250-300m3/h；121h-发酵结束：100-150m3/h；
h 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧，
21-60h，溶氧控制在60%以上，
61-120h，溶氧控制在20%以上，
121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。
在发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补氨水、补水、补糖和pH控制，其中
a 补氨水工艺控制，氨水的浓度控制在15-20%，
发酵前79h不用进行补氨水，
发酵时间在80-120h补入氨水溶液，要求培养基中的铵离子浓度控制在0.25-0.3%；
b补水工艺控制：
发酵前59h不用进行补水，
发酵时间在60-100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40-45%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101h-发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35-40%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前59h，pH不进行控制，
发酵时间在60 h -发酵结束，若pH＜7.5，加入10-20%的氢氧化钠，调节pH至7.8-8.0；若pH＞8.0，加入30-40%的硫酸铵溶液，调节pH至7.5-8.5；
d 补入质量体积浓度为80-90%的麦芽糖溶液，
发酵前59h，还原糖含量不进行控制，
发酵60h至120h：还原糖含量＜3%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3-4%，
发酵121h至发酵结束：还原糖含量＜1%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5-1%。
在上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其质量体积浓度控制在0.001-0.003%。
本发明的技术优势：
1 本发明确认了林可霉素培养基中的最佳碳源、氮源和配伍比例。
2 培养基中分别采用麸皮和麦芽糖代替淀粉和葡萄糖，降低了培养基的粘度，避免了葡萄糖效应，提高了发酵液培养质量。
3 摇瓶种子培养基中加入了丝素粉和干酪素，保证了摇瓶种子培养所需各种氨基酸，有利于提高林可霉素摇甁种子液质量。
4 本发明对林可霉素发酵生产工艺进行了详细的阐述，确认了林可霉素最佳的培养工艺和控制参数。
5 利用本发明提供的生产发酵工艺，经三级发酵后，林可霉素的发酵单位（发酵液体积达到100m）达到11000u/ml以上，发酵周期控制150h以内，达到国内先进水平。
6 本发明适用于规模化发酵生产林可霉素，能够满足年产2000吨林可霉素的生产需求。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
实施例中母瓶发酵液质量：菌体浓度20-30%；镜检无杂菌；摇瓶发酵单位4500u/ml以上。
实施例1
一级种子培养：培养基体积为1m3。
一级种子培养基组：
小麦麸皮14kg、麦芽糖6kg、蚯蚓粉3kg、丝素粉4kg、玉米浆7L、生物素0.08kg、尿素0.04kg、轻质碳酸钙1kg、麦芽糖酶0.001kg。
首先将一级种子培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.6L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：50m3/h；搅拌转速50r/min。一级种子培养结束，菌体浓度20%、pH值7.5、培养时间30h时移种。
二级种子培养：培养基体积为10m3。
小麦麸皮200kg、麦芽糖90kg、蚯蚓粉60kg、丝素粉80kg、干酪素70kg、玉米浆100L、生物素1kg、尿素0.7kg、轻质碳酸钙20kg、麦芽糖酶0.01kg。
先将二级种子培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，40m3/h；11h-移种：50m3/h；搅拌转速70r/min。二级种子培养结束，菌体浓度30%、pH值7.5、培养时间17h。
发酵培养基：培养基的体积为100m3。
小麦麸皮2000kg、麦芽糖900kg、蚯蚓粉600kg、丝素粉800kg、干酪素700kg、玉米浆1000L、生物素10kg、尿素7kg、轻质碳酸200kg、麦芽糖酶0.1kg、硫酸锌9kg、硫酸镁2kg、TritonX-100 0.3kg、磷酸二氢钾0.8kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9%。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.1；
b 培养温度32-33℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；
d 压力控制：罐压0.05-0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；
f 空气流量：0-60h：150m3/h；61-120h：250m3/h；121h-发酵结束：100m3/h；
h 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧；
21-60h，溶氧控制在60%以上；
61-120h，溶氧控制在20%以上；
121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度35%、化学效价11081u/mL、pH：7.6、培养时间145h。
实施例2
一级种子培养：培养基体积为1m3。
一级种子培养基组：
小麦麸皮15kg、麦芽糖7kg、蚯蚓粉4kg、丝素粉5kg、玉米浆8L、生物素0.09kg、尿素0.05kg、轻质碳酸钙2kg、麦芽糖酶0.002kg。
首先将一级种子培养基灭菌，冷却至27℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.7L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：52m3/h；搅拌转速53r/min。一级种子培养结束，菌体浓度22%、pH值7.8、培养时间32h时移种。
