CN102559619A - 一种木质素降解酶及其制备方法与它的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种木质素降解酶及其制备方法与它的用途。该木质素降解酶制备方法包括烟草梗丝水煮、液体发酵、离心分离、超滤浓缩、透析处理与柱层析纯化等步骤。该烟草梗丝木质素降解酶生产方法与现有的其他方法相比，产生了酶活性更高、更有针对性的降解烟草梗丝木质素并可直接应用于梗丝前处理的有益效果。

Description

一种木质素降解酶及其制备方法与它的用途

【技术领域】

本发明涉及烟草加工技术领域。更具体地，本发明涉及一种木质素降解酶及其制备方法，还涉及所述木质素降解酶的用途。

【背景技术】

烟草梗丝的主要成分是木质素、纤维素和果胶等，而木质素是造成梗丝杂气、木质气重及燃烧时产生灼喉刺激感的主要原因。

木质素是一种芳香族高分子化合物，通过形成交织网来增强细胞壁及黏合纤维，具有抗压作用。

木质素分为紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)，愈创木基木质素(guajacyl lignin，G-木质素)和对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyllignin，H-木质素)。

烟草细胞壁物质中的木质素是由苯丙烷衍生物单体(如香豆醇、松柏醇和芥子醇等)构成的一种结构复杂的立体网状物质，是具有生物多态性的生物大分子，其填充在纤维素和半纤维素的空隙之中，紧密结合形成了致密的细胞壁结构。木质素普遍存在于烟草梗丝中，对卷烟抽吸品质的影响很大，在吸食过程中木质素受高温热解会产生儿茶酚、烷基儿茶酚等引起涩口等令人不愉快的感官效果，同时，研究表明这些物质可能存在一定的致癌活性，因此，如何安全有效的降低梗丝木质素成为须解决的一个重要问题。

目前，CN03144088公开了烟草梗丝加工方法，其中包括筛分、水洗、切梗、闪蒸、膨化干燥等步骤。CN01108471公开了烟草梗丝微波膨胀工艺，CN200810197102公开了一种烟草梗丝的制备方法，其中包括烟梗浸泡、蒸气加温、储梗、切梗、烘干膨化等步骤，这些方法都是物理加工方法。

随着生物技术的进步，烟草工作者已开始研究木质素降解酶的应用。目前该方面报道不多，工业化生产木质素降解酶制剂及应用于烟草梗丝处理鲜见报道。因此，本发明人利用微生物发酵工艺生产木质素降解酶(木素过氧化物酶Lip、锰过氧化物酶Mnp和漆酶Lac)，有针对性地降低烟草梗丝木质素含量，改善抽吸时木质气重及灼喉刺激感。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种木质素降解酶。

本发明的另一个目的是提供所述木质素降解酶的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述木质素降解酶的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种木质素降解酶的制备方法。

该木质素降解酶制备方法的步骤如下：

A、在常压与温度90～100℃的条件下，烟草梗丝按照其与水的重量比1∶100～500用水煮2.0～3.0h，得到一种固液混合物；

B、然后，按照烟草梗丝量2～10g/L，往步骤A)得到的固液混合物中添加10～20g/L葡萄糖、0.05～0.30g/L酒石酸铵、0.05～0.30g/L尿素、5mmol/L藜芦醇、1mL/L微量元素混合液，混合均匀后得到的混合液作为培养基；然后分装，在温度121℃与0.1Mpa的条件下灭菌18～25min，冷却后按照接种量以所述培养基体积计6～15％接种白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种，然后在温度28～32℃与转速140～160r/min的条件下培养8～12天；

C)将步骤B)培养得到的发酵混合物通过离心分离得到上清液，弃去沉淀；

D)将步骤C)得到的上清液采用超滤浓缩、用分子量8000的透析袋透析，再采用DEAE-Sephadex A-50柱层析或DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理进行纯化，检测洗脱液蛋白含量及含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活力，得到含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的烟草梗丝是烟草上、中和下部的长梗。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C)中，所述的发酵混合物在温度0～4℃与4000～6000r/min的条件下进行离心15～25min。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的微量元素混合液含有1-2g/L硼酸、0.02-0.05g/L钼酸钠二水合物、1.2-2.0g/L氯化锰四水合物、0.1-0.4g/L硫酸锌七水合物与0.05-0.20g/L硫酸铜五水合物。

