CN112852792B - 用于降解烟梗的复合酶及其在降解烟梗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于降解烟梗的复合酶及其在降解烟梗中的应用。本发明公开的用于降解烟梗的复合酶，由漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成，所述漆酶由血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377制备得到；所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18573。利用本发明的复合酶可实现烟梗生物质的有效降解。本发明的复合酶不仅可用于烟梗生物质进行降解，也可以用于其他废弃生物质的降解中，如玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆和其他含有木质纤维素结构的生物质材料，具有广泛的应用前景。

Description

用于降解烟梗的复合酶及其在降解烟梗中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，用于降解烟梗的复合酶及其在降解烟梗中的应用。
背景技术
中国是一个农业大国，每年废弃的生物质材料约有40亿吨，如林业废弃物、禽畜粪便、生活垃圾和秸秆等。这些废弃的生物质材料一般通过直接焚烧、生物转化、热化学转化、液化等方式而被利用，但对于秸梗来说，由于其中含有丰富的木质纤维素结构，导致其利用效率低下，很难被降解，所以对秸梗进行预处理以提高其利用效率是当前一个急需解决的问题。
烟梗是烟叶原料的重要组成部分，占烟叶总重量的30％左右，但在卷烟工业中其通常作为一种废弃的生物质而存在，浪费资源的同时也造成了环境的严重污染。烟梗细胞壁物质主要包括木质素、纤维素、半纤维素和果胶等成分，约占烟梗干重的40％，实现了这些成分的降解才能更加有效的促进生物质的转化。传统的降解方法主要有物理法和化学法，这两种方法虽然能起到很好的降解效果但是一般比较耗能且会对环境造成二次污染，所以不具有良好的应用前景。相比之下，生物预处理是一种清洁环保的方法，且在生物质的预处理方面已经得到了一定程度的应用。
目前对于木质素、纤维素、半纤维素和果胶的生物降解多是通过漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等单独进行，这一方法虽然能起到一定的降解效果，但存在着很大的缺陷。首先一方面是难以将每种酶的效用最大化，导致了酶的用量大和资源浪费；另外一方面是酶解效率低、周期长、对环境的条件要求比较高等，导致了该方法较难得到广泛的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何降解生物质，尤其是如何降解烟梗。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种复合酶，由漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成，所述漆酶由血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377制备得到；所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18573。
上述复合酶中，所述漆酶按照漆酶的制备方法得到；所述漆酶的制备方法，包括：培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377，收集发酵液即得到漆酶。
收集发酵液可包括收集所述发酵液的非菌体部分。
所述漆酶可为所述发酵液也可为干燥所述发酵液得到的干粉。
培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377所用培养基可为产酶发酵培养基，所述产酶发酵培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述产酶发酵培养基中的浓度分别为：十二水合磷酸二氢钠0.39g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.0315g/L，二水合氯化钙0.1g/L，一水合硫酸锰0.035g/L，三水合乙酸钠0.408g/L，五水合硫酸铜0.168g/L，七水合硫酸锌0.028g/L，六水合氯化钴0.06g/L，酒石酸铵3g/L，琥珀酸钠1.18g/L，吐温80 1mL/L，维生素B1 10μg/L，维生素B2 5μg/L，维生素B6 5μg/L，玉米粉40g/L。
所述漆酶的制备方法还可包括向培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377的发酵体系中添加2,5-二甲基苯胺。
所述2,5-二甲基苯胺在所述发酵体系中的浓度可为10μM。
所述2,5-二甲基苯胺的添加在所述培养的第3-5天(如第4天)进行。
所述培养的时间可为8-10天。
培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377的温度可为28-30℃。
培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377的温度可为28℃或30℃。
