CN109619658A - 一种酶解烟梗丝的方法及酶解后的烟梗丝用于烟草中的用途 - Google Patents

一种酶解烟梗丝的方法及酶解后的烟梗丝用于烟草中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶解烟梗丝的方法，包括如下步骤：将血红密孔菌漆酶按5‑70U/100g烟梗丝的比例添加到烟梗丝上，然后按100g烟梗丝补水30‑40ml到上述烟梗丝上，在一定温度下酶解一段时间后烘干，即得到酶解后的烟梗丝。本发明血红密孔菌的菌株的产酶量较高，且能够酶解烟梗丝中的纤维素、半纤维素、果胶、总糖以及一些其他的小分子物质。使酶解后的的烟梗丝非常适用于添加到烟草中，不仅有效利用了烟梗，而且使烟草的抽吸品质有明显提高。

Description

一种酶解烟梗丝的方法及酶解后的烟梗丝用于烟草中的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶解烟梗丝的方法及酶解后的烟梗丝用于烟草中的用途。
背景技术
烟叶是制造卷烟的最重要原料，而叶梗作为烟叶的重要组织结构，其重量约占烟叶总重量的30％左右。在卷烟中填加适量的烟梗丝，既可以减少烟梗废料对环境的污染，又可大大节省烟叶原料，有效降低卷烟成本，还可以在一定程度上使卷烟的物理特性得到改善，从而有助于卷烟品质的提高。然而，目前烟梗的利用率较低，烟梗的废弃在浪费资源的同时也造成了环境的严重污染。烟梗细胞壁物质主要包括木质素、纤维素、半纤维素和果胶等成分，约占烟梗干重的40％，其中结构最为复杂的木质素组分是造成烟梗杂气、木质气重和燃烧时灼喉感的主要因素。烟梗添加量过多，会造成卷烟产品的香气不足、刺激性增强、感官品质下降等质量缺陷。另外，木质素结构中所含的苯环是烟气焦油中稠环芳烃类、芳香胺类等物质的主要来源，这些物质对卷烟烟气品质负面影响较大。因此只有对烟梗进行预处理，有效降低其中的木质素组分含量，才能更加有效地利用烟梗资源，提高卷烟产品品质。因此，如何提高烟梗利用率并改善烟梗丝质量和提升烟梗丝品质已成为烟草行业的研究热点。目前对烟梗的处理主要是采用酶解的方法，现有技术有三种方法用于烟梗木质素的酶解，即化学法、物理法和生物法，其中化学法常用热碱处理，需要消耗大量的化学品和能源，且产生的废液还会造成严重的环境污染；而物理法具有能量消耗大和噪音大等缺点，也不适宜工业化应用；其中生物法酶解木质素已受到广泛关注，但现阶段能有效利用生物法酶解烟梗中木质素还存在一定的技术限制，因而应用还较少，如关于细菌作用于烟梗纤维素、果胶等的研究已有报道，但酶解率非常的低，效果较差。对真菌酶解烟梗丝还未见报道。
为解决上述问题提出本发明。
发明内容
本发明利用一种产自于血红密孔菌的血红密孔菌漆酶生物酶解烟梗丝中木质素组分，将酶解后的烟梗丝添加到普通烟丝中，可以达到降低卷烟杂气和刺激性的目的，提高了梗丝抽吸品质。本发明的方法提高了烟梗丝的利用率。
本发明的技术方案如下：
本发明第一方面公开了一种酶解烟梗丝中木质素的方法，包括如下步骤：将血红密孔菌漆酶按5-70U/100g烟梗丝的比例添加到烟梗丝上，然后按100g烟梗丝补水30-40ml到上述烟梗丝上，在一定温度下酶解一段时间后烘干，即得到酶解后的烟梗丝。
优选地，所述血红密孔菌漆酶为血红密孔菌漆酶粗酶液或血红密孔菌漆酶干粉。
优选地，所述酶解时的温度为25-30℃；pH值为4.0-5.0；所述酶解的时间为2d。
优选地，所述酶解时的温度为28℃；pH值为4.5。
优选地，所述血红密孔菌漆酶的用量为30U/100g烟梗丝。
优选地，所述血红密孔菌漆酶粗酶液或血红密孔菌漆酶干粉的制备方法为：将血红密孔菌接种于发酵培养基中，在30℃、pH为6.5、摇床为200rpm/min条件下发酵10d后，得到血红密孔菌漆酶粗酶液，经浓缩冷冻干燥后即得到所述血红密孔菌漆酶干粉。
优选地，所述血红密孔菌发酵培养基组成为：十二水合磷酸二氢钠0.39g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.0315g，二水合氯化钙0.1g，一水合硫酸锰0.035g，三水合乙酸钠0.408g，五水合硫酸铜0.168g，七水合硫酸锌0.028g，六水合氯化钴0.06g，酒石酸铵3g，琥珀酸钠1.18g，吐温80 1mL，维生素B1 10μg，维生素B2 5μg，维生素B6 5μg，玉米粉40g，加水定容至1L；