根据本发明的一个方面，在制备含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶时，该制备方法包括超滤浓缩、透析与柱层析步骤；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴。

所述的透析是使用分子量8000的透析袋，使用pH7.2、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行透析24h，每间隔8h更换一次所述的磷酸盐缓冲液。

所述的柱层析是使用DEAE-Sephadex A-50柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度为2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及含木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的活力，收集具有酶活的组分。

根据本发明的另一个方面，在制备漆酶时，该制备方法包括超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析与DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴；

在超滤浓缩步骤得到的浓缩液使用以重量计65％硫酸铵溶液进行沉淀，让这种沉淀与母液在温度4℃下放置过夜，然后以转速10000r/min进行离心20min，得到的沉淀用最少量的10mmol/L pH5.0醋酸盐缓冲液溶解；

得到的溶液再使用分子量8000的透析袋，使用蒸馏水进行透析48h，每间隔12h更换一次蒸馏水；

然后，得到的透析液进行离子交换分离，使用DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及漆酶活力，收集具有酶活的组分。

本发明还涉及采用所述方法制备得到的木质素降解酶，其特征在于它含有含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，其重量比是1∶0.5-3.0∶0.8-3.0。

本发明还涉及所述的木质素降解酶在降低烟草梗丝木质素中的用途。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种木质素降解酶的制备方法。

该木质素降解酶制备方法的步骤如下：

A、在常压与温度90～100℃的条件下，烟草梗丝按照其与水的重量比1∶100～500用水煮2.0～3.0h，得到一种固液混合物；

烟草是茄科烟草属植物，烟梗即是烟叶之粗硬叶脉，约占叶重的25-30％。烟梗是烟草工业的副产物，同时也是宝贵的自然资源，目前多作弃置处理。我国是烟草大国，每年有数十万吨烟梗资源被废弃，既造成环境污染，同时也是对自然资源的浪费。研究表明，烟梗中含有的成分种类与烟叶成分基本一致。

所述的烟草梗丝是使用水漂洗烟梗，再经切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的。

水漂洗时使用的水量并不是关键的，只是需要完全洗去在烟梗上带有的或附着的各种杂质就可以，一般而言，使用的水量是烟梗重量的5-15倍。

所述烟草梗丝的厚度是0.1-0.2mm，宽度是1.0-2.0mm。

所述的切梗、闪蒸、膨化干燥处理是技术是烟草加工技术领域的技术人员最熟知的技术。

根据本发明，所述的烟草梗丝是烟草上、中和下部的长梗。

如果所述烟草梗丝与水的重量比低于1∶100，则不利于梗丝中营养物质的溶出。如果所述烟草梗丝与水的重量比高于1∶500，则超过梗丝加入到培养基中的最大量，须浓缩，增加了处理时间且浪费水资源。因此，所述烟草梗丝与水的重量比为1∶100～500是合适的。

优选地，所述烟草梗丝与水的重量比是1∶180～420。

如果所述烟草梗丝用水煮的时间小于2.0h，则梗丝中营养物不易溶出；如果所述烟草梗丝用水煮的时间大于3.0h，则延长了前处理时间，增加成本。因此，所述烟草梗丝用水煮的时间是2.0～3.0h是合适的。

优选地，所述烟草梗丝用水煮的时间是2.2-2.6h。

B、然后，按照烟草梗丝量2～10g/L，往步骤A)得到的固液混合物中添加10～20g/L葡萄糖、0.05～0.30g/L酒石酸铵、0.05～0.30g/L尿素、5mmol/L藜芦醇、1mL/L微量元素混合液，混合均匀后得到的混合液作为培养基；然后分装，在温度121℃与0.1Mpa的条件下灭菌18～25min，冷却后按照接种量以所述培养基体积计6～15％接种白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种，然后在温度28～32℃与转速140～160r/min的条件下发酵培养8～12天。