培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377可在黑暗下进行。
上述复合酶中漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶活之比可为0.146:0.01-0.3:0.01-0.1:0.01-0.3。
具体的，上述复合酶中漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶活之比可为0.146：0.01：0.01：0.0753。
所述复合酶可用于降解生物质，尤其是生物质中的木质素、纤维素、半纤维素和/或果胶。
本发明还提供了一种复合酶制剂，所述复合酶制剂的活性成分为所述复合酶。
本发明还提供了烟梗的降解方法，所述方法包括：向待降解烟梗中添加所述复合酶进行酶解，实现所述待降解烟梗的酶解。
上述方法中，所述复合酶的添加量可满足：每克待降解烟梗中漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的添加量分别为0.005-0.5U、0.01-0.3U、0.01-0.1U和0.01-0.3U。
具体的，所述复合酶的添加量可满足：每克待降解烟梗中漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的添加量分别为0.146U、0.01U、0.01U、0.0753U。
所述复合酶可先用水制成酶液后喷至所述待降解烟梗上。每5克烟梗所喷洒的酶液的体积可为1.75mL。
上述方法中，所述酶解可在25-30℃下进行。
所述酶解的时间可为48小时。
所述酶解可在pH值为4-5下进行。
所述复合酶或所述复合酶制剂在制备生物质降解产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述复合酶或所述复合酶制剂在生物质降解中的应用，也属于本发明的保护范围。
上文中，所述生物质降解可为生物质中木质素、纤维素、半纤维素和/或果胶的降解。
所述生物质可为烟梗生物质、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆或其他含有木质纤维素结构的生物质材料。
所述复合酶、所述复合酶制剂或所述烟梗的降解方法在制备卷烟中的应用，也属于本发明的保护范围。
利用本发明的复合酶可实现烟梗生物质的有效降解。如使烟梗中木质素的降解率为20％，分别用中国专利CN200910083514.7中的血红密孔菌MK2001漆酶、“宋自力等，血红密孔菌高产漆酶菌株的筛选及其对烟梗的生物降解，菌物学报，2019年3月22日，38(3):381-392”中的血红密孔菌H275漆酶、本研究中的血红密孔菌WYS377漆酶以及复合酶在30℃条件下处理烟梗48h，酶的用量分别为MK2001漆酶0.335U/g烟梗、H275漆酶0.319U/g烟梗、WYS377漆酶0.291U/g烟梗、复合酶中的漆酶0.146U/g烟梗。表明了在相同的处理条件下本研究所开发的复合酶不仅可以节省漆酶的用量，还可以实现对生物质中的木质素、纤维素、半纤维素和果胶同时降解。本发明的复合酶不仅可用于烟梗生物质进行降解，也可以用于其他废弃生物质的降解中，如玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆和其他含有木质纤维素结构的生物质材料，具有广泛的应用前景。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)
生物材料的菌株编号：WYS377
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年9月16日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18573
附图说明
图1为WYS 377菌株的形态特征。
图2为WYS 377菌株ITS-5.8SrDNA邻接树。
图3为WYS 377复合酶制剂处理前后烟梗生物质的扫描电镜观察(放大200倍)。A.处理前；B.处理后。
图4为在不同血红密孔菌WYS 377漆酶用量处理条件下烟梗中木质素、纤维素、半纤维素和果胶组分的酶解率。
图5为在不同市售漆酶用量处理条件下烟梗中木质素、纤维素、半纤维素和果胶组分的酶解率。
图6为在不同纤维素酶用量处理条件下烟梗中木质素、纤维素、半纤维素和果胶组分的酶解率。
图7为在不同半纤维素酶用量处理条件下烟梗中木质素、纤维素、半纤维素和果胶组分的酶解率。
图8为在不同果胶酶用量处理条件下烟梗中木质素、纤维素、半纤维素和果胶组分的酶解率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
产酶发酵培养基为无菌培养基，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为：十二水合磷酸二氢钠0.39g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.0315g/L，二水合氯化钙0.1g/L，一水合硫酸锰0.035g/L，三水合乙酸钠0.408g/L，五水合硫酸铜0.168g/L，七水合硫酸锌0.028g/L，六水合氯化钴0.06g/L，酒石酸铵3g/L，琥珀酸钠1.18g/L，吐温80 1mL/L，维生素B1 10μg/L，维生素B2 5μg/L，维生素B65μg/L，玉米粉(即玉米面)40g/L。
