CN103859579A

CN103859579A - 一种降解烟梗中木质素的方法

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Publication number: CN103859579A
Application number: CN201410129330.0A
Authority: CN
Inventors: 李元实; 马林; 朱良华; 黄飞; 刘金霞; 李河霖; 张锐; 帖金鑫
Original assignee: Zhengzhou University of Light Industry; Jilin Tobacco Industrial Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou University of Light Industry; Jilin Tobacco Industrial Co Ltd
Priority date: 2014-04-01
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2014-06-18

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种降解烟梗中木质素的方法。本发明提供的降解烟梗中木质素的方法包括：取烟梗、漆酶与水混合，于40℃～48℃、pH4.5～5.5条件下酶解36h～60h。本发明提供的降解烟梗中木质素的方法操作简单，对烟梗原料的破坏性小，且显著提高了烟梗中木质素的降解率，提升了烟梗丝的品质，更有利于烟梗资源的充分利用；添加了本发明提供的制备方法制得的烟梗酶解产品的卷烟杂气、刺激性明显降低，木质气大幅度减弱，提高了卷烟的香气和余味。

Description

一种降解烟梗中木质素的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种降解烟梗中木质素的方法。

背景技术

烟草是茄科一年生草本植物，主要用于制造烟丝、卷烟和雪茄烟。烟叶是主要的加工部位，烟叶在打叶复烤后被分离成片烟和烟梗，烟梗即是烟叶之粗硬叶脉，约占叶重的25%-30%，是烟草工业的主要副产物之一。现有的利用烟梗的方法，主要包括制造卷烟、生产烟草薄片、提取烟碱和茄尼醇等。在制造卷烟过程中，一些烟梗经切丝、膨胀后添加到卷烟产品中，可以提高烟丝的填充值，降低焦油和烟气一氧化碳的含量。但是，目前对烟梗的利用率较低，在我国每年有数十万吨烟梗资源被废弃，这既浪费了资源，也污染了环境。

研究发现，烟梗的主要成分是木质素、纤维素和半纤维素，而其中的木质素是造成烟梗杂气、木质素气重和燃烧时灼喉感的主要原因，导致烟梗在卷烟产品中添加过多时会出现卷烟产品香气量不足、吃味平淡、刺激性强等感官质量缺陷。研究还发现，木质素结构中富含苯环，是烟焦油中稠环芳烃类、芳香胺等有害物质的主要来源。这些都限制了烟梗资源的利用，为了更加有效地利用烟梗资源，有必要对烟梗中的木质素进行降解。

木质素是以苯丙烯类似物为单元构成的一类生物多聚体，组成单元的结构及其连接键复杂而稳定，构成结构复杂的立体网状物质，且木质素填充在纤维素和半纤维素的空隙之间，导致木质素结合紧密不易除去。目前，针对木质素的降解，主要有三种方法：化学法、物理法和生物法。常用的方法为化学法，例如造纸工业中的热碱处理，该方法不仅需要消耗大量的化学品和能源，而且产生的废液会造成严重的环境污染。而物理法，由于能量消耗较大、噪音大等缺点，也不适宜工业化应用。随着生物技术的进步，生物法降解木质素已受到学者的广泛关注。

然而，针对烟梗中木质素的降解方法，目前的研究报道较少，利用生物技术处理烟梗中木质素的研究更少，所以，急需一种利用生物技术降解烟梗中木质素的方法，以合理利用烟草资源。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种降解烟梗中木质素的方法，该方法利用漆酶降解烟梗中的木质素，操作方法简单，显著提高了烟梗中木质素的降解率，提升了烟梗丝的品质，更有利于烟梗资源的充分利用。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种降解烟梗中木质素的方法，包括：

