CN110484452B - 一种能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能降解稻草产2‑苯乙醇的草酸青霉及其应用，所述草酸青霉为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019608。本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1具有良好的纤维素降解能力，能够产生纤维素酶，且具有较强的内切葡萄糖苷酶活性、滤纸酶活性、外切酶活性和β‑葡萄糖苷酶活性，且草酸青霉T1能够降解降解稻草秸秆产生2‑苯乙醇，降解稻草的发酵液能够抑制拟茎点霉、稻瘟菌和镰刀尖孢菌。

Description

一种能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉及其应用。
背景技术
我国南方以种植水稻为主，具有丰富的稻草秸杆资源，稻草秸杆作为燃料直接焚烧，不仅是对天然资源的巨大浪费，而且还会造成了严重的环境污染。秸秆组分中的木质纤维素结构复杂，在自然条件下降解缓慢，工业上常采用高温高压或强碱进行预处理，但这些措施不但需要消耗能量还会造成环境污染。因此，利用微生物处理稻草秸杆便成为近年来人们研究的热点，因为它与物理、化学等方法处理相比，具有投资少、操作简单、不污染环境等优点。
目前报道的能降解天然稻草主要是真菌，如初世宇筛选到能降解稻草粉的多轮青霉、总状枝毛霉和烟色曲霉（初世宇, 王远亮, 周传云. 降解稻草纤维素真菌的初步研究[J]. 农产品加工(学刊), 2011(10):51-56）。尹璐研究了简青霉固态发酵对天然稻草秸秆降解效果和降解产物，但其发酵时间长，且发酵产物为长链脂肪烃、脂肪酸、脂类和芳香酚类物质（尹璐. 简青霉对稻草秸秆降解条件最优化和机理研究[D]. 湖南大学, 2012），邓勋研究了几种食用菌菌株对稻草的生物降解进行研究，结果表明食用菌菌株对稻草降解率都不高，在以稻草为培养基栽培平菇的过程中产生了大芳香醇类、脂肪醇类、酚类、芳香酸酷类以及羧酸类的小分子化合物（邓勋.几种食用菌菌株对稻草的生物降解研究[D]. 东北林业大学, 2004）。
2-苯乙醇在食品、日化用品和药品中有着广泛的应用。2-苯乙醇是玫瑰香型香气的主要成分，也是其他类型的香精配方成分，其衍生酯类如乙酸苯乙酯、丙酸-2-苯乙酯等都是重要芳香产品。2-苯乙醇能够抑制革兰氏阴性菌、球菌、杆菌以及部分真菌，它还是合成一些高附加值药物的底物比如苯乙醇苷，具有抗菌、抗肿瘤、强心等作用。但是从植物花卉中提取的天然2-苯乙醇产量低，成本高。目前，用微生物转化生产天然2-苯乙醇越来越受关注。2010年2-苯乙醇的全球年产量近万吨，其中绝大多数是利用苯或苯乙烯化学法合成的，但由于化学合成的廉价原料苯和苯乙烯都属于致癌物，合成过程中存在大量难闻的有毒副产物，如联二苯、二氯代乙苯、氯二醇等，同时考虑到2-苯乙醇的应用领域，使消费者更倾向于天然的2-苯乙醇。天然的2-苯乙醇是利用天然原材料通过物理法、酶催化法以及生物转化法获得。然而，2-苯乙醇在花卉中的浓度很低，从植物精油中提取2-苯乙醇的步骤复杂、生产成本高，因此来源植物的天然2-苯乙醇产量无法满足市场的需求。
2-苯乙醇是微生物代谢产物，它是一些发酵食品如面包、葡萄酒、干酪的自然产物，采用微生物生产2-苯乙醇原料便宜、生产周期短、反应条件温和、底物选择性强、副产物少，具有大规模生产的潜在能力。因此，通过微生物发酵法生产2-苯乙醇己获得广泛关注。目前报道的产天然2-苯乙醇主要为酵母菌，黄筱萍从24株不同来源的酵母菌中分离筛选出一株对2-苯乙醇耐受性强、生物转化合成2-苯乙醇能力高的优良菌株Saccharomyces cerevasaae SH003，该菌株能在含有4 g/L的2-苯乙醇培养基中生长，在优化的转化条件下，转化合成2-苯乙醇质量浓度达4.31 g/L（黄筱萍，刘兰，熊大维，黄国昌.一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及鉴定.食品与生物技术学报.2016,35(5):531-536）。但目前，未见草酸青霉发酵产2-苯乙醇的报道，更未见草酸青霉发酵天然稻草产2-苯乙醇的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉及其应用。
为实现上述目的，本发明提供一种能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉，所述草酸青霉为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019608。
较佳地，所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1具有如SEQ ID:1所示的核苷酸序列。
较佳地，所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1能抑制拟茎点霉、稻瘟菌和镰刀尖孢菌。
本发明还提供一种上述所述的能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉在产2-苯乙醇中的应用，其特征在于：将所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1接种于稻草。