二级种子培养：培养基体积为10m3。
小麦麸皮210kg、麦芽糖100kg、蚯蚓粉70kg、丝素粉90kg、干酪素80kg、玉米浆110L、生物素1.1kg、尿素0.8kg、轻质碳酸钙30kg、麦芽糖酶0.02kg。
先将二级种子培养基灭菌，冷却至26℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9.5%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，43m3/h；11h-移种：52m3/h；搅拌转速73r/min。二级种子培养结束，菌体浓度31%、pH值7.7、培养时间18h。
发酵培养基：培养基的体积为100m3。
小麦麸皮2100kg、麦芽糖1000kg、蚯蚓粉700kg、丝素粉900kg、干酪素800kg、玉米浆1100L、生物素11kg、尿素8kg、轻质碳酸300kg、麦芽糖酶0.2kg、硫酸锌10kg、硫酸镁3kg、TritonX-100 0.4kg、磷酸二氢钾0.9kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至22℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9.5%。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.3；
b 培养温度29-30℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；
d 压力控制：罐压0.05-0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；
f 空气流量：0-60h：160m3/h；61-120h：270m3/h；121h-发酵结束：120m3/h；
h 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧；
21-60h，溶氧控制在60%以上；
61-120h，溶氧控制在20%以上；
121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度36%、化学效价11237u/mL、pH：7.7、培养时间146h。
实施例3
一级种子培养：培养基体积为1m3。
一级种子培养基组：
小麦麸皮16kg、麦芽糖8kg、蚯蚓粉5kg、丝素粉6kg、玉米浆9L、生物素0.1kg、尿素0.06kg、轻质碳酸钙3kg、麦芽糖酶0.003kg。
首先将一级种子培养基灭菌，冷却至28℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.8L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：55m3/h；搅拌转速55r/min。一级种子培养结束，菌体浓度23%、pH值8.0、培养时间33h时移种。
二级种子培养：培养基体积为10m3。
小麦麸皮220kg、麦芽糖110kg、蚯蚓粉80kg、丝素粉100kg、干酪素90kg、玉米浆120L、生物素1.2kg、尿素0.9kg、轻质碳酸钙40kg、麦芽糖酶0.03kg。
先将二级种子培养基灭菌，冷却至27℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在10%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，45m3/h；11h-移种：55m3/h；搅拌转速75r/min。二级种子培养结束，菌体浓度32%、pH值8.0、培养时间19h。
发酵培养基：培养基的体积为100m3。
小麦麸皮2200kg、麦芽糖1100kg、蚯蚓粉800kg、丝素粉1000kg、干酪素900kg、玉米浆1200L、生物素12kg、尿素9kg、轻质碳酸400kg、麦芽糖酶0.3kg、硫酸锌11kg、硫酸镁4kg、TritonX-100 0.5kg、磷酸二氢钾1kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至23℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在10%。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.5；
b 培养温度29-30℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；
d 压力控制：罐压0.05-0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；
f 空气流量：0-60h：175m3/h；61-120h：280m3/h；121h-发酵结束：130m3/h；
h 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧；
21-60h，溶氧控制在60%以上；
61-120h，溶氧控制在20%以上；
121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度38%、化学效价11381u/mL、pH：7.8、培养时间147h。
实施例4
一级种子培养：培养基体积为1m3。
一级种子培养基组：
小麦麸皮17kg、麦芽糖9kg、蚯蚓粉6kg、丝素粉7kg、玉米浆10L、生物素0.11kg、尿素0.07kg、轻质碳酸钙4kg、麦芽糖酶0.004kg。
首先将一级种子培养基灭菌，冷却至29℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.9L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：57m3/h；搅拌转速58r/min。一级种子培养结束，菌体浓度24%、pH值8.2、培养时间34h时移种。
二级种子培养：培养基体积为10m3。
小麦麸皮230kg、麦芽糖120kg、蚯蚓粉90kg、丝素粉110kg、干酪素100kg、玉米浆130L、生物素1.3kg、尿素1kg、轻质碳酸钙50kg、麦芽糖酶0.04kg。
先将二级种子培养基灭菌，冷却至28℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在10.5%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，47m3/h；11h-移种：58m3/h；搅拌转速76r/min。二级种子培养结束，菌体浓度33%、pH值8.3、培养时间20h。