pH4的酒石酸缓冲液：首先分别配制浓度均为100mmol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液；酒石酸溶液为向水中加入酒石酸得到的溶液，酒石酸在溶液中的浓度为100mmol/L；酒石酸钠溶液为向水中加入酒石酸钠得到的溶液，酒石酸钠在溶液中的浓度为100mmol/L；分别采用100mmol/L的酒石酸溶液调节酒石酸钠溶液的pH至4，即得到为pH为4的酒石酸缓冲液。
下述实施例所用纤维素酶(10000U/g)为上海麦克林生化科技有限公司产品，货号为C805042，酶活定义为：在pH4.8、50℃下每分钟产生1μg葡萄糖定义为1个酶活力单位(U)。
下述实施例所用半纤维素酶(20000U/g)为上海源叶生物科技有限公司产品，货号为S10045，酶活定义为：在pH 4.0-5.5、30-60℃下每分钟催化底物水解释放出1μg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
下述实施例所用果胶酶(500000U/g)为北京拜尔迪生物技术有限公司产品，货号为DE0141，酶活定义为：在pH3.5、50℃下每小时分解果胶产生1μg半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
下述实施例所用市售漆酶为西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司产品，货号为51639，酶活定义为：在pH4.5、30℃下每分钟氧化1μmol底物ABTS所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
实施例1：血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377高产漆酶菌株的的分离与鉴定
1、菌种采集及分离：发明人李伟于2006年10月在福建省武夷山国家自然保护区采集的腐朽木材样本中通过PDA培养基分离纯化得到一株菌，将该菌株记为菌株WYS377。
2、菌株的形态鉴定：将上述获得的菌株WYS377接种于PDA培养基上，30℃培养4-6天左右可铺满90mm培养皿，8天左右时开始有红色素积累。菌丝起初为白色绒毛状，边缘呈放射状，菌落中心具有明显的同心圆结构，随着培养天数的增加，这些菌丝上会被一层白色粉状的物质覆盖，经显微观察分析此白色粉状物质为菌丝断裂形成的节孢子，呈椭圆形，光滑，大小为4-5μm×2-3μm；菌株WYS377的生殖菌丝无隔，透明，壁薄，具有锁状联合结构。而其骨架菌丝较细，具有分支结构。结果见图1。
根据菌落形态特征，查阅《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》，与《中国大型真菌》中的各种真菌的形态特征相比较，菌株WYS377为密孔菌属真菌。
3、菌株的分子生物学鉴定：通过真菌通用引物ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS5(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)扩增该菌株WYS377的5.8SrDNA。将扩增到的DNA片段测序，其序列为序列表中序列1，序列长度为660bp。将序列1在NCBI中通过BLAST比对，发现序列1与P.sanguineus(FJ810182.1)有97％的相似度。根据BLAST结果，取相似度较高的菌株的5.8SrDNA序列构建N-J树，其中以裂褶菌作为外群。根据聚类分析结果(图2)可知，菌株WYS377与P.sanguineus聚在同一分支上，二者相似度高达99％，所以菌株WYS377与血红密孔菌(P.sanguineus)的亲缘关系要高于栓菌属真菌，进而将菌株WYS377鉴定为血红密孔菌(P.sanguineus)，故菌株WYS377也可称为血红密孔菌WYS377。
血红密孔菌WYS377已于2019年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18573。
实施例2：漆酶的制备
血红密孔菌WYS377是一种需氧菌，生长温度为28-30℃，发酵时能够分泌包括漆酶在内的多种物质到培养基中，本实施例利用血红密孔菌WYS377制备了漆酶。步骤如下：
1、产酶发酵：将实施例1的血红密孔菌WYS377接种于PDA培养基上，30℃培养4天，用无菌打孔器将生长有菌的培养基制成长宽均为1cm的菌饼，取8块菌饼置于100mL产酶发酵培养基中，然后于28℃、180r/min下黑暗培养10天，在培养第4天时加入诱导剂2,5-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺在培养体系中的浓度为10μM，培养结束后5000r/min离心20min，收集上清液，所得上清液即为WYS377漆酶粗酶液。实验设置3个重复。