较佳地，所述稻草中加入无机盐营养液，所述无机营养液的配制方法为，(NH4)2SO41.3~1.5 g、KH2PO4 1.8~2.2 g、尿素0.3~0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3~0.5g、CaCl2 0.3~0.5 g、MnSO4 2~3 mg、FeSO4·7H2O 7~8 mg、ZnSO4 2.0~2.5 mg、CoCl2 0.2~0.4 g，加水定容至1000 mL。
本发明还提供一种上述所述的能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉在产纤维素酶的应用，其特征在于：将所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1接种于以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为底物的发酵产酶培养基上，进行发酵培养。
较佳地，所述发酵产酶培养基包括CMC-Na 8~15 g/L、(NH4)2SO4 2~5 g/L、MgSO4·7H2O 0.3~0.7 g/L、K2HPO4 1~3 g/L、牛肉膏2~6 g/L、蛋白胨6~12 g/L。
较佳地，所述发酵培养条件为，培养温度为23~35℃，摇床转速为120~180 rpm/min。
本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1具有以下优点：
（1）本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1具有良好的纤维素降解能力，能够产生纤维素酶，且具有较强的内切葡萄糖苷酶活性、滤纸酶活性、外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。
（2）本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1能够降解降解稻草秸秆产生2-苯乙醇。
（3）本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草的发酵液能够抑制拟茎点霉、稻瘟菌和镰刀尖孢菌。
本发明的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1，保藏日期为2019年 8月7 日，保藏编号为CCTCC NO:M 2019608，分类命名为草酸青霉（Penicillium oxalicum），保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学。
附图说明
图1为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1透明水解圈图；
图2为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1菌落形态图；
图3为葡萄糖标准曲线；
图4为滤纸降解结果图；
图5为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草曲线图；
图6为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1把稻草降解成汤液图；
图7为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草扫描电镜图；
图8为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草质谱分析结果图；
图9为2-苯乙醇标准曲线图；
图10为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草样品中2-苯乙醇峰图；
图11为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草发酵液与拟茎点霉对峙结果图；
图12为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草发酵液与稻瘟菌对峙结果图；
图13为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草发酵液与镰刀尖孢菌对峙结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
实施例1 降解纤维素菌株的筛选
筛选培养基：CMC-Na 10 g、(NH4)2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3 g、KH2PO4 2 g、MnSO4 1.6mg、FeSO4 5 mg、ZnSO4 2.5mg、CoCl2 2.0 mg、琼脂20 g、pH=7.0，定容至1000 mL；
种子培养基：CMC-Na 10 g、蛋白胨 3 g、KH2PO4 4 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、pH=6.0，定容至1000 mL；
发酵产酶培养基：CMC-Na 10g、(NH4)2SO4 4.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、pH自然，定容到1000 mL；