取烟梗、漆酶与水混合，于40℃～48℃、pH4.5～5.5条件下酶解36h～60h。

木质素填充在纤维素和半纤维素的空隙之间，结构致密不易降解，常规的降解木质素的方法对原料的破坏性大，降解后的产品需要经过进一步的深加工才能被利用。针对烟梗，因为降解烟梗中的木质素的目的是为了将所得降解之后的加工产品直接加以利用，例如制备卷烟、生产烟草薄片和茄尼醇，而这些产品的质量控制非常严格，所以常规的降解木质素的方法并不适用于烟梗中木质素的降解。例如物理法对烟梗的破坏性较大，所得烟梗加工产品不利于回收利用；化学法需要用到强碱，后处理过程复杂，且所得产品会带来严重的刺激性，也不适合烟梗中木质素的降解。本发明提供的降解烟梗中木质素的方法利用了漆酶降解木质素的功能，通过大量的条件筛选获得了适宜的酶解条件，操作方法简单，对原料的破坏性小，处理后的产品能够被利用；且显著提高了烟梗中木质素的降解率，提升了烟梗丝的品质。评吸实验结果证实，添加了本发明提供的制备方法制得的烟梗酶解产品的卷烟的杂气、刺激性明显降低，木质气大幅度减弱，提高了卷烟的香气和余味。

优选地，本发明提供的方法中，酶解的温度为45℃。

优选地，本发明提供的方法中，酶解的pH值为5.0。

优选地，本发明提供的方法中，酶解的时间为48h。

优选地，本发明提供的方法中，酶解的缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。

优选地，本发明提供的方法中，以g/U计，所用烟梗的质量与所用漆酶的酶活力之比为1:800～1200。

优选地，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法包括：

取杂色云芝菌接种于发酵培养基后，于28℃～30℃、pH4.0～6.0条件下发酵6d～8d，得发酵液，纯化，即得。

本发明提供的方法中所用的漆酶可以是商品化的漆酶，也可以是本发明提供的漆酶的制备方法制备获得的漆酶。

优选地，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中的发酵培养基包括以下组分：

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中的发酵培养基包括以下组分：

优选地，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中发酵的温度为28℃。

优选地，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中发酵的pH值为5.0。

优选地，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中发酵的时间为7d。

优选地，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中发酵的转速为140r/min～160r/min。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中发酵的转速为150r/min。

优选地，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中的纯化具体为：

取杂色云芝菌发酵所得发酵液，离心，收集上清液；取所得上清液经超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换层析柱分离，即得。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中离子交换层析柱为DEAE-Sepharose F.F.离子交换层析柱。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，所用的漆酶的制备方法中接种杂色云芝菌之前还包括杂色云芝菌活化步骤，该活化步骤具体为：

取杂色云芝菌接种于马铃薯葡萄糖培养基平板后，于28℃～32℃条件下，培养7d～10d。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，所用的漆酶的制备方法中杂色云芝菌活化步骤所用的马铃薯葡萄糖培养基包括以下组分：

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中杂色云芝菌活化步骤所用的马铃薯葡萄糖培养基包括以下组分：

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中杂色云芝菌活化步骤的培养温度为30℃。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，所用漆酶的制备方法中杂色云芝菌活化步骤的培养时间为8天。

本发明对杂色云芝菌生产漆酶的发酵条件进行了优化，获得了利用杂色云芝菌发酵生产漆酶的适宜条件，显著提高了杂色云芝菌所产漆酶的酶活力值，发酵条件简单，更有利于杂色云芝菌生产制备漆酶以及所得漆酶的推广和使用，并且所得漆酶能够应用于降解烟梗中的木质素。利用本发明提供的制备方法制备获得的漆酶降解烟梗木质素后，显著提升了烟梗丝的品质，评吸实验结果证实，相比现有的商品化的漆酶，添加了本发明提供杂色云芝菌所产漆酶降解烟梗中木质素所得烟梗酶解产品的卷烟的杂气、刺激性进一步降低，木质气进一步减弱，显著提高卷烟的香气和余味。

本发明提供了一种降解烟梗中木质素的方法。该方法包括：取烟梗、漆酶与水混合，于40℃～48℃、pH4.5～5.5条件下酶解36h～60h。本发明提供的降解烟梗中木质素的方法操作简单，对烟梗原料的破坏性小，且显著提高了烟梗中木质素的降解率，提升了烟梗丝的品质，更有利于烟梗资源的充分利用。评吸实验结果证实，添加了本发明提供的制备方法制得的烟梗酶解产品的卷烟的杂气、刺激性明显降低，木质气大幅度减弱，提高了卷烟的香气和余味。