发酵培养基：培养基的体积为100m3。
小麦麸皮2300kg、麦芽糖1200kg、蚯蚓粉900kg、丝素粉1100kg、干酪素1000kg、玉米浆1300L、生物素13kg、尿素10kg、轻质碳酸500kg、麦芽糖酶0.4g、硫酸锌12kg、硫酸镁5kg、TritonX-100 0.6kg、磷酸二氢钾1.1kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至24℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在10.5%。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.8；
b 培养温度29-30℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；
d 压力控制：罐压0.05-0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；
f 空气流量：0-60h：190m3/h；61-120h：290m3/h；121h-发酵结束：140m3/h；
h 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧；
21-60h，溶氧控制在60%以上；
61-120h，溶氧控制在20%以上；
121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度39%、化学效价11286u/mL、pH：7.9、培养时间149h。
实施例5
一级种子培养：培养基体积为1m3。
一级种子培养基组：
小麦麸皮18kg、麦芽糖10kg、蚯蚓粉7kg、丝素粉8kg、玉米浆11L、生物素0.12kg、尿素0.08kg、轻质碳酸钙5kg、麦芽糖酶0.005kg。
首先将一级种子培养基灭菌，冷却至30℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液2L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：60m3/h；搅拌转速60r/min。一级种子培养结束，菌体浓度25%、pH值8.5、培养时间35h时移种。
二级种子培养：培养基体积为10m3。
小麦麸皮240kg、麦芽糖130kg、蚯蚓粉100kg、丝素粉120kg、干酪素110kg、玉米浆140L、生物素1.4kg、尿素1.1kg、轻质碳酸钙60kg、麦芽糖酶0.05kg。
先将二级种子培养基灭菌，冷却至30℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在11%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，50m3/h；11h-移种：60m3/h；搅拌转速80r/min。二级种子培养结束，菌体浓度35%、pH值8.5、培养时间21h。
发酵培养基：培养基的体积为100m3。
小麦麸皮2400kg、麦芽糖1300kg、蚯蚓粉1000kg、丝素粉1200kg、干酪素1100kg、玉米浆1400L、生物素14kg、尿素11kg、轻质碳酸600kg、麦芽糖酶0.5g、硫酸锌13kg、硫酸镁6kg、TritonX-100 0.7kg、磷酸二氢钾1.2kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在11%。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在8.0；
b 培养温度29-30℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；
d 压力控制：罐压0.05-0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；
f 空气流量：0-60h：200m3/h；61-120h：300m3/h；121h-发酵结束：150m3/h；
h 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧；
21-60h，溶氧控制在60%以上；
61-120h，溶氧控制在20%以上；
121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度39%、化学效价11208u/mL、pH：8.0、培养时间150h。
上述实施例1-5中，在发酵过程中需要采用流加法进行补料，补料包括补氨水、补水、补糖和pH控制，具体为：
a 补氨水工艺控制，氨水的浓度控制在15-20%，
发酵前79h不用进行补氨水，
发酵时间在80-120h补入氨水溶液，要求培养基中的铵离子浓度控制在0.25-0.3%。
b补水工艺控制：
发酵前59h不用进行补水，
发酵时间在60-100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40-45%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101h-发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35-40%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度。
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前59h，pH不进行控制，
发酵时间在60 h -发酵结束，若pH＜7.5，加入10-20%的氢氧化钠，调节pH至7.8-8.0；若pH＞8.0，加入30-40%的硫酸铵溶液，调节pH至7.5-8.5；
d 补入麦芽糖溶液，麦芽糖溶液质量体积浓度为80-90%，其中还加入有麦芽糖酶，其质量体积浓度控制在0.001-0.003%。
发酵前59h，还原糖含量不进行控制，
发酵60h至120h：还原糖含量＜3%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3-4%，
发酵121h至发酵结束：还原糖含量＜1%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5-1%。

Claims (8)

1.一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述
一级种子培养基组成为：