2、漆酶活性测定：通过ABTS(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))法测定漆酶粗酶液中漆酶活性。1mL反应体系：0.5mL pH4的酒石酸缓冲液，0.39mL蒸馏水，10μL漆酶粗酶液和100μL 100mmol/L的ABTS水溶液，每个反应体系一种漆酶粗提液。将所得反应体系于30℃反应1min，测定其在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶粗酶液的漆酶活性，酶活定义为：1个酶活力单位(U)为在当前反应条件下每分钟氧化1μmol的底物ABTS所需的酶量。
结果显示，血红密孔菌WYS377所产的漆酶在上述的条件下活性高达286U/mL。
将WYS377漆酶粗酶液经-80℃冷冻干燥后得到血红密孔菌WYS377漆酶干粉，-20℃保存备用。
实施例3：利用复合酶制剂降解烟梗
1、复合酶制剂的制备
将实施例2的血红密孔菌WYS377漆酶干粉、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶按照漆酶、纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶的酶活(U)之比为0.146：0.01：0.01：0.0753的比例混合，得到WYS377复合酶制剂；
将实施例2的市售漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶按照漆酶、纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶的酶活(U)之比为0.146：0.01：0.01：0.0753的比例混合，得到市售漆酶复合酶制剂。
2、利用复合酶制剂降解烟梗
(1)利用蒸馏水(pH值为中性)将WYS377复合酶制剂制备成复合酶液。将烟梗在60℃条件下烘干至恒重，剪碎后均匀的铺到一次性培养皿中，将复合酶液均匀喷洒至培养皿中的烟梗上，每克烟梗所喷酶量为：漆酶0.146U，纤维素酶0.01U，半纤维素酶0.01U，果胶酶0.0753U，每5克烟梗所喷洒的复合酶液的体积为1.75mL。喷洒复合酶液后，将烟梗置于30℃下孵育48h进行酶解，酶解结束后置于100℃烘箱中烘干酶解后的烟梗1h使酶失活，然后置于60℃烘干至恒重。然后分别称取1g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素和果胶的含量，分别计算WYS377复合酶制剂对各组分的降解率。实验重复三次。
(2)利用蒸馏水将市售漆酶复合酶制剂制备成复合酶液。将烟梗在60℃条件下烘干至恒重，剪碎后均匀的铺到一次性培养皿中，将复合酶液均匀喷洒至培养皿中的烟梗上，每克烟梗所喷酶量为：漆酶0.146U，纤维素酶0.01U，半纤维素酶0.01U，果胶酶0.0753U，每5克烟梗所喷洒的复合酶液的体积为1.75mL。喷洒复合酶液后，将烟梗置于30℃下孵育48h进行酶解，酶解结束后置于100℃烘箱中烘干酶解后的烟梗1h使酶失活，然后置于60℃烘干至恒重。然后分别称取1g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素和果胶的含量，分别计算市售漆酶复合酶制剂对各组分的降解率。实验重复三次。
表1、两种复合酶制剂对各组分的降解率(％)
复合酶制剂 木质素 纤维素 半纤维素 果胶
WYS377复合酶制剂 20.243 15.367 7.497 13.151
市售漆酶复合酶制剂 15.125 12.513 5.233 8.715
结果(表1)显示，采用WYS377复合酶制剂与市售漆酶复合酶制剂处理烟梗，烟梗中木质素、纤维素、半纤维素和果胶的降解率在两组酶制剂之间具有显著性差异，从而表明了WYS377复合酶制剂在降解烟梗等生物质材料中具有非常显著的优势。
(3)对上述WYS377复合酶制剂处理前后烟梗的表面木质纤维素结构进行扫描电子显微镜的观察。首先从处理前后的烟梗中分别挑选出3片完整的烟梗切片，用蒸馏水漂洗干净，注意动作轻柔，防止其被人为破坏。用滤纸吸干烟梗切片的水分后，分别用戊二醛对切片进行固定，然后镀膜1h，通过日立冷场扫描电子显微镜观察，工作电压5kV，放大倍数200倍。结果如图3所示，与处理前的样品相比，WYS377复合酶制剂处理后的烟梗原有的致密结构被破坏，碎片增加，表面空隙增加，表明WYS377复合酶制剂对烟梗丝进行了有效降解。
3、复合酶中单组分酶降解烟梗
(1)、血红密孔菌漆酶降解烟梗
利用蒸馏水将实施例2得到的血红密孔菌WYS377漆酶干粉制备成漆酶母液，将漆酶母液利用蒸馏水进一步稀释，得到漆酶稀释液1、漆酶稀释液2、漆酶稀释液3、漆酶稀释液4和漆酶稀释液5。
将烟梗在60℃条件下烘干至恒重，剪碎后均匀的铺到一次性培养皿中，共设置15个培养皿，随机分为五组，每组三个重复，每个培养皿5g烟梗。
向第一组的烟梗上均匀喷洒漆酶稀释液1，漆酶的用量为0.001U/g烟梗；向第二组的烟梗上均匀喷洒漆酶稀释液2，漆酶的用量为0.005U/g烟梗；向第三组的烟梗上均匀喷洒漆酶稀释液3，漆酶的用量为0.3U/g烟梗；向第四组的烟梗上均匀喷洒漆酶稀释液4，漆酶的用量为0.5U/g烟梗；向第五组的烟梗上均匀喷洒漆酶稀释液5，漆酶的用量为0.7U/g烟梗；每个培养皿中所喷洒的漆酶稀释液的体积均为1.75mL。
喷洒漆酶稀释液后，将五组烟梗置于30℃下孵育48h进行酶解，酶解结束后置于100℃烘箱中烘干酶解后的烟梗至恒重。然后分别称取1g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素和果胶的含量，并分别计算各组分的降解率，结果见表2和图4。
