CN115261240A - 一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物发酵工程技术领域，提供了一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其主要包括发酵前在发酵培养基中添加前体物质，在发酵至144‑168h时检测氨基氮含量并加入复合氮源两种方式，发明人发现同时采用上述两种措施可有效缩短目标产物的合成时间，提高多杀菌素的摇瓶发酵水平，可持续为发酵过程中的菌丝生长和产物合成提供氮源，有利于多杀菌素的积累。相比未添加前体、复合有机氮源的情况，本发明技术方案中多杀菌素的产率提高了45％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供了可能。

Description

一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域，提供了一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法。
背景技术
多杀菌素(Spinosad)是刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂，兼具化学农药的髙效性和生物农药的低毒性，选择性高，无残留，不易产生抗药性，具有良好的环境相容性，可克服化学农药污染环境、破坏生态平衡、易产生耐药性的缺陷，符合国内对多杀菌素的技术需求，并且对改善环境污染，保障粮食、食品安全有着重要的现实意义。
现有技术中制备多杀菌素的方法主要有：
CN107523598A公开了一种提高多杀菌素产量的发酵方法，通过向发酵液中批次补加复合有机氮源，提高多杀菌素的产量，使得多杀菌素产量在发酵216 小时达到5.66g/L。
CN104450834A公开了一种基于代谢组学改进刺糖多孢菌发酵条件以提高多杀菌素产量的方法，通过添加正十二烷使多杀菌素产量达到381.58mg/L，比对照组高出57.8％，并以添加正十二烷为刺激因素分析多杀菌素合成过程中不同代谢标志物对产量的影响，发现丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、天冬氨酸都会促进多杀菌素的合成，其他氨基酸对多杀菌素产量无明显影响或有抑制作用。
但发明人在实验中发现，刺糖多孢菌的发酵补料培养基中仅加入有机氮源，发酵液中的菌量不会有显著变化，对多杀菌素产量的提高幅度也有限。此外刺糖多孢菌中多杀菌素合成代谢流分布庞杂，发酵过程的调控节点仍需进一步探讨，仅以某一因素分析多杀菌素的合成代谢调控略显片面，可能会漏掉某些提高多杀菌素产量的关键因素。目前多杀菌素的生产工艺尚不成熟，合成路径不明确，通过改善发酵工艺，筛选外源添加剂来提高多杀菌素效价，是当前多杀菌素产业化的一条捷径。
发明内容
针对上述技术存在的不足，发明人提供了一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其主要包括发酵前在发酵培养基中添加前体物质，在发酵至144-168h 时检测氨基氮含量并加入复合氮源两种方式，发明人发现同时采用上述两种措施可有效缩短目标产物的合成时间，提高多杀菌素的摇瓶发酵水平，可持续为发酵过程中的菌丝生长和产物合成提供氮源，有利于多杀菌素的积累。相比未添加前体、复合有机氮源的情况，本发明技术方案中多杀菌素的产率提高了45 ％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供了可能。
与现有工艺相比，本申请的最大特点是在在发酵培养基中添加前体物质，在发酵至144-168h时检测氨基氮含量并加入复合氮源，两种手段配合使用，针对现有的刺糖多孢菌具有明显的效果，可以显著的提高多杀菌素的产率，本发明的具体技术方案如下：
发明人首先提供了一种刺糖多孢菌，其生物保藏编号为CGMCC No.25093。
进而提供了一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，具体步骤如下：
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线培养至固体培养基， 27-30℃活化菌种，培养7-10天固体培养基上长出白色菌落，形成孢子即可完成活化；
其中采用的固体培养基组成按照重量百分比如下：
葡萄糖0.5-1.0％，饴糖0.5-1.0％，酪蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸粉0.2-0.5 ％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，余量为水，消毒前调节pH 6.9-7.3。
种子培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按1-3％(v/v)的接种量接种至种子培养基，27-30℃，190-250rpm，培养3-7天，至菌体湿体积达到25-30％，获取摇瓶种子液；