所述血红密孔菌发酵培养基发酵条件为：接种量为用无菌打孔器将培养好的菌株制成直径1cm左右的菌饼，接种10个菌饼于灭菌的100mL发酵培养基中，摇床200rpm/min，30℃，黑暗培养，培养3d后加入诱导剂2，5-二甲基苯胺进行诱导漆酶产生，诱导剂含量为0.01wt％；培养10d后，在4℃下10000rpm/min离心15min，上清液即为所述血红密孔菌漆酶粗酶液，经浓缩冷冻干燥后即得到所述血红密孔菌漆酶干粉。
本发明第二方面公开了上述方法得到的酶解后的烟梗丝用于烟草中的用途。
优选地，所述酶解后的烟梗丝按4-10wt％的比例加入到普通烟丝中，一般添加量为6wt％。
本发明的有益效果：
1、本发明首次将血红密孔菌漆酶用于生物酶解烟梗丝中木质素组分；将酶解后的烟梗丝用于烟草制备中，可以降低梗丝的杂气和刺激性，提高烟梗的利用率，达到了提高梗丝抽吸品质的目的。
2、现有研究中有报道称血红密孔菌能够酶解木材以及小麦秸秆中的木质素，但这些已报道的血红密孔菌漆酶产量较低，最高的菌株产酶量也只有100U/mL左右；并且处理时间长，一般在100U/mL的条件下酶解14d，木质素的酶解率才能达到41％。而本发明的血红密孔菌菌株的产酶量高，漆酶活性能达到360U/mL；且处理时间短，一般在5U/mL浓度下，2d便可达到65％的酶解率，所以非常适用于工业上酶解烟梗丝。
3、本发明的血红密孔菌漆酶的培养条件简单；通过发酵的粗酶液可以直接作用于烟梗材料，简化了中间步骤，方便操作；处理时间只需要两天，提高了处理的效率。本发明的漆酶的培养和酶解烟梗在常温下便可以进行，节约了能源和成本。
4、申请人发现，本发明的血红密孔菌菌株的发酵液中除了产生漆酶外，还会产生少量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶以及一些其他的小分子物质，不仅可以辅助漆酶酶解烟梗中的木质素，而且能够酶解烟梗丝中的纤维素、半纤维素、果胶以及一些其他的小分子物质，使酶解后的的烟梗丝非常适用于添加到烟草中，不仅有效利用了烟梗，而且使烟草的抽吸品质有明显提高。而现有技术中的血红密孔菌仅能酶解植物中的纤维素和木质素，还未见有酶解其他成分的相关报道。
附图说明
图1为在不同血红密孔菌漆酶浓度处理条件下处理48h后烟梗烟丝中木质素、纤维素、半纤维素、总糖和果胶组分的酶解率。
图2为血红密孔菌漆酶在30U/100g烟梗丝条件下不同时间下纤维素酶解率。
图3为血红密孔菌漆酶在30U/100g烟梗丝条件下不同时间下半纤维素酶解率。
图4为血红密孔菌漆酶在30U/100g烟梗丝条件下不同时间下木质素酶解率。
图5为血红密孔菌漆酶在30U/100g烟梗丝条件下不同时间下总糖酶解率。
图6为血红密孔菌漆酶在30U/100g烟梗丝条件下不同时间下果胶酶解率。
图7为血红密孔菌漆酶在30U/100g烟梗丝、酶解时间为2d条件下纤维素、半纤维素、木质素、总糖及果胶酶解率。
具体实施方式
本发明公开了一种利用产自于血红密孔菌的血红密孔菌漆酶生物酶解烟梗丝中木质素来改善卷烟品质的方法。
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)可通过商业途径购买得到(如中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC等)。
实施例1：血红密孔菌漆酶的制备
本实施例中所用的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)菌株由中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室保藏，菌丝体在马铃薯葡萄糖斜面培养基(PDA)上4℃保存。
菌株的活化培养：从血红密孔菌的PDA培养斜面中取出菌丝体接种到PDA平板培养基上活化，30℃培养2-3d后，转接到新的PDA平板上，30℃培养5d，用于血红密孔菌漆酶的发酵。