在本发明中，所述的微量元素混合液含有1-2g/L硼酸、0.02-0.05g/L钼酸钠二水合物、1.2-2.0g/L氯化锰四水合物、0.1-0.4g/L硫酸锌七水合物与0.05-0.20g/L硫酸铜五水合物。

在本发明中使用的灭菌设备是本技术领域里通常使用的设备。

白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种是中国微生物菌种总目录工业微生物菌种中收录的菌种。

按照微生物培养常规方法使用该目录推荐的培养条件进行培养，即在温度28～32℃与转速140～160r/min的条件下发酵培养8～12天。

C)将步骤B)培养得到的发酵混合物通过离心分离得到上清液，弃去沉淀；

在本发明中，离心分离使用的设备是目前市场上销售的产品，例如苏州优耐特机械制造有限公司生产离心机。

所述的发酵混合物离心分离是在温度0～4℃与4000～6000r/min的条件下进行离心15～25min。

D)将步骤C)得到的上清液采用超滤浓缩、用分子量8000的透析袋透析，再采用DEAE-Sephadex A-50柱层析进行纯化，检测洗脱液蛋白含量及含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活力，得到含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。

所述的超滤浓缩是一种使用超滤膜进行生物制品与医药制品分离、浓缩和纯化的方法。超滤膜通常是由醋酯纤维或与其性能类似的高分子材料制得的。本发明使用的超滤膜都是目前市场上销售的产品。

透析是一种分子选择性地穿过膜的扩散过程。透析可以用于分离分子量大小不同的溶质，低于膜所截留阈值分子量的物质可扩散穿过膜，而高于膜截留阈值分子量的物质则被保留在半透膜的另一侧。本发明使用的分子量8000的透析袋例如是北京红娃数字机电技术有限公司、上海创赛科学仪器有限公司生产的产品。

DEAE-Sephadex A-50柱(二乙氨基-乙基-葡萄糖凝胶a-50)是弱碱性阳离子交换剂，使用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可以用于吸附酸性蛋白。DEAE-Sephadex A-50是目前市场上销售的产品，例如上海基星生物科技有限公司生产的产品。

在本发明中，按照常规方法使用DEAE-Sephadex A-50柱。例如其操作步骤如下：

(1)DEAE-Sephadex A-50预处理

称5g DEAE-Sephadex A-50，悬于500ml蒸馏水内，在1h后倾去上层细粒。按照每克DEAE-Sephadex A-50加0.5mol/l 15ml氢氧化钠的比例，将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.5mol/lNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再使用0.5mol/l HCl按照与上述同样操作进行处理，最后使用0.5mol/l NaOH再处理一次。处理完后，将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.1mol/l pH7.4PB中一夜。

(2)装柱

①将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

②将0.1mol/l，pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的DEAE-Sephadex A-50。DEAE-Sephadex A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状DEAE-Sephadex A-50凝胶至所需高度。

③关闭出水口，待DEAE-Sephadex A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

(3)平衡

启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。

在本发明中，所述层析洗脱液中蛋白含量的检测方法是考马斯亮蓝G-250法。

在本发明中，所述层析洗脱液中的含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活力检测方法分别是藜芦醇法、二价锰分光光度法和ABTS法。酶活力是用酶纯化倍数与酶活回收率表示的。

根据本发明，酶纯化倍数＝比活力_n/比活力₀(n＝0，1，2，3，4，5，分别表示各纯化步骤：n＝0表示发酵混合液离心后得到的粗酶液；n＝1表示超滤后的酶液；n＝3表示硫酸铵沉淀后的酶液；n＝4表示透析后的酶液；n＝5表示DEAE-Sephadex A-50柱层析或DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理后的酶液)。