其中种子培养基组成如下：葡萄糖5-20g/L，饴糖5-20g/L，酵母浸粉5-20 g/L，蛋白胨5-30g/L，黄豆饼粉5-15g/L，磷酸二氢钾2-5g/L，NaCl 1-10g/L，硫酸镁0.5-5g/L，加去离子水定容至1L，消前pH 6.9-7.3，121123℃温度灭菌20min。
摇瓶发酵：
摇瓶种子液按1-7％(v/v)的接种量接种至装有发酵培养基的锥形瓶中， 28-32℃，220-260rpm，培养295-305h结束发酵，并检测含量；
其中所述发酵培养基中组成如下：葡萄糖50-80g/L，棉籽蛋白20-50g/L，油酸甲酯20-100g/L，大豆油10-20g/L，酵母粉6-12g/L，蛋白粉5-20g/L，玉米浆干粉4-20g/L，蛋白胨10-25g/L，磷酸二氢钾1-4g/L，硫酸铵1-4g/L，硫酸铜0.001-0.003g/L，钼酸铵0.001-0.003g/L，硫酸亚铁0.001-0.003g/L，消泡剂0.5-1g/L，碳酸钙1-9g/L，前体物质1-5g/L，加去离子水定容至1L，灭菌前pH调至7.3-7.5，121-123℃温度灭菌20min。
所述前体物质为甲硫氨酸、乙酸铵中的一种或两种；
与现有技术相比，本申请的最大特点就是在上述发酵培养基中添加了前体物质，其添加量为每升发酵培养基添加量为1-5g。
除此之外，在上述摇瓶发酵阶段，当发酵至144-168h时检测氨基氮含量，若氮含量小于5g/L，则需要加入复合氮源使氨基氮含量达到5-8g/L。
上述复合氮源由重量比为5:1～1:5的棉籽饼粉和硫酸铵组成，其中所采用的棉籽饼粉蛋白含量在50％以上；优选棉籽饼粉和硫酸铵的重量比为3:1～1:1。
上述发酵过程中所采用的菌株为刺糖多孢菌，其生物保藏编号为CGMCCNo.25093。
综上所述，采用本发明所提供的方法发酵生产多杀菌素，同时采用了增加前体物质和补加复合氮源两种措施，可有效缩短目标产物的合成时间，提高多杀菌素的摇瓶发酵水平，可持续为发酵过程中的菌丝生长和产物合成提供氮源，有利于多杀菌素的积累，相比未添加前体、复合有机氮源的情况，本发明技术方案中多杀菌素的产率提高了45％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供了可能。
保藏信息
保藏时间：2022年06月16日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.25093
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名:刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)
附图说明
图1为不同前体加入后对多杀菌素摇瓶发酵水平影响柱状图，
图2为不同发酵条件下多杀菌素含量增长曲线。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成，如消泡剂等均为本领域常规选择，下述实施例中所采用的菌种为刺糖多孢菌，选自CGMCC No.25093的菌株。
实验例
多杀菌素前体筛选实验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
菌种：刺糖多孢菌
1.1.2
固体培养基组成按照重量百分比如下：
葡萄糖0.5-1.0％，饴糖0.5-1.0％，酪蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸粉0.2-0.5 ％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，余量为水，消毒前调节pH 6.9-7.3，
种子培养基
种子培养基：葡萄糖8g/L，饴糖7g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，黄豆饼粉7g/L，磷酸二氢钾2g/L，NaCl 1g/L，硫酸镁3g/L，加去离子水定容至1L，pH7.3，于121℃，湿热灭菌20min；
普通发酵培养基：葡萄糖55g/L，棉籽蛋白25g/L，油酸甲酯35g/L，大豆油10g/L，酵母粉8g/L，蛋白粉5g/L，玉米浆干粉7g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸铜0.002g/L，钼酸铵0.002g/L，硫酸亚铁0.001g/L，消泡剂0.5g/L，碳酸钙5g/L，加去离子水定容至1L， pH7.5，于121℃，湿热灭菌20min。
备选前体物质：甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、丙酮酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙酸铵、乙酸钠、丙酸钠、异丁醇、正丁醇、鼠李糖、植酸钠。
1.2方法