菌株的产漆酶发酵培养：先用无菌打孔器将培养好的菌体制备成直径为1cm的菌饼，将培养好的菌体接入到产酶培养基中，每瓶培养基接入10个菌饼，在30℃，200rpm/min的条件下黑暗培养10d，在接种3d后加入0.01％的2，5-二甲基苯胺溶液(V诱导剂∶V培养基＝1∶1000)。
血红密孔菌漆酶粗酶液和漆酶干粉的制备：将发酵完毕的发酵液，4℃下10000rpm/min离心15min，得到的上清液即为血红密孔菌漆酶粗酶液，测定漆酶活性后4℃保存备用；或经过冷冻干燥成血红密孔菌漆酶干粉，测定漆酶活性后-20℃保存备用。
本实施例所述的PDA培养基的配制方法为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH自然。121℃灭菌20min备用。
本实施例所述的菌株产漆酶发酵培养基的配制方法为：十二水合磷酸二氢钠0.39g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.0315g，二水合氯化钙0.1g，一水合硫酸锰0.035g，三水合乙酸钠0.408g，五水合硫酸铜0.168g，七水合硫酸锌0.028g，六水合氯化钴0.06g，酒石酸铵3g，琥珀酸钠1.18g，吐温80 1mL，维生素B1 10μg，维生素B2 5μg，维生素B65μg，玉米粉40g，加水至1L，pH自然。分装100mL到500mL三角瓶内，121℃灭菌20min备用。
本实施例所述的漆酶酶活测定采用ABTS法：反应体系为1mL，含pH 4.0酒石酸缓冲液0.5mL，蒸馏水0.39mL、发酵上清液10μL和100μL的100mmoL/L的ABTS溶液(ABTS，2，2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))，30℃水浴1min，反应30s，于420nm处测定光吸收值，每组3个重复。1个酶活力单位定义为在当前反应条件下每分钟氧化1μmoL ABTS所需的酶量。
实施例2：血红密孔菌漆酶生物酶解烟梗丝中木质素漆酶浓度的优化
烟梗丝：将烟梗切成约为1-2cm×0.3cm×0.08cm大小的梗丝。
血红密孔菌漆酶：由实施例1制备获得的血红密孔菌漆酶粗酶液或血红密孔菌漆酶干粉。
血红密孔菌漆酶生物酶解烟梗丝中木质素的酶解条件优化：将烟梗丝60℃烘干至恒重，称取5g放入250mL三角瓶中，再用蒸馏水将上述血红密孔菌漆酶分别配制成5U/100g烟梗丝，10U/100g烟梗丝，30U/100g烟梗丝，50U/100g烟梗丝和70U/100g烟梗丝，每个样品设置三个重复，混合均匀后至30℃培养箱中黑暗静置48h。之后洗涤过滤烟丝，将杂质和酶液洗涤干净，于80℃烘箱中烘干至恒重。分别称取0.5g样品检测其木质素、纤维素、半纤维素、总糖和果胶的含量，并分别计算各组分的酶解率。结果见表1和图1。
表1不同血红密孔菌漆酶浓度下烟梗丝中各成分酶解2d后的酶解率
血红密孔菌漆酶浓度 5U/100g 10U/100g 30U/100g 50U/100g 70U/100g
木质素酶解率(％) 10.29 13.79 21.16 28.16 31.73
总糖酶解率(％) 8.81 11.59 15.83 18.57 20.49
纤维素酶解率(％) 9.43 11.65 15 17.57 19.04
果胶酶解率(％) 8.51 10.45 12.41 13.6 15.03
半纤维素酶解率(％) 5.48 5.63 7 8.53 9.22
烟梗丝中各成分的酶解率的测定方法如下：
本实施例所述的木质素酶解率测定：称取烟梗烟丝材料0.5g于100mL三角瓶中，加入中性洗涤剂50mL，100℃保温1h，取出后用3号砂芯漏斗过滤洗涤，残渣用水和丙酮洗。再将晾干后的残渣放入100mL三角瓶中，加入2mol/L盐酸溶液，100℃保温1h，用砂芯漏斗过滤，滤液即为半纤维素的提取液。将上述残渣用水洗至pH为6.5-7，60℃干燥后，放入100mL烧杯中，加入5mL 72％硫酸溶液20℃处理3h，再加45mL水，室温过夜。次日用砂芯漏斗过滤，滤液即为纤维素的提取液。将上述残渣继续用水洗至pH6.5左右，于80℃烘干称重(W)，之后放入马弗炉550℃灰化2h得灰分(W1)，由公式木质素＝W-漏斗重-W1计算出1g样品中木质素的含量，再换算成木质素的酶解率。