初筛：称取土样10ｇ，放入装有90 mL无菌水的三角瓶中，置于摇床150 rpm振荡30min后取出，逐级稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的6种浓度，将6种浓度的稀释液分别涂布于筛选培养基上，重复3次，于25 ℃培养3 d．待菌丝长出后，再接种于新的筛选培养基上纯化，直至获得纯菌株为止。
复筛：透明圈法初筛对纤维素有降解活性的菌株，将分离的单个菌株及其混合菌分别点种于筛选培养基上，25 ℃培养3 d，用1.0 g /L刚果红染色30 min，倾去染液，再用1mol/L的NaCl水溶液脱色1 h，测菌落直径（d，cm）和水解圈直径（D，cm），采用Dp表示水解能力：Dp=(D/d)2。
结果显示，水解圈方初筛得到菌株T1 Dp=(D/d)2=4，见图1，表明菌株T1具有较好的纤维素降解能力。菌株T1鉴定为草酸青霉（Penicillium oxalicum），具有如SEQ ID:1所示的核苷酸序列。菌株T1的菌落形态图如图2所示，菌落形态平坦，质地绒状，菌丝体初期为白色，后期变为灰绿色。
实施例2 降解纤维素菌株的降解酶活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定滤纸酶活性和内切型葡萄糖苷酶活性、外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。
2.1 葡萄糖标准曲线制作
葡萄糖标准溶液：称取于103 ℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1 g，用水定容至100mL；
磷酸缓冲液：0.1 mol/L pH 6.0（适用于中性纤维素酶）分别称取一水磷酸二氢钠121.0 g和二水磷酸氢二钠21.89 g，将其溶解在1 L去离子水中。调节溶液的pH到6.0；
DNS试剂：称取3,5-二硝基水杨酸10 g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠l0g，在50 ℃水浴中（磁力）搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠200 g、苯酚（重蒸）2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。
分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于l0 mL，容量瓶中，用水定容至10 mL，盖塞，摇匀备用。
按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中（每管号平行作3个样），混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL，盖塞，混匀。用10 mm比色杯，在分光光度计波长540 nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程，线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
表1 葡萄糖标准曲线
Figure 34460DEST_PATH_IMAGE001
所得葡萄糖标准曲线如图3所示，y=0.334x-0.0184。
2.2 DNS法测定纤维素酶
羧甲基纤维素钠（CMC-Na）化学纯（上海光华化学试剂厂）在25℃，2%水溶液，粘度800 mPa·s-1200 mPa·s。
CMC-Na溶液：称取2 g CMCNa，精确至1 mg，缓缓加入磷酸缓冲液200 mL并加热至80 ℃-90 ℃，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至300mL，用2 mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到（6.0士0.05）（中性纤维素酶），最后定容到300 mL，搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。
粗酶液制备：将初筛获得的菌株按5％的接种量分别接种于发酵产酶培养基中，在摇床（25 ℃，150 rpm/ min）培养3 d后，8000×g离心10 min，取上清液即为制备的粗酶液。
（1）内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定方法
取四支25 mL刻度具塞试管（一支空白管，三支样品管），分别向四支管中，准确加入用相应pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶液2.00 mL，分别准确加入稀释好的粗酶液0.50 mL于三支样品管中（空白管不加），用漩涡混匀器混匀，盖塞。将四支试管同时置于（50+0.1）℃水浴中，准确计时，反应30 min，取出。迅速、准确地向各管中加入DNS试剂3.0 mL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50 mL，摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL。以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540 nm下，用10 mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。