1.2.1培养基的配制
分别配制种子培养基与发酵培养基，并在普通发酵培养基的基础上分别加入不同前体物质，包含甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、丙酮酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙酸铵、乙酸钠、丙酸钠、异丁醇、正丁醇、鼠李糖、植酸钠，筛选时添加量为2.5g/L，同时配制一组普通发酵培养基为空白对照，灭菌后备用；
1.2.2菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线培养至固体培养基， 27-30℃活化菌种，培养7-10天固体培养基上长出白色菌落，形成孢子即可完成活化；
1.2.3种子培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按1-3％(v/v)的接种量接种至种子培养基，27-30℃，190-250rpm，培养3-7天，至菌体湿体积达到25-30％，获取摇瓶种子液；
1.2.4摇瓶发酵：
摇瓶种子液按1-7％(v/v)的接种量接种至装有发酵培养基的锥形瓶中， 28-32℃，220-260rpm进行发酵培养，并在144h时取样检测氨基氮含量，若氮含量小于0.5％，加入复合氮源使氨基氮含量达到0.8％，复合氮源的组成为质量比1：1的棉籽饼粉和硫酸铵，期间对多杀菌素含量进行检测，当其增速低于 0.05g L-1/d时即可停止发酵，发酵时间控制在360-400h，结束发酵并检测含量。
1.2.5检测方法
多杀菌素含量检测方法：
色谱柱：C18(VP-ODS，4.6mm×150mm)；
进样量：10μL；
流动相：乙腈：甲醇：水(含0.05％乙酸铵)＝45:45:10；
流速：1.0mL/min；
检测波长：250nm。
取1mL发酵结束后的发酵液置于离心管中，加入4mL乙腈，封口后置于摇床中常温震荡30min，取出离心，10min，10000rpm，然后取上清，过膜后通过HPLC进行含量检测。
氨基氮含量检测方法：
取样在超净工作台中进行，无菌操作。将发酵液稀释50倍后离心10min，10000rpm，取2mL上清加入到三角瓶中，加蒸馏水4mL，3滴酚酞指示剂，摇匀后用氢氧化钠溶液滴定到微红色。然后加入2mL中性甲醛溶液，摇匀，放置片刻，再用微量滴定管以标定过的0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定到微红色终点，记下甲醛加入后所消耗的碱量(V2)。同样，做空白测定耗碱量(V1)。
氨态氮含量，以氮(N)质量百分数X表示，按下式计算：
Figure BDA0003804192230000041
式中：V1---测定试样所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；
V2---测定空白所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；
c---氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；
0.01401---与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液相当的以克表示的N的质量；
m---试料的质量，g。
2.结果与分析
结果如图1所示，不同前体加入后对多杀菌素摇瓶发酵水平影响较大，其中加入甲硫氨酸、乙酸铵后多杀菌素产量较高，分别为6.35g/L、6.02g/L，比未加前体的对照组(4.467g/L)分别提高了42.12％、34.77％。
前体的添加在生物发酵中有至关重要的地位，将前体加入到发酵培养基中能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子，而自身结构没有发生多大变化,但产物的产量可以获得较大提高，缩短生物合成路径，提高产物合成速率。多杀菌素是一种大环内酯类抗生素，甲硫氨酸可作为甲基供体，在多杀菌素的 C1结构组成中发挥作用，而乙酸铵中的乙酸基团是大环内酯糖苷配基的组成部分，乙酸铵中的铵根离子又可作为发酵过程的氮源，因此两者作为多杀菌素的前体，并在发酵过程中产生作用，极大地提高了多杀菌素的摇瓶发酵产量。
实施例1
一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，使用的培养基为：
固体培养基组成按照重量百分比如下：
葡萄糖0.5-1.0％，饴糖0.5-1.0％，酪蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸粉0.2-0.5 ％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，余量为水，消毒前调节pH 6.9-7.3，