表2、血红密孔菌WYS377漆酶对各组分的降解率(％)
漆酶用量(U/g烟梗) 木质素 纤维素 半纤维素 果胶
0.001 2.938 1.789 1.479 1.903
0.005 6.789 3.884 2.893 3.446
0.3 20.114 15.077 7.175 12.205
0.5 28.171 17.574 8.527 13.602
0.7 31.716 19.041 9.224 15.034
当漆酶用量为0.3U/g烟梗时对木质素的降解速度较快，此时烟梗各组分的降解率分别为木质素20.114％、纤维素15.077％、半纤维素7.175％和果胶12.205％，而与这些组分的降解率基本相同(各组分降解率均无显著差异)时WYS377复合酶制剂中各酶的用量分别仅为漆酶0.146U/g烟梗、纤维素酶0.01U/g烟梗、半纤维素酶0.01U/g烟梗和果胶酶0.0753U/g烟梗。所以复合酶处理后不但各组分的降解率明显增加，而且复合酶中漆酶的用量比单独使用WYS377漆酶少了一半，节约了漆酶的用量。
(2)市售漆酶降解烟梗
利用pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液将市售漆酶制备成市售漆酶母液，将市售漆酶母液利用pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液进一步稀释，得到市售漆酶稀释液1、市售漆酶稀释液2、市售漆酶稀释液3、市售漆酶稀释液4和市售漆酶稀释液5。其中，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液制备方法为：首先分别配制浓度均为0.2mol/L的乙酸水溶液和乙酸钠水溶液，向乙酸钠水溶液中逐渐添加乙酸水溶液直至溶液的pH为4.8。
将烟梗在60℃条件下烘干至恒重，剪碎后均匀的铺到一次性培养皿中，共设置15个培养皿，随机分为五组，每组三个重复，每个培养皿5g烟梗。
向第一组的烟梗上均匀喷洒市售漆酶稀释液1，市售漆酶的用量为0.002U/g烟梗；向第二组的烟梗上均匀喷洒市售漆酶稀释液2，市售漆酶的用量为0.01U/g烟梗；向第三组的烟梗上均匀喷洒市售漆酶稀释液3，市售漆酶的用量为0.15U/g烟梗；向第四组的烟梗上均匀喷洒市售漆酶稀释液4，市售漆酶的用量为0.3U/g烟梗；向第五组的烟梗上均匀喷洒市售漆酶稀释液5，市售漆酶的用量为0.45U/g烟梗；每个培养皿中所喷洒的市售漆酶稀释液的体积均为1.75mL。
喷洒市售漆酶稀释液后，将五组烟梗置于30℃下孵育48h进行酶解，酶解结束后置于100℃烘箱中烘干酶解后的烟梗至恒重。然后分别称取1g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素和果胶的含量，并分别计算各组分的降解率，结果见表3和图5。
表3、市售漆酶对各组分的降解率(％)
市售漆酶用量(U/g烟梗) 木质素 纤维素 半纤维素 果胶
0.02 6.492 5.526 3.609 4.661
0.1 10.118 6.179 4.419 5.787
0.3 15.844 7.352 4.614 6.731
0.5 20.244 7.701 5.458 7.145
0.7 23.621 7.865 6.060 7.329
当市售漆酶用量为0.3U/g烟梗时对木质素的降解速度较快，对其他成分的降解不显著，此时烟梗各组分的降解率分别为木质素15.844％、纤维素7.352％、半纤维素4.614％和果胶6.731％，而与木质素的降解率基本相同时WYS377复合酶制剂中各酶的用量仅为漆酶0.069U/g烟梗、纤维素酶0.01U/g烟梗、半纤维素酶0.011U/g烟梗和果胶酶0.01U/g烟梗,此时复合酶处理后的烟梗各组分的降解率分别为木质素15.844％、纤维素12.289％、半纤维素5.773％、果胶9.634％，所以复合酶处理后不但各组分的降解率明显增加，而且复合酶中漆酶的用量比单独使用市售漆酶少了4.3倍，节约了漆酶的用量。
(3)纤维素酶降解烟梗
利用pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液将纤维素酶制备成纤维素酶母液，将纤维素酶母液利用pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液进一步稀释，得到纤维素酶稀释液1、纤维素酶稀释液2、纤维素酶稀释液3、纤维素酶稀释液4和纤维素酶稀释液5。
将烟梗在60℃条件下烘干至恒重，剪碎后均匀的铺到一次性培养皿中，共设置15个培养皿，随机分为五组，每组三个重复，每个培养皿5g烟梗。
向第一组的烟梗上均匀喷洒纤维素酶稀释液1，纤维素酶的用量为0.002U/g烟梗；向第二组的烟梗上均匀喷洒纤维素酶稀释液2，纤维素酶的用量为0.01U/g烟梗；向第三组的烟梗上均匀喷洒纤维素酶稀释液3，纤维素酶的用量为0.15U/g烟梗；向第四组的烟梗上均匀喷洒纤维素酶稀释液4，纤维素酶的用量为0.3U/g烟梗；向第五组的烟梗上均匀喷洒纤维素酶稀释液5，纤维素酶的用量为0.45U/g烟梗；每个培养皿中所喷洒的纤维素酶稀释液的体积均为1.75mL。
喷洒纤维素酶稀释液后，将五组烟梗置于30℃下孵育48h进行酶解，酶解结束后置于100℃烘箱中烘干酶解后的烟梗至恒重。然后分别称取1g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素和果胶的含量，并分别计算各组分的降解率，结果见表4和图6。