根据本发明，酶活回收率＝总活力_n/总活力₀×100％(n＝0，1，2，3，4，5，分别表示各纯化步骤：n＝0表示发酵混合液离心后得到的粗酶液；n＝1表示超滤后的酶液；n＝3表示硫酸铵沉淀后的酶液；n＝4表示透析后的酶液；n＝5表示DEAE-Sephadex A-50柱层析或DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理后的酶液)。

根据检测木素过氧化物酶洗脱液蛋白含量25.13mg、纯化倍数7.79、酶活回收率23.54，锰过氧化物酶洗脱液蛋白含量21.07mg、纯化倍数9.52、酶活回收率23.99，漆酶洗脱液蛋白含22.58mg、纯化倍数18.67、酶活回收率32.21，收集含有这些酶的洗脱液作为本发明制备的酶溶液。

在制备含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶时，本发明的制备方法包括超滤浓缩、透析与柱层析步骤；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴。

所述的透析是使用分子量8000的透析袋，使用pH7.2、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行透析24h，每间隔8h更换一次所述的磷酸盐缓冲液。

所述的柱层析是使用DEAE-Sephadex A-50柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度为2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及含木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的活力，收集具有酶活的组分。

在制备漆酶时，本发明的制备方法包括超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析与DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴；

在超滤浓缩步骤得到的浓缩液使用以重量计65％硫酸铵溶液进行沉淀，让这种沉淀与母液在温度4℃下放置过夜，然后以转速10000r/min进行离心20min，得到的沉淀用最少量的10mmol/L pH5.0醋酸盐缓冲液溶解；

得到的溶液再使用分子量8000的透析袋，使用蒸馏水进行透析48h，每间隔12h更换一次蒸馏水；

然后，得到的透析液进行离子交换分离，使用DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及漆酶活力，收集具有酶活的组分。

本发明还涉及采用本发明方法制备得到的木质素降解酶。所述的木质素降解酶含有含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，其重量比是1∶0.5-3.0∶0.8-3.0。

本发明还涉及所述的木质素降解酶在降低烟草梗丝木质素中的用途。

[有益效果]

本发明使用白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌株在直接添加烟草梗丝为底物的培养基中发酵生产有针对性的降解烟草梗丝木质素的Lip、Mnp和Lac，可改善了烟草梗丝燃烧时杂气、木质气重及燃烧时产生灼喉刺激感的不良影响。

本发明的有益效果是：

(1)直接添加烟草梗丝作为培养基的一部分，在提供微生物发酵营养物质的同时又起诱导烟草梗丝木质素降解酶产生的作用；

(2)白腐菌在在直接添加烟草梗丝为部分培养基成分上生长，并生产木质素降解酶Lip、Mnp和Lac的工艺方法；

(3)得到可直接用于烟草梗丝处理的木质素降解酶。

该烟草梗丝木质素降解酶生产方法与现有的其他方法相比，产生了酶活性更高、更有针对性的降解烟草梗丝木质素并可直接应用于梗丝前处理的有益效果。

【具体实施方式】

通过下述实施例将会更进一步深刻地理解本发明。

实施例1：使用烟草梗丝制备木质素降解酶

发酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株，按照说明书中描述的方法培养制备其菌剂。使用水漂洗、切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的烟草梗丝在温度90℃水煮预处理2h，得到的固液混合物作为一部分发酵培养基。使其烟草梗丝量达到2g/L，同时使葡萄糖达到10g/L、酒石酸铵0.05g/L、尿素0.05g/L、藜芦醇5mmol/L、微量元素混合液1mL/L，pH自然，摇瓶装样量为250mL三角瓶容积的40％，白腐菌CICC 40299菌剂接种量是以培养基体积计10％，培养温度30℃，转速150r/min，培养时间10d。将含有菌丝体及梗丝的液体培养混合物进行离心分离后，再进行超滤浓缩、透析、层析处理，然后采用本申请说明书中描述的方法检测洗脱液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力，收集具有酶活的组分。