本实施例所述的纤维素酶解率测定(硫酸蒽酮法)：先制作葡萄糖标准曲线为y＝124.06x，然后将纤维素提取液适当稀释，再取1mL加4mL蒽酮试剂，100℃保温10min，于620nm波长下测OD值，由葡萄糖标准曲线求出葡萄糖含量，再换算成1g样品中纤维素的含量，进一步计算获得纤维素的酶解率。结果见表1。
本实施例所述的半纤维素酶解率测定(地衣酚法)：先制作木糖标准曲线为y＝114.52x+1.5489，然后将半纤维素提取液适当稀释后，取1mL加4mL地衣酚试剂，100℃保温20min，于660nm波长下测OD值，由木糖标准曲线求出木糖含量，再换算成1g样品中半纤维素的含量，进一步计算获得半纤维素的酶解率。
本实施例所述的总糖酶解率测定：称取0.5g烟丝样品于100mL三角瓶中，将样品剪碎至2mm以下，加沸水25mL，超声10min，冷却后过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤，得总糖提取液。吸取1mL已稀释的提取液于试管中，加入4mL蒽酮试剂，于620nm波长下测定吸光值。再根据葡萄糖标准曲线求出葡萄糖含量，再换算成1g样品中总糖的含量，计算出总糖的酶解率。
本实施例所述的果胶酶解率的测定：先制作半乳糖醛酸标准曲线为y＝178.14x。称取0.5g烟丝样品于100mL三角瓶中，剪碎后加入热的70％乙醇溶液，超声10min，之后过滤洗涤至滤液不呈糖的反应。将样品烘干后放入250mL三角瓶中，加入150mL沸的0.05mol/L的盐酸溶液，100℃保温1h，之后用0.5mol/L氢氧化钠溶液中和，得到果胶提取液。取稀释后的提取液1mL，加6mL浓硫酸，摇匀后85℃保温15min，取出冷却后加0.15％咔唑无水乙醇溶液2mL，室温避光放置2h，于530nm波长下测定OD值。根据标准曲线求出半乳糖醛酸的含量，再换算成1g样品中果胶的含量，计算出果胶的酶解率。
本实施例所述的地衣酚和蒽酮等试剂的配制方法为：0.1g FeCl3溶于100mL37％的浓盐酸中，再加入0.2g地衣酚获得地衣酚试剂；0.2g蒽酮溶于100mL浓硫酸中获得硫酸蒽酮试剂，用时现配；称取0.15g咔唑溶于100mL无水乙醇中获得0.15％咔唑无水乙醇。
本实施例所述的中性洗涤剂的配制方法为：准确称取18.6g乙二胺四乙酸二钠和6.8g硼酸钠放入烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30g十二烷基硫酸钠和10mL乙二醇乙醚，再称取4.56g无水磷酸氢二钠置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加热溶解后，倒入前一个烧杯中，用蒸馏水定容至1L，其中pH值约为6.9-7.1。
本实施例所述的DNS试剂的配制方法为：称取6.5g 3，5-二硝基水杨酸溶于少量蒸馏水中，加入2mol/L的氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后加水至总体积为1000mL，保存于棕色瓶中放置7天后使用。
从本实施例的数据可以看出，烟梗中的各成分酶解2d后，使用血红密孔菌漆酶浓度的越大，各成分的酶解率越高。
实施例3：血红密孔菌漆酶生物酶解烟梗中木质素处理时间的优化
将烟梗丝60℃烘干至恒重，称取5g放入250mL三角瓶中，再用蒸馏水将由实施例1制备获得的血红密孔菌漆酶粗酶液或漆酶干粉配成30U/100g烟梗丝，设置三个重复。混合均匀后至30℃培养箱中黑暗静置培养，在酶解12h、24h、36h、48h和60h后分别取样进行烟梗木质素、纤维素、半纤维素、总糖和果胶等组分含量测定，测定方法同实施例2。烟梗中的木质素、纤维素、半纤维素、总糖和果胶的酶解情况见图2-6。
从图2-6可以看出，在血红密孔菌漆酶30U/100g烟梗丝条件下，时间越长酶解率越高，但2d(48h)后烟梗中各成分酶解率已经很高。考虑时间成本因素，继续延长酶解时间没有必要。
实施例4：血红密孔菌漆酶生物酶解处理后的烟梗的卷烟产品的感官评价