种子培养基：葡萄糖8g/L，饴糖7g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，黄豆饼粉7g/L，磷酸二氢钾2g/L，NaCl 1g/L，硫酸镁3g/L，pH7.3，于 121℃，湿热灭菌20min；
发酵培养基：葡萄糖60g/L，棉籽蛋白30g/L，油酸甲酯40g/L，大豆油 30g/L，酵母粉8g/L，蛋白粉5g/L，玉米浆干粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸铜0.003g/L，钼酸铵0.003g/L，硫酸亚铁0.001g/L，消泡剂0.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.5，于121℃，湿热灭菌20min。
实验组A：空白对照组，为正常普通发酵过程；
实验组B：添加复合氮源。在发酵开始后168h时取样检测氨基氮含量，加入复合氮源使氨基氮含量达到0.6％，复合氮源的组成为质量比1：1的棉籽饼粉和硫酸铵；
实验组C：按照实验组B中的方法加入复合氮源，并在发酵培养基中添加1 g/L甲硫氨酸。
具体发酵过程如下：
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线培养至固体培养基， 27-30℃活化菌种，培养7-10天固体培养基上长出白色菌落，形成孢子即可完成活化。
种子培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按1％(v/v)的接种量接种至种子瓶培养基，27-30℃，190-250rpm，培养3-7天，至菌体湿体积达到25-30％，获取摇瓶种子液。
摇瓶发酵：
摇瓶种子液按5％(v/v)的接种量接种至装有发酵培养基的锥形瓶中，发条件为28-32℃，220-260rpm。发酵开始后从第144h开始，每隔24h取样检测发酵液中多杀菌素含量，制作多杀菌素含量增长曲线，如图2所示。
从图2可以看出，发酵培养基中只添加复合氮源(实验组B)，发酵液中的多杀菌素含量相对于空白组(实验组A)提高了4.7％，发酵时间基本没有变化。发酵培养基中加入前体，并补加复合氮源后(实验组C)，发酵液中的多杀菌素含量有了较大变化，相较于空白组提高了21.7％，比只添加复合氮源的实验组提高了16.17％，并且在发酵312h左右多杀菌素含量增速放缓，较之其他两个试验组至少需要360h才能达到多杀菌素含量增速放缓的情况相比，极大的缩短了发酵时间，提高了发酵效率和产量。
实施例2
一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，使用的培养基为：
固体培养基组成按照重量百分比如下：
葡萄糖0.5-1.0％，饴糖0.5-1.0％，酪蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸粉0.2-0.5 ％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，余量为水，消毒前调节pH 6.9-7.3，
种子培养基：葡萄糖10g/L，饴糖7g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，黄豆饼粉15g/L，磷酸二氢钾5g/L，NaCl 4g/L，硫酸镁2g/L，消前pH 7.0， 121℃温度灭菌20min。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，棉籽蛋白40g/L，油酸甲酯80g/L，大豆油 15g/L，酵母粉7g/L，蛋白粉8g/L，玉米浆干粉4g/L，蛋白胨25g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸铜0.001g/L，钼酸铵0.001g/L，硫酸亚铁0.001g/L，消泡剂1g/L，碳酸钙5g/L，加水定容，灭菌前pH调至7.4， 121℃温度灭菌20min。
实验组A：空白对照组，为正常普通发酵过程；
实验组B：添加复合氮源。在发酵开始后144h时取样检测氨基氮含量，加入复合氮源使氨基氮含量达到0.8％，复合氮源的组成为质量比1：1的棉籽饼粉和硫酸铵；
实验组C：按照实验组B中的方法加入复合氮源，并在发酵培养基中添加1 g/L甲硫氨酸。
具体发酵过程如下：
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线培养至固体培养基，27-30℃活化菌种，培养7-10天固体培养基上长出白色菌落，形成孢子即可完成活化。
种子培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按2％(v/v)的接种量接种至种子瓶培养基，27-30℃，190-250rpm，培养3-7天，至菌体湿体积达到25-30％，获取摇瓶种子液。
摇瓶发酵：
摇瓶种子液按5％(v/v)的接种量接种至装有发酵培养基的锥形瓶中，28-32 ℃，220-260rpm，其中实验组A、B培养360h，实验组C培养300h，结束发酵并检测多杀菌素含量。