表4、纤维素酶对各组分的降解率(％)
纤维素酶用量(U/g烟梗) 木质素 纤维素 半纤维素 果胶
0.002 2.143 2.637 1.943 1.828
0.01 2.912 4.883 2.181 2.081
0.15 3.481 9.008 3.355 2.484
0.3 4.193 12.917 3.731 2.602
0.45 4.990 15.445 4.535 2.709
当纤维素酶用量为0.3U/g烟梗时对纤维素的降解速度较快，对其他成分的降解不显著，此时烟梗各组分的降解率分别为木质素4.193％、纤维素12.917％、半纤维素3.731％和果胶2.602％，而与纤维素的降解率基本相同时WYS377复合酶制剂中各酶的用量仅为漆酶0.005U/g烟梗、纤维素酶0.12U/g烟梗、半纤维素酶0.01U/g烟梗和果胶酶0.012U/g烟梗,此时复合酶处理后的烟梗各组分的降解率分别为木质素12.23％、纤维素12.917％、半纤维素5.258％、果胶8.986％，所以复合酶处理后不但各组分的降解率明显增加，而且复合酶中纤维素酶的用量比单独使用纤维素酶少了2.5倍，节约了纤维素酶的用量。
(4)半纤维素酶降解烟梗
利用蒸馏水将半纤维素酶制备成半纤维素酶母液，将半纤维素酶母液利用蒸馏水进一步稀释，得到半纤维素酶稀释液1、半纤维素酶稀释液2、半纤维素酶稀释液3、半纤维素酶稀释液4和半纤维素酶稀释液5。
将烟梗在60℃条件下烘干至恒重，剪碎后均匀的铺到一次性培养皿中，共设置15个培养皿，随机分为五组，每组三个重复，每个培养皿5g烟梗。
向第一组的烟梗上均匀喷洒半纤维素酶稀释液1，半纤维素酶的用量为0.001U/g烟梗；向第二组的烟梗上均匀喷洒半纤维素酶稀释液2，半纤维素酶的用量为0.01U/g烟梗；向第三组的烟梗上均匀喷洒半纤维素酶稀释液3，半纤维素酶的用量为0.05U/g烟梗；向第四组的烟梗上均匀喷洒半纤维素酶稀释液4，半纤维素酶的用量为0.1U/g烟梗；向第五组的烟梗上均匀喷洒半纤维素酶稀释液5，半纤维素酶的用量为0.2U/g烟梗；每个培养皿中所喷洒的半纤维素酶稀释液的体积均为1.75mL。
喷洒半纤维素酶稀释液后，将五组烟梗置于30℃下孵育48h进行酶解，酶解结束后置于100℃烘箱中烘干酶解后的烟梗至恒重。然后分别称取1g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素和果胶的含量，并分别计算各组分的降解率，结果见表5和图7。
表5、半纤维素酶对各组分的降解率(％)
半纤维素酶用量(U/g烟梗) 木质素 纤维素 半纤维素 果胶
0.001 2.321 1.987 2.681 1.973
0.01 2.772 2.500 3.916 2.073
0.05 3.308 3.039 6.628 2.182
0.1 3.527 3.684 9.199 2.572
0.2 3.730 3.726 10.868 2.664
当半纤维素酶用量为0.1U/g烟梗时对半纤维素的降解速度较快，对其他成分的降解不显著，此时烟梗各组分的降解率分别为木质素3.527％、纤维素3.684％、半纤维素9.199％和果胶2.572％，而与半纤维素的降解率基本相同时WYS377复合酶制剂中各酶的用量仅为漆酶0.005U/g烟梗、纤维素酶0.01U/g烟梗、半纤维素酶0.07U/g烟梗和果胶酶0.011U/g烟梗,此时复合酶处理后的烟梗各组分的降解率分别为木质素12.09％、纤维素10.532％、半纤维素9.199％、果胶8.757％，所以复合酶处理后不但各组分的降解率明显增加，而且复合酶中半纤维素酶的用量比单独使用半纤维素酶少了1.4倍，节约了半纤维素酶的用量。
(5)果胶酶降解烟梗
利用pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液将果胶酶制备成果胶酶母液，将果胶酶母液利用上述缓冲液进一步稀释，得到果胶酶稀释液1、果胶酶稀释液2、果胶酶稀释液3、果胶酶稀释液4和果胶酶稀释液5。其中，pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的制备方法为：首先分别配制0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液和0.1mol/L的柠檬酸水溶液，用柠檬酸水溶液调节磷酸氢二钠水溶液的pH至5。
将烟梗在60℃条件下烘干至恒重，剪碎后均匀的铺到一次性培养皿中，共设置15个培养皿，随机分为五组，每组三个重复，每个培养皿5g烟梗。
向第一组的烟梗上均匀喷洒果胶酶稀释液1，果胶酶的用量为0.002U/g烟梗；向第二组的烟梗上均匀喷洒果胶酶稀释液2，果胶酶的用量为0.01U/g烟梗；向第三组的烟梗上均匀喷洒果胶酶稀释液3，果胶酶的用量为0.15U/g烟梗；向第四组的烟梗上均匀喷洒果胶酶稀释液4，果胶酶的用量为0.3U/g烟梗；向第五组的烟梗上均匀喷洒果胶酶稀释液5，果胶酶的用量为0.45U/g烟梗；每个培养皿中所喷洒的果胶酶稀释液的体积均为1.75mL。
喷洒果胶酶稀释液后，将五组烟梗置于30℃下孵育48h进行酶解，酶解结束后置于100℃烘箱中烘干酶解后的烟梗至恒重。然后分别称取1g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素和果胶的含量，并分别计算各组分的降解率，结果见表6和图8。