将实施例1制备获得的血红密孔菌漆酶粗酶液分别按照10U/100g烟梗丝(1#)、30U/100g烟梗丝(2#)、50U/100g烟梗丝(3#)的量均匀添加到烟梗丝中，并补水使梗丝含水率至35％，分别在常温下酶解2d后烘干。然后将烘干后的烟梗丝分别按6wt％的添加量加入到某品牌卷烟产品烟丝中制成卷烟样品，根据国家标准GB 5606.4-2005对所得卷烟进行感官质量评价，结果见表2。表中的对照样为未添加酶解后的烟梗丝的某品牌卷烟产品。
由表2的数据可知，加入酶解后烟梗丝的卷烟产品在烟气柔和舒适、木质素和刺激性改善以及卷烟整体抽吸品质方面相比对照样均有提高。当加入1#酶解后的烟梗丝时卷烟产品的指标中的喉部刺激、杂气、烟气浓度和劲头均有所改善。加入2#酶解后的烟梗丝时卷烟产品的烟气品质进一步提升。但当加入3#酶解后的烟梗丝时，卷烟产品的烟气品质特征的部分指标基本保持不变，但刺激性和杂气凸显，烟气浓度和劲头也呈现出降低的趋势。因此，血红密孔菌漆酶添加比例为30U/100g且酶解时间2d的烟梗丝，加入到卷烟样品中改善效果最优。由此可知，用于卷烟中的烟梗丝的酶解率不是越高越好。血红密孔菌漆酶在30U/100g烟梗丝的比例酶解2d后烟梗丝中各组分的酶解率见图7。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种酶解烟梗丝的方法，其特征在于，包括如下步骤：将血红密孔菌漆酶按5-70U/100g烟梗丝的比例添加到烟梗丝上，然后按100g烟梗丝补水30-40ml到上述烟梗丝上，在一定温度下酶解一段时间后烘干，即得到酶解后的烟梗丝。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红密孔菌漆酶为血红密孔菌漆酶粗酶液或血红密孔菌漆酶干粉。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解时的温度为25-30℃；pH值为4.0-5.0；所述酶解的时间为2d。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酶解时的温度为28℃；pH值为4.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红密孔菌漆酶的用量为30U/100g烟梗丝。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述血红密孔菌漆酶粗酶液或血红密孔菌漆酶干粉的制备方法为：将血红密孔菌接种于发酵培养基中，在30℃、pH为6.5、摇床为200rpm/min条件下发酵10d后，得到血红密孔菌漆酶粗酶液，经浓缩冷冻干燥后即得到所述血红密孔菌漆酶干粉。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述血红密孔菌发酵培养基组成为：十二水合磷酸二氢钠0.39g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.0315g，二水合氯化钙0.1g，一水合硫酸锰0.035g，三水合乙酸钠0.408g，五水合硫酸铜0.168g，七水合硫酸锌0.028g，六水合氯化钴0.06g，酒石酸铵3g，琥珀酸钠1.18g，吐温80 1mL，维生素B1 10μg，维生素B2 5μg，维生素B6 5μg，玉米粉40g，加水定容至1L；
所述血红密孔菌发酵培养基发酵条件为：接种量为用无菌打孔器将培养好的菌株制成直径1cm左右的菌饼，接种10个菌饼于灭菌的100mL发酵培养基中，摇床200rpm/min，30℃，黑暗培养，培养3d后加入诱导剂2,5-二甲基苯胺进行诱导漆酶产生，诱导剂含量为0.01wt％；培养10d后，在4℃下10000rpm/min离心15min，上清液即为所述血红密孔菌漆酶粗酶液，经浓缩冷冻干燥后即得到所述血红密孔菌漆酶干粉。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法得到的酶解后的烟梗丝用于烟草中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述酶解后的烟梗丝按4-10wt％的比例加入到普通烟丝中。
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