CMCA-DNS酶活力，按下式计算。
Figure 35914DEST_PATH_IMAGE002
式中：X1—羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）,u/g（或u/mL）;
A为—吸光度在标准曲线上查得（或计算出）的还原糖量，mg;
1/0.5为—换算成酶液1 mL;
n为—酶样的稀释倍数;
2为—时间换算系数。
（2）滤纸酶活力（FPA）的测定方法：
将直径15 cm快速定性滤纸（杭州新华一号滤纸）滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h；将水分平衡后的滤纸制成宽1 cm、质量为50mg的滤纸条，折成M型，备用。取四支25 mL刻度具塞试管（一支空白管，三支样品管）。将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部（沿l cm方向竖直放入）。分别向四支管中，准确加入相应pH的缓冲溶液1.50 mL。分别准确加入稀释好的待测酶液0.50 mL于三支样品管中（空白管不加），使管内溶液浸没滤纸，盖塞。将四支试管同时置于（50士0.1）℃水浴中，准确计时，反应60 min，取出。立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0 mL。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50 mL，摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，加热10 min，取出，迅速冷却至室温，加水定容至25 mL，摇匀。以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540 nm下，用10 mm比色杯，分别测量三支平行管中样液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。
按滤纸酶活力（FPA），按下式计算。
Figure 434851DEST_PATH_IMAGE004
Figure 428215DEST_PATH_IMAGE005
—样品的滤纸酶活力（FPA）,µ/g（或µ/ mL）;
A—根据吸光度在标准曲线上查得（或计算出）的还原糖量，mg;
1/0.5—换算成酶液1 mL;
n—酶样的稀释倍数。
（3）外切酶活性测定
方法同（2），只是用脱脂棉代替滤纸
（4）β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，β-Gase）活力的测定
方法同（1），只是用水杨苷溶液替代CMC-Na溶液。
根据y=0.334x-0.0184，计算各个反液中的葡萄糖含量，再根据公式计算滤纸酶活性和内切型葡萄糖苷酶活性、外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性结果见表2：
表2 DNS法测定纤维素酶活性
编号 内切葡萄糖苷酶酶活 滤纸酶酶活 外切酶酶活 B-Gase
T1 78.68 u/mL 30 u/mL 22 u/mL 39 u/mL
实施例3降解纤维素菌株的滤纸降解测定
滤纸降解培养基：(NH4)2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3 g KH2PO4 2 g、MnSO4 1.6 mg、FeSO45 mg 、ZnSO4 2.5mg、CoCl2 2.0 mg加蒸馏水至1 L，取5 mL培养基于试管中，加入滤纸50mg，121 ℃ 20 min。灭菌后用接种针沾取少量T1孢子接种于试管里，28 ℃培养。
结果如图4所示（左侧1至3试管为菌株T1，最右侧试管为对照），菌株T1能崩解滤纸，说明其滤纸酶活力非常高。
实施例4 降解纤维素菌株的稻草降解研究
Mandel’s无机盐营养液：(NH4)2SO4 1.4 g、KH2PO4 2.0 g、尿素0.3 g、微量元素MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3 g、MnSO4 2.5 mg、FeSO4·7H2O 7.5 mg、ZnSO4 2.0 mg、CoCl20.3 g，加水定容至 1000 mL。
将稻草于80 ℃烘干至恒重后，截成长度为 2～3 cm，分别称取 10 g 的稻草于15个250 mL 锥形瓶，加入150 mL无机盐营养液121℃灭菌 30 min。将草原青霉菌T1接种于装有2 mL发酵产酶培养基的试管中，28 ℃、200 rpm、48 h后全部接入锥形瓶中24 h，28 ℃、200 rpm直至稻草被降解成汤，同时分别每间隔24 h分别取样进行固液分离，分别进行以下分析:
4.1 计算稻草降解率
稻草残渣80 ℃烘干至恒重后称重，计算稻草降解率。
结果显示，菌株T1在发酵降解稻草1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d和9 d后，稻草残渣干重分别为：9.67、8.61、8.21、7.84、7.71、7.56、7.27、6.86和3.53，计算稻草降解率分别为：3.3%、13.9%、17.9%、21.6%、22.9%、24.4%、27.8%、31.4%和64.7%，稻草降解过程见图5，从图5可见菌株T1对稻草降解能力很强，前2d能迅速软化稻草，随后菌体大量增殖同时缓缓降解稻草，到了第9 d，迅速将稻草固体降解成汤液，降解结果见图6。