小麦麸皮14-18g/L、麦芽糖6-10g/L、蚯蚓粉3-7g/L、丝素粉4-8g/L、玉米浆7-12ml/L、生物素0.08-0.12g/L、尿素0.04-0.8g/L、轻质碳酸钙1-5g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L；
二级种子培养基组成为：
小麦麸皮20-24g/L、麦芽糖9-13g/L、蚯蚓粉6-10g/L、丝素粉8-12g/L、干酪素7-11g/L、玉米浆10-14ml/L、生物素0.1-0.14g/L、尿素0.07-0.11g/L、轻质碳酸钙2-6g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L；
发酵培养基组成为：
小麦麸皮20-24g/L、麦芽糖9-13g/L、蚯蚓粉6-10g/L、丝素粉8-12g/L干酪素7-11g/L、玉米浆10-14ml/L、生物素0.1-0.14g/L、尿素0.07-0.11g/L、轻质碳酸钙2-6g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L、硫酸锌0.09-0.13g/L、硫酸镁0.02-0.06g/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.003-0.007g/L、磷酸二氢钾0.008-0.012g/L。
2.一种利用权利要求1所述培养基生产林可霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液接入一级种子培养基中进行培养，接种量控制在1.6L-2L/m3；至菌体浓度20-25%、pH值7.5-8.5、培养时间30-35h时移种；
2） 二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却至25-30℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9-11%，温度控制在29-30℃，至菌体浓度30-35%、pH值7.5-8.5、培养时间17-21h时移种；
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20-25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9-11%，至菌体浓度35-40%、化学效价＞11000u/mL、pH：7.6-8.0、培养时间145-150h时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述培养好的林可链霉菌母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20-30%；镜检无杂菌；摇瓶发酵单位4500u/ml以上。
4.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为：罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：50-60m3/h；搅拌转速50-60r/min。
5.按照权利要求2所述的培养方法，其特征是在于所述二级种子培养条件为：罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，40-50m3/h；11h-移种：50-60m3/h；搅拌转速70-80r/min。
6.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7-8；
b 培养温度29-30℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；
d 压力控制：罐压0.05-0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；
f 空气流量：0-60h：150-200m3/h；61-120h：250-300m3/h；121h-发酵结束：100-150m3/h；
g 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧，
21-60h，溶氧控制在60%以上，
61-120h，溶氧控制在20%以上，
121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。
7.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于在发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补氨水、补水、补糖和pH控制，其中
a 补氨水工艺控制，氨水的浓度控制在15-20%，
发酵前79h不用进行补氨水，
发酵时间在80-120h补入氨水溶液，要求培养基中的铵离子浓度控制在0.25-0.3%；
b补水工艺控制：
发酵前59h不用进行补水，
发酵时间在60-100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40-45%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101h-发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35-40%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前59h，pH不进行控制，
发酵时间在60 h -发酵结束，若pH＜7.5，加入10-20%的氢氧化钠，调节pH至7.8-8.0；若pH＞8.0，加入30-40%的硫酸铵溶液，调节pH至7.5-8.5；
d 补入质量体积浓度为80-90%的麦芽糖溶液，
发酵前59h，还原糖含量不进行控制，
发酵60h至120h：还原糖含量＜3%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3-4%，
发酵121h至发酵结束：还原糖含量＜1%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5-1%。
8.按照权利要求7所述的培养方法，其特征在于在上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其质量体积浓度控制在0.001-0.003%。
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