表6、果胶酶对各组分的降解率(％)
Figure BDA0002293288000000111
Figure BDA0002293288000000121
当果胶酶用量为0.3U/g烟梗时对果胶的降解速度较快，对其他成分的降解不显著，此时烟梗各组分的降解率分别为木质素4.124％、纤维素3.538％、半纤维素2.871％和果胶12.318％，而与果胶的降解率基本相同时WYS377复合酶制剂中各酶的用量仅为漆酶0.005U/g烟梗、纤维素酶0.01U/g烟梗、半纤维素酶0.01U/g烟梗和果胶酶0.211U/g烟梗,此时复合酶处理后的烟梗各组分的降解率分别为木质素12.559％、纤维素10.459％、半纤维素6.049％、果胶12.318％，所以复合酶处理后不但各组分的降解率明显增加，而且复合酶中果胶酶的用量比单独使用果胶酶少了1.4倍，节约了果胶酶的用量。
步骤2-5的结果显示，烟梗中的各成分酶解48h后，每种酶在其适宜的浓度范围内仅能对其特异性底物发挥良好的降解作用，而对烟梗中其他成分的降解作用不明显。但当把不同的酶进行复合以后明显增加了烟梗丝各组分的降解率，并且在很大程度上节约了酶的用量。
4、样品中各组分降解率的测定方法
(1)木质素、纤维素和半纤维素的提取方法：
称取1g样品于100mL三角瓶中，加入50mL中性洗涤剂，100℃孵育1h，孵育结束后取出样品过滤，收集滤渣并烘干。之后将烘干的滤渣放入100mL三角瓶中，然后向三角瓶中加入50mLmL 2mol/L的盐酸水溶液，100℃孵育50min后过滤，收集滤液与滤渣，所得滤液即为半纤维素提取液。将所得滤渣用蒸馏水洗至pH为中性，60℃干燥后，放入100mL烧杯中，用72％(v/v)硫酸水溶液过夜提取。次日过滤，收集滤液与滤渣，所得滤液即为纤维素提取液，所得滤渣即为粗木质素。
其中，检测的酶解后的样品所来源的酶解前的样品的量与检测的酶解前的样品的量相等。
(2)木质素降解率的测定：
用蒸馏水将步骤(1)所得滤渣(即粗木质素)洗至中性pH，于60℃烘干称重(W)(即漏斗与烘干样品的总重量)，之后取出烘干样品放入电阻箱500℃孵育3h得灰分，称取灰分重量(W1)与漏斗重量，计算出木质素的含量(木质素含量＝W-漏斗重-W1)。
计算木质素的降解率，木质素的降解率＝(酶解前样品中木质素的含量-酶解后样品中木质素的含量)/酶解前样品中木质素的含量×100％。
(3)纤维素降解率的测定：
①葡萄糖标准曲线的制作：准确称取葡萄糖10mg，配制100μg/mL的葡萄糖标准液，再分别取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL依次放入7支具塞试管，补加蒸馏水到1mL，再分别向其中加入4mL的蒽酮试剂，100℃孵育10min，冷却后在620nm波长处测定吸光值，其中以未加葡萄糖的试管作为对照。以标准葡萄糖含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
②纤维素降解率的测定：首先将步骤(1)所得纤维素提取液适当稀释，再取1mL加4mL蒽酮试剂，100℃保温10min，于620nm波长下测OD值，由葡萄糖标准曲线求出葡萄糖含量，再换算成纤维素的含量，进一步计算纤维素的降解率，纤维素的降解率＝(酶解前样品中纤维素的含量-酶解后样品中纤维素的含量)/酶解前样品中纤维素的含量×100％。
(4)半纤维素降解率的测定：
①木糖标准曲线的制作：先准确称取木糖10mg，配制成1mg/mL标准木糖溶液，再分别取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL依次放入7支具塞试管，补加蒸馏水到1mL，再分别向其中加入4mL的地衣酚试剂，100℃孵育20min，冷却后在660nm波长处测定吸光值，其中以未加木糖的试管作为对照。以标准木糖含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
②半纤维素降解率的测定：首先将步骤(1)所得半纤维素提取液适当稀释，再取1mL加4mL地衣酚试剂，100℃保温20min，于660nm波长下测OD值，由木糖标准曲线求出木糖含量，再换算成半纤维素的含量，进一步计算半纤维素的降解率，半纤维素的降解率＝(酶解前样品中半纤维素的含量-酶解后样品中半纤维素的含量)/酶解前样品中半纤维素的含量×100％。
(5)果胶的提取及降解率的测定：
①半乳糖醛酸标准曲线的制作：首先准确称取半乳糖醛酸100mg，配制1mg/mL的标准液，分别取此液0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL用蒸馏水稀释至100mL，各取1mL加6mL浓硫酸，混匀后，85℃孵育15min，冷却后加入0.15％的咔唑无水乙醇溶液0.2mL，混匀后黑暗放置2h，于530nm处测定光吸收值，以未添加半乳糖醛酸的试管作为对照。以标准半乳糖醛酸含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