表1不同条件下发酵液中的多杀菌素含量
实验组A 实验组B 实验组C
多杀菌素含量(g/L) 5.134 5.417 6.241
可见在相同的发酵条件下，发酵培养基中加入前体，并补加复合氮源后的实验组C发酵液中的多杀菌素含量明显高于实验组A和B，发酵时间更短，显著提高了发酵效率。
实施例3
一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，使用的培养基为：
固体培养基组成按照重量百分比如下：
葡萄糖0.5-1.0％，饴糖0.5-1.0％，酪蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸粉0.2-0.5 ％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，余量为水，消毒前调节pH 6.9-7.3，
种子培养基：葡萄糖8g/L，饴糖7g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，黄豆饼粉7g/L，磷酸二氢钾2g/L，NaCl 1g/L，硫酸镁3g/L，pH7.3，于121℃，湿热灭菌20min；
发酵培养基：葡萄糖60g/L，棉籽蛋白30g/L，油酸甲酯40g/L，大豆油 30g/L，酵母粉8g/L，蛋白粉5g/L，玉米浆干粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸铜0.003g/L，钼酸铵0.003g/L，硫酸亚铁0.001g/L，消泡剂0.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.5，于121℃，湿热灭菌20min。
实验组A：空白对照组，为正常普通发酵过程；
实验组B：添加复合氮源。在发酵开始后168h时取样检测氨基氮含量，加入复合氮源使氨基氮含量达到0.4％，复合氮源的组成为质量比1：1的棉籽饼粉和硫酸铵；
实验组C：按照实验组B中的方法加入复合氮源，并在发酵培养基中添加1 g/L乙酸铵。
具体发酵过程如下：
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线培养至固体培养基， 27-30℃活化菌种，培养7-10天固体培养基上长出白色菌落，形成孢子即可完成活化。
种子培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按3％(v/v)的接种量接种至种子瓶培养基，27-30℃，190-250rpm，培养3-7天，至菌体湿体积达到25-30％，获取摇瓶种子液。
摇瓶发酵：
摇瓶种子液按6％(v/v)的接种量接种至装有发酵培养基的锥形瓶中，28-32 ℃，220-260rpm，其中实验组A、B培养360h，实验组C培养300h结束发酵并检测多杀菌素含量。
表1不同条件下发酵液中的多杀菌素含量
实验组A 实验组B 实验组C
多杀菌素含量(g/L) 5.262 5.624 6.357
可见实验组C发酵液中的多杀菌素含量明显高于实验组A和B，发酵时间更短，显著提高了发酵效率。
实施例4
一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，使用的培养基为：
固体培养基组成按照重量百分比如下：
葡萄糖0.5-1.0％，饴糖0.5-1.0％，酪蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸粉0.2-0.5 ％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，余量为水，消毒前调节pH 6.9-7.3，
种子培养基：葡萄糖9g/L，饴糖15g/L，酵母浸粉20g/L，蛋白胨15g/L，黄豆饼粉5g/L，磷酸二氢钾5g/L，NaCl 4g/L，硫酸镁2g/L，消前pH 7.0， 121℃温度灭菌20min。
发酵培养基：葡萄糖80g/L，棉籽蛋白40g/L，油酸甲酯50g/L，大豆油15g/L，酵母粉9g/L，蛋白粉20g/L，玉米浆干粉15g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸铜0.001g/L，钼酸铵0.001g/L，硫酸亚铁0.001g/L，消泡剂1g/L，碳酸钙5g/L，甲硫氨酸1g/L，加水定容，灭菌前pH调至7.4，121℃温度灭菌20min。
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线培养至固体培养基， 27-30℃活化菌种，培养7-10天固体培养基上长出白色菌落，形成孢子即可完成活化。
种子培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按1％(v/v)的接种量接种至种子瓶培养基，27-30℃，190-250rpm，培养3-7天，至菌体湿体积达到25-30％，获取种子液。