附图说明

图1示实施例6中纯化漆酶中不同洗脱样品对应的蛋白浓度曲线和洗脱样品对应的NaCl浓度曲线；曲线1示各个洗脱样品280nm处的紫外吸收检测结果；曲线2示各个洗脱样品所对应的洗脱液中NaCl的浓度；左边的纵坐标代表各个洗脱样品的A₂₈₀值，右边的纵坐标代表洗脱样品的所对应的洗脱液中NaCl的浓度；

图2示实施例6中纯化漆酶中不同洗脱样品对应的蛋白浓度曲线和酶活力值曲线；曲线1示各个洗脱样品280nm处的紫外吸收检测结果；曲线2示各个洗脱样品的酶活力值检测结果；左边的纵坐标代表洗脱样品的A₂₈₀数值，右边的纵坐标代表洗脱样品中酶活力值；

图3示实施例6制备获得的漆酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M示标准蛋白分子量Marker，1示实施例6纯化获得的漆酶，泳道2中出现的条带对应的分子量大小约为64.4KDa；

图4示实施例7中纯化漆酶中不同洗脱样品对应的蛋白浓度曲线和洗脱样品对应的NaCl浓度曲线；曲线1示各个洗脱样品280nm处的紫外吸收检测结果；曲线2示各个洗脱样品所对应的洗脱液中NaCl的浓度；左边的纵坐标代表各个洗脱样品的A₂₈₀值，右边的纵坐标代表洗脱样品的所对应的洗脱液中NaCl的浓度；

图5示实施例7中纯化漆酶中不同洗脱样品对应的蛋白浓度曲线和酶活力值曲线；曲线1示各个洗脱样品280nm处的紫外吸收检测结果；曲线2示各个洗脱样品的酶活力值检测结果；左边的纵坐标代表洗脱样品的A₂₈₀数值，右边的纵坐标代表洗脱样品中酶活力值；

图6示实施例7制备获得的漆酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M示标准蛋白分子量Marker，1示实施例7纯化获得的漆酶，泳道2中出现的条带对应的分子量大小约为64.4KDa；

图7示实施例8中纯化漆酶中不同洗脱样品对应的蛋白浓度曲线和洗脱样品对应的NaCl浓度曲线；曲线1示各个洗脱样品280nm处的紫外吸收检测结果；曲线2示各个洗脱样品所对应的洗脱液中NaCl的浓度；左边的纵坐标代表各个洗脱样品的A₂₈₀值，右边的纵坐标代表洗脱样品的所对应的洗脱液中NaCl的浓度；

图8示实施例8中纯化漆酶中不同洗脱样品对应的蛋白浓度曲线和酶活力值曲线；曲线1示各个洗脱样品280nm处的紫外吸收检测结果；曲线2示各个洗脱样品的酶活力值检测结果；左边的纵坐标代表洗脱样品的A₂₈₀数值，右边的纵坐标代表洗脱样品中酶活力值；

图9示实施例8制备获得的漆酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M示标准蛋白分子量Marker，1示实施例8纯化获得的漆酶，泳道2中出现的条带对应的分子量大小约为64.4KDa。

具体实施方式

本发明公开了一种降解烟梗中木质素的方法。本领域技术人员可以参考本文内容实现该方法，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种降解烟梗中木质素的方法中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1漆酶酶解烟梗中木质素的条件筛选

烟梗：由郑州卷烟厂提供，在60℃下干燥至恒重，然后用粉碎机将其粉碎，过60目筛，制得干燥烟梗粉末备用。

木质素含量的测定：将准确称取的1g梗末样品用滤纸包好，然后放进索氏提取器中用1:2乙醇-苯混合液抽提6h，取出风干后移到250mL具有磨口玻璃塞的锥形瓶中，加入72%的硫酸15mL，放在25℃恒温水浴锅中保温2.5h并不断搅拌，然后将其全部转移到1000mL锥形瓶中，加水稀释至硫酸的浓度为3%左右，保持体积煮沸4h；用恒重的定量滤纸过滤，再洗涤至中性，然后将残渣和滤纸一起移入称量瓶中，于105℃烘箱中烘至恒重（即为烘干后木质素残渣），最后放入马弗炉中灼烧灰化至恒重为止。木质素含量的计算公式，如下：