②果胶降解率的测定：称取1g样品于100mL三角瓶中，加入热的70％乙醇水溶液，超声60min之后过滤洗涤至滤液不呈糖的反应。将滤渣烘干后放入250mL三角瓶中，加入150mL 0.05mol/L的盐酸水溶液，100℃保温1h，之后用5mol/L氢氧化钠水溶液调节pH中性，即得到果胶提取液。取稀释后的提取液1mL，加6mL浓硫酸，摇匀后85℃孵育15min，冷却后加0.15％咔唑无水乙醇溶液0.2mL，混匀后黑暗放置2h，于530nm处测定光吸收值。根据标准曲线求出半乳糖醛酸的含量，再换算成果胶的含量，计算出果胶的降解率，果胶的降解率＝(酶解前样品中果胶的含量-酶解后样品中果胶的含量)/酶解前样品中果胶的含量×100％。
其中，检测的酶解后的样品所来源的酶解前的样品的量与检测的酶解前的样品的量相等。
本实施例所用试剂的配制方法为：
地衣酚试剂：配制100mL 37％的盐酸水溶液，向其中加入0.1g FeCl3，溶解后再加入0.2g地衣酚；
蒽酮试剂：0.2g蒽酮溶于100mL浓硫酸；
0.15％咔唑无水乙醇：取0.15g咔唑溶于100mL无水乙醇；
中性洗涤剂：乙二胺四乙酸二钠18.6g，硼酸钠6.8g，30g SDS，10mL乙二醇乙醚，磷酸氢二钠4.56g，用蒸馏水溶解后定容至1L。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 用于降解烟梗的复合酶及其在降解烟梗中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 660
<212> DNA
<213> 血红密孔菌（P. sanguineus）
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc ttaagttctg cgggtagtcc tacctgattt gaggtcagat 60
gtcaagaggt tgtcccatac aggacggtta gaagctcgcc aaacgcttca cggtcacagc 120
gtagacaatt atcacactga gagccgatcc gcacggaatc aagctaatgc attcaagagg 180
agccgaccga cgagggccag caagcctcca agtccaagcc cacagcatca caaggacgtg 240
tgggttgaga attccatgac actcaaacag gcatgctcct cggaatacca aggagcgcaa 300
ggtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacattact tatcgcattt 360
cgctgcgttc ttcatcgatg cgagagccaa gagatccgtt gctgaaagtt gtatttagat 420
gcgttagacg ctaatacatt ctgttacttt atgtgtttgt agtgatacat aggccggcag 480
aatgcctcaa agacccggag gccccgaagc ccacgccaaa cctacagtaa gtgcacaggt 540
gtagagtgga tgagcagggt gtgcacatgc cccggaaggc cagctacaac ccctttcaga 600
actcgttaat gatccttccg caggttcacc tacggaaacc ttgttacgac ttttacttcc 660

Claims (8)

1.复合酶，由漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成，所述漆酶由血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377制备得到；所述血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18573；
所述复合酶中漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶活之比为0.146：0.01：0.01：0.0753。
2.根据权利要求1所述的复合酶，其特征在于：所述漆酶按照漆酶的制备方法得到；所述漆酶的制备方法，包括：培养权利要求1中所述的血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377，收集发酵液即得到漆酶。
3.复合酶制剂，其活性成分为权利要求1或2所述复合酶。
4.烟梗的降解方法，包括：向待降解烟梗中添加权利要求1或2所述复合酶进行酶解，实现所述待降解烟梗的酶解。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述复合酶的添加量满足：每克待降解烟梗中漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的添加量分别为0.146：0.01：0.01：0.0753。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述酶解在25-30℃下进行。
7.权利要求1或2所述复合酶或权利要求3所述复合酶制剂在制备生物质降解产品中的应用；
或，权利要求1或2所述复合酶或权利要求3所述复合酶制剂在生物质降解中的应用。
8.权利要求1或2所述复合酶、权利要求3所述复合酶制剂或权利要求4-6中任一所述方法在制备卷烟中的应用。
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