发酵罐发酵：
种子液按4％(v/v)的接种量接种30L发酵罐中，按如下条件进行发酵：培养温度28℃，转速250rpm，通气量为50L/min，罐压0.06MPa，溶氧控制在 20％以上，pH控制7.0，发酵周期为300h。
发酵开始后168h时取样检测氨基氮含量，加入复合氮源使氨基氮含量达到0.5％，复合氮源的组成为质量比1：1棉籽饼粉和硫酸铵。
发酵300小时后得多杀菌素发酵液，通过HPLC检测多杀菌素产量，得到多杀霉素产量为6.533g/L。
通过上述实施例可以证明，本申请所提供的发酵方法可以应用与大型发酵罐中，因此具有实际应用价值及可操作性。

Claims (8)

1.一株刺糖多孢菌，其特征在于，其生物保藏编号为CGMCC No.25093。
2.一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其特征在于，具体步骤如下：
在发酵培养基中添加有前体物质，所述前体物质为甲硫氨酸、乙酸铵中的一种或两种，其添加量为每升发酵培养基添加量为1-5g；
在发酵罐发酵阶段，当发酵至144-168h时检测氨基氮含量，加入复合氮源使氨基氮含量达到0.5％-0.8％。
3.根据权利要求2所述的提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其特征在于，具体步骤如下：
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线培养至固体培养基，27-30℃活化菌种，培养7-10天固体培养基上长出白色菌落，形成孢子即可完成活化；所采用的菌种生物保藏编号为CGMCC No.25093；
种子培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按1-3％(v/v)的接种量接种至种子培养基，27-30℃，190-250rpm，培养3-7天，至菌体湿体积达到25-30％，获取摇瓶种子液；
摇瓶发酵：
摇瓶种子液按1-7％(v/v)的接种量接种至装有发酵培养基的锥形瓶中，28-32℃，220-260rpm，培养295-305h结束发酵，并检测含量；
在上述摇瓶发酵阶段，当发酵至144-168h时检测氨基氮含量，若氮含量小于5g/L，则需要加入复合氮源使氨基氮含量达到5-8g/L。
4.根据权利要求3所述的提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其特征在于:
菌种活化时采用的固体培养基组成按照重量百分比如下：
葡萄糖0.5-1.0％，饴糖0.5-1.0％，酪蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸粉0.2-0.5％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，余量为水，消毒前调节pH 6.9-7.3。
5.根据权利要求3所述的提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其特征在于:
种子培养基组成如下：葡萄糖5-20g/L，饴糖5-20g/L，酵母浸粉5-20g/L，蛋白胨5-30g/L，黄豆饼粉5-15g/L，磷酸二氢钾2-5g/L，NaCl 1-10g/L，硫酸镁0.5-5g/L，加去离子水定容至1L，消前pH 6.9-7.3，121 123℃温度灭菌20min。
6.根据权利要求3所述的提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其特征在于:
所述发酵培养基中组成如下：葡萄糖50-80g/L，棉籽蛋白20-50g/L，油酸甲酯20-100g/L，大豆油10-20g/L，酵母粉6-12g/L，蛋白粉5-20g/L，玉米浆干粉4-20g/L，蛋白胨10-25g/L，磷酸二氢钾1-4g/L，硫酸铵1-4g/L，硫酸铜0.001-0.003g/L，钼酸铵0.001-0.003g/L，硫酸亚铁0.001-0.003g/L，消泡剂0.5-1g/L，碳酸钙1-9g/L，前体物质1-5g/L，加去离子水定容至1L，灭菌前pH调至7.3-7.5，121-123℃温度灭菌20min；
所述前体物质为甲硫氨酸、乙酸铵中的一种或两种.
7.根据权利要求3所述的提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其特征在于:
复合氮源由重量比为5:1～1:5的棉籽饼粉和硫酸铵组成，其中所采用的棉籽饼粉蛋白含量在50％以上。
8.根据权利要求7所述的提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法，其特征在于:棉籽饼粉和硫酸铵的重量比为3:1～1:1。
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