4.2 扫描电镜分析
取一定量的稻草残渣用乙醇和丙酮清洗，冷冻干燥后，喷金后在蔡司Sigma 500扫描电镜中观察稻草秸秆表面的结构变化。
结果如图7显示（A为对照、B为降解第5 d图和C为降解第9 d），对照图中可以清楚看到秸秆的表面毛发状的丝状物、小圆点和大圆点，图中的大小突出的圆点是秸秆结构中的硅结构，硅化结构体填充在由纤维素胶团组成的细胞壁孔隙中，硅结构表面还有一层致密的蜡质结构，将秸秆包裹，硅结构和蜡质层的存在也是秸秆难以降解的原因之一。降解5d的图中的硅结构裸露的越来越明显，原始的秸秆中的硅结构是被半纤维素和蜡质包裹起来，而降解天数多的图中蜡质和半纤维素层降解脱落，露出纤维素和硅结构。降解后期第9d天的图可以看出，随着降解的继续进行大小球状的裸露越来越明显，出现了明显的裂痕，秸秆的表面裂解的情况越来越严重。
4.3 液体用等体积的二氯甲烷萃取，有机膜过滤后，用气相色谱-四级杆质谱联用仪（安捷伦 7890B-5977A）测定降解产物。气质联用仪条件：色谱柱：DB-5MS或与其功能一样的柱子；载气：He气；流速：1 mL/min;程序：60 ℃（3 min)，再以5 ℃/min升温至250 ℃，保持20 min。
结果见图8和表3，从中可见菌株T1降解稻草的降解产物中存在2-苯乙醇。
表3 质谱峰列表
m/z 丰度
51 4018.82
65 8292.47
77 2460.41
84 4352.04
86 2460.62
91.1 51299.91
92.1 28688.17
109 2742.72
122.1 14316.59
124.1 2673.9
4.4气相色谱分析2-苯乙醇含量
安捷伦气相色谱7890B
Agilent DB-WAX：30 m×0.53 mm×1.0 μm 240 ℃（Max）
进样器温度（Inlet）：250 ℃；分流比（Split Ration）：10∶1；
氢火焰离子检测器温度（Detector）：250 ℃；尾吹气（Make up flow）：20 mL/min；
柱温（Oven）：70 ℃(2 min) →升温速率（25 ℃/min）→220 ℃(2 min)；柱流量（Flow）：5 mL/min；
载气（Gas）：氮气（N2）；助燃气（Air）：300 mL/min；燃气（H2）：30 mL/min；
进样量：1µL
绘制苯乙醇标准曲线，如图9所示，回归方程为：峰面积＝2104.46567×浓度-1008.9698，相关系数＝0.99769。
利用苯乙醇标准曲线计算菌株T1降解稻草后样品中2-苯乙醇的含量。样品气相色谱图见图10，2-苯乙醇的峰面积为52.85038，计算得样品中2-苯乙醇的含量为1.0 g/L。
实施例5 降解稻草发酵液抑菌实验
因为菌株T1降解稻草发酵液中检测到了2-苯乙醇，所以进行发酵液与病原真菌对峙实验。吸取50 μＬ发酵液滴加于PDA平皿中央，在其周围涂上拟茎点霉孢子、稻瘟菌孢子和镰刀尖孢菌孢子，28 ℃培养48 h。结果如图11-13所示，发酵液能很好地抑制拟茎点霉、稻瘟菌和镰刀尖孢菌孢子生长。
本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1具有良好的纤维素降解能力，能够产生纤维素酶，且具有较强的内切葡萄糖苷酶活性、滤纸酶活性、外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。
本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1能够降解降解稻草秸秆产生2-苯乙醇。
本发明提供的草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1降解稻草的发酵液能够抑制拟茎点霉、稻瘟菌和镰刀尖孢菌。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 江西省科学院微生物研究所
<120> 一种能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 565
<212> DNA
<213> 草酸青霉(Penicillium oxalicum)
<400> 1
tgcggaagga tcattaccga gtgagggccc tctgggtcca acctcccacc cgtgtttatc 60
gtaccttgtt gcttcggcgg gcccgcctca cggccgccgg ggggcatccg cccccgggcc 120
cgcgcccgcc gaagacacac aaacgaactc ttgtctgaag attgcagtct gagtacttga 180
ctaaatcagt taaaactttc aacaacggat ctcttggttc cggcatcgat gaagaacgca 240
gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgagt ctttgaacgc 300
acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg agcgtcattg ctgccctcaa 360