其测定结果是：总蛋白含量分别为：0.21mg(Lip)、0.15mg(Mnp)、0.49mg(Lac)，酶纯化倍数分别为：3.98(Lip)、2.77(Mnp)、4.63(Lac)，酶活回收率分别为：6.12(Lip)、5.77(Mnp)、14.11(Lac)。

实施例2：使用烟草梗丝制备木质素降解酶

发酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株，按照说明书中描述的方法培养制备其菌剂。使用水漂洗、切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的烟草梗丝在温度90℃水煮预处理3h，得到的固液混合物作为一部分发酵培养基。使其烟草梗丝量达到10g/L，同时使葡萄糖达到20g/L、酒石酸铵0.30g/L、尿素0.30g/L、藜芦醇5mmol/L、微量元素混合液1mL/L，pH自然，摇瓶装样量为250mL三角瓶容积的40％，白腐菌CICC 40299菌剂接种量是以培养基体积计10％，培养温度30℃，转速150r/min，培养时间10d。将含有菌丝体及梗丝的液体培养混合物进行离心分离后，再进行超滤浓缩、透析、层析处理，然后采用本申请说明书中描述的方法检测洗脱液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力，收集具有酶活的组分。其测定结果是：总蛋白含量分别为：37.56mg(Lip)、35.14mg(Mnp)、31.51mg(Lac)，酶纯化倍数分别为：9.74(Lip)、12.85(Mnp)、27.12(Lac)，酶活回收率分别为：31.22(Lip)、34.58(Mnp)、41.97(Lac)。

实施例3：使用烟草梗丝制备木质素降解酶

发酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株，按照说明书中描述的方法培养制备其菌剂。使用水漂洗、切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的烟草梗丝在温度90℃水煮预处理2.5h，得到的固液混合物作为一部分发酵培养基。使其烟草梗丝量达到5g/L，同时使葡萄糖达到20g/L、酒石酸铵0.25g/L、尿素0.15g/L、藜芦醇5mmol/L、微量元素混合液1mL/L，pH自然，摇瓶装样量为250mL三角瓶容积的40％，白腐菌CICC 40299菌剂接种量是以培养基体积计10％，培养温度30℃，转速150r/min，培养时间10d。将含有菌丝体及梗丝的液体培养混合物进行离心分离后，再进行超滤浓缩、透析、层析处理，然后采用本申请说明书中描述的方法检测洗脱液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力，收集具有酶活的组分。其测定结果是：总蛋白含量分别为：29.37mg(Lip)、32.72mg(Mnp)、26.89mg(Lac)，酶纯化倍数分别为：10.22(Lip)、9.89(Mnp)、18.68(Lac)，酶活回收率分别为：32.09(Lip)、28.34(Mnp)、36.01(Lac)。

实施例4：使用烟草梗丝制备木质素降解酶

发酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株，按照说明书中描述的方法培养制备其菌剂。使用水漂洗、切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的烟草梗丝在温度90℃水煮预处理2.5h，得到的固液混合物作为一部分发酵培养基。使其烟草梗丝量达到8g/L，同时使葡萄糖达到16g/L、酒石酸铵0.20g/L、尿素0.20g/L、藜芦醇5mmol/L、微量元素混合液1mL/L，pH自然，摇瓶装样量为250mL三角瓶容积的40％，白腐菌CICC 40299菌剂接种量是以培养基体积计10％，培养温度30℃，转速150r/min，培养时间10d。将含有菌丝体及梗丝的液体培养混合物进行离心分离后，再进行超滤浓缩、透析、层析处理，然后采用本申请说明书中描述的方法检测洗脱液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力，收集具有酶活的组分。其测定结果是：总蛋白含量分别为：20.34mg(Lip)、22.31mg(Mnp)、17.89mg(Lac)，酶纯化倍数分别为：9.88(Lip)、8.73(Mnp)、16.90(Lac)，酶活回收率分别为：35.21(Lip)、23.12(Mnp)、40.07(Lac)。

实施例5：使用烟草梗丝制备木质素降解酶

发酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株，按照说明书中描述的方法培养制备其菌剂。使用水漂洗、切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的烟草梗丝在温度90℃水煮预处理3.0h，得到的固液混合物作为一部分发酵培养基。使其烟草梗丝量达到10g/L，同时使葡萄糖达到12g/L、酒石酸铵0.15g/L、尿素0.30g/L、藜芦醇5mmol/L、微量元素混合液1mL/L，pH自然，摇瓶装样量为250mL三角瓶容积的40％，白腐菌CICC 40299菌剂接种量是以培养基体积计10％，培养温度30℃，转速150r/min，培养时间10d。将含有菌丝体及梗丝的液体培养混合物进行离心分离后，再进行超滤浓缩、透析、层析处理，然后采用本申请说明书中描述的方法检测洗脱液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力，收集具有酶活的组分。其测定结果是：总蛋白含量分别为：23.91mg(Lip)、19.72mg(Mnp)、20.86mg(Lac)，酶纯化倍数分别为：11.74(Lip)、13.32(Mnp)、15.65(Lac)，酶活回收率分别为：35.04(Lip)、43.30(Mnp)、14.99(Lac)。

Claims (8)

1.一种木质素降解酶的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：

A、在常压与温度90～100℃的条件下，烟草梗丝按照其与水的重量比1∶100～500用水煮2.0～3.0h，得到一种固液混合物；

B、然后，按照烟草梗丝量2～10g/L，往步骤A)得到的固液混合物中添加10～20g/L葡萄糖、0.05～0.30g/L酒石酸铵、0.05～0.30g/L尿素、5mmol/L藜芦醇、1mL/L微量元素混合液，混合均匀后得到的混合液作为培养基；然后分装，在温度121℃与0.1Mpa的条件下灭菌18～25min，冷却后按照接种量以所述培养基体积计6～15％接种白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种，然后在温度28～32℃与转速140～160r/min的条件下培养8～12天；

C)将步骤B)培养得到的发酵混合物通过离心分离得到上清液，弃去沉淀；

D)将步骤C)得到的上清液采用超滤浓缩、用分子量8000的透析袋透析，再采用DEAE-Sephadex A-50柱层析或DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理进行纯化，检测洗脱液蛋白含量及含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活力，得到含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的烟草梗丝是烟草上、中和下部的长梗。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C)中，所述的发酵混合物在温度0～4℃与4000～6000r/min的条件下进行离心15～25min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的微量元素混合液含有1-2g/L硼酸、0.02-0.05g/L钼酸钠二水合物、1.2-2.0g/L氯化锰四水合物、0.1-0.4g/L硫酸锌七水合物与0.05-0.20g/L硫酸铜五水合物。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在制备含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶时，该制备方法包括超滤浓缩、透析与柱层析步骤；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴。

所述的透析是使用分子量8000的透析袋，使用pH7.2、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行透析24h，每间隔8h更换一次所述的磷酸盐缓冲液。

所述的柱层析是使用DEAE-Sephadex A-50柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度为2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及含木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的活力，收集具有酶活的组分。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在制备漆酶时，该制备方法包括超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析与DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴；

在超滤浓缩步骤得到的浓缩液使用以重量计65％硫酸铵溶液进行沉淀，让这种沉淀与母液在温度4℃下放置过夜，然后以转速10000r/min进行离心20min，得到的沉淀用最少量的10mmol/L pH5.0醋酸盐缓冲液溶解；

得到的溶液再使用分子量8000的透析袋，使用蒸馏水进行透析48h，每间隔12h更换一次蒸馏水；

然后，得到的透析液进行离子交换分离，使用DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及漆酶活力，收集具有酶活的组分。

7.根据权利要求1-6中任一项权利要求所述方法制备得到的木质素降解酶，其特征在于它含有含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，其重量比是1∶0.5-3.0∶0.8-3.0。

8.根据权利要求7所述的木质素降解酶在降低烟草梗丝木质素中的用途。