gcacggcttg tgtgttgggc tctcgccccc cgcttccggg gggcgggccc gaaaggcagc 420
ggcggcaccg cgtccggtcc tcgagcgtat ggggcttcgt cacccgctct gtaggcccgg 480
ccggcgcccg ccggcgaaca ccatcaatct taaccaggtt gacctcggat caggtaggga 540
tacccgctga acttaagcat atcaa 565

Claims (6)

1.一种能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉，其特征在于：所述草酸青霉为草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2019608。
2.如权利要求1所述的能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉在产2-苯乙醇中的应用，其特征在于：将所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1接种于稻草。
3.如权利要求2所述的能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉在产2-苯乙醇中的应用，其特征在于：所述稻草中加入无机盐营养液，所述无机营养液的配制方法为，(NH4)2SO4 1.3~1.5 g、KH2PO4 1.8~2.2 g、尿素0.3~0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3~0.5g、CaCl2 0.3~0.5 g、MnSO42~3 mg、FeSO4·7H2O 7~8 mg、ZnSO4 2.0~2.5 mg、CoCl2 0.2~0.4 g，加水定容至 1000mL。
4.如权利要求1所述的能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉在产纤维素酶中的应用，其特征在于：将所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）T1接种于以CMC-Na为底物的发酵产酶培养基上，进行发酵培养。
5.如权利要求4所述的能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉在产纤维素酶中的应用，其特征在于：所述发酵产酶培养基包括CMC-Na 8~15 g/L、(NH4)2SO4 2~5 g/L、MgSO4·7H2O0.3~0.7 g/L、K2HPO4 1~3 g/L、牛肉膏2~6 g/L、蛋白胨6~12 g/L。
6.如权利要求4所述的能降解稻草产2-苯乙醇的草酸青霉在产纤维素酶中的应用，其特征在于：所述发酵培养条件为，培养温度为23~35℃，摇床转速为120~180 rpm/ min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111748476A (zh) * 2020-06-16 2020-10-09 吉林工程技术师范学院 一种秸秆降解菌分离、筛选、鉴定方法
CN113583780A (zh) * 2021-09-09 2021-11-02 四川省农业科学院水稻高粱研究所 一种增加小曲白酒风味的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559506A (zh) * 2010-12-07 2012-07-11 中国农业科学院作物科学研究所 一种草酸青霉菌及其应用
JP2013223489A (ja) * 2012-03-21 2013-10-31 Chube Univ バイオマス糖化酵素群を有する微生物およびその利用
CN106047730A (zh) * 2016-08-19 2016-10-26 广西大学 草酸青霉eu2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559506A (zh) * 2010-12-07 2012-07-11 中国农业科学院作物科学研究所 一种草酸青霉菌及其应用
JP2013223489A (ja) * 2012-03-21 2013-10-31 Chube Univ バイオマス糖化酵素群を有する微生物およびその利用
CN106047730A (zh) * 2016-08-19 2016-10-26 广西大学 草酸青霉eu2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Newly isolated Penicillium oxalicum A592-4B secretes enzymes that degrade milled rice straw with high efficiency;Aoyama等;《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》;20151231;全文 *
草酸青霉菌生产纤维素酶的反应条件优化;李洋等;《生物技术通报》;20160226(第02期);全文 *

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