根据酶解前后样品中木质素的含量，按照下面的公式，计算木质素降解率：

漆酶酶解烟梗中木质素的酶解条件筛选：

分别准确称取2g烟梗粉末置于三角瓶中，加入漆酶（购买于北京诺维信公司），90mL pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（取醋酸钠18g，与9.8ml冰醋酸混合，最后用水稀释至1000ml，即可得到。），最后加入水至100mL，每组重复3个平行样，置于全温振荡培养箱转速150r/min，使烟梗末与酶液充分混合。到达规定时间后取出，过滤处理液并洗净样品。用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上。按照本实施例提供的木质素含量的测定方法测定酶解后所得样品中木质素的含量，并计算得出本发明提供的酶解方法对烟梗中木质素的降解率。

酶解条件的筛选：

（1）酶解pH值：

按照酶解温度为40℃，酶解时间为48h，漆酶添加量为30U/mL，酶解pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。酶解完毕之后，过滤处理液并洗净样品，测定酶解之后样品中木质素的含量，计算得出烟梗中木质素的降解率，实验数据为三次重复实验的平均值，具体见表1。

表1pH值对烟梗中木质素酶解的影响

酶解pH值	3.5	4.0	4.5	5.0	5.5	6.0
							木质素降解率(%)	3.8	5.7	9.9	12.2	10.9	9.5

实验结果表明，随着酶解液pH值的增大，木质素降解率逐步增大，在pH5.0时，木质素降解率达到最大值；之后木质素降解率随着pH值继续升高反而下降。因此，酶解液pH值为5.0时，木质素的降解效果最好。

（2）酶解温度：

酶解液pH值为5.0，酶解时间48h，漆酶添加量为30U/mL，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下进行酶解反应，酶解完毕之后，过滤处理液并洗净样品，测定酶解之后所得样品中木质素的含量，计算得出烟梗中木质素的降解率，实验数据为三次重复实验平均值，具体见表2。

表2酶解温度对烟梗中木质素酶解的影响

酶解温度（℃）	25	30	35	40	45	50
							木质素降解率(%)	5.4	6.3	10.2	12.7	14.1	12.1

实验结果表明，在较低温度下，木质素降解率随温度的升高而增大，当温度达到45℃时出现峰值；如果继续升高温度，木质素降解率反而会下降。这可能是因为温度过高造成酶变性，从而导致酶活下降，影响酶解效率。因此，在酶解温度45℃时，烟梗中木质素的降解效果最好。

（3）酶解时间：

酶解液pH值5.0，漆酶添加量为30U/mL，在45℃下分别酶解12h、24h、36h、48h、60h、72h，酶解完毕之后，过滤处理液并洗净样品，测定酶解之后所得样品中木质素的含量，计算得出烟梗中木质素的降解率，实验数据为三次重复实验平均值，具体见表3。

表3酶解时间对烟梗中木质素酶解的影响

酶解时间（h）	12	24	36	48	60	72
							木质素降解率(%)	6.2	10.4	13.7	15.1	14.9	15.0

实验结果显示，在酶解开始阶段，随着酶解时间的延长，木质素降解率增加较快，48h后木质素降解率上升逐渐缓慢。故在酶解过程中选择48h较经济。

（4）酶用量：

酶解液pH值5.0，漆酶添加量分别为5U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL，在45℃下酶解48h，酶解完毕之后，过滤处理液并洗净样品，测定酶解之后所得样品中木质素的含量，计算得出烟梗中木质素的降解率，实验数据为三次重复实验平均值，具体见表4。

表4酶用量对烟梗中木质素酶解的影响

漆酶用量（U/mL）	5	10	15	20	25	30
							木质素降解率(%)	4.8	9.3	13.6	16.2	16.3	16.3

实验结果显示，随着漆酶添加量的增大，木质素降解率也随之增大。这是由于随着漆酶酶量的增加，酶与底物接触的机会就会增大，从而加速了酶解反应的进行。当酶与底物的有效接触达到饱和时，木质素降解率将不会再随酶量的增加而升高。因此最适漆酶添加量选择20U/mL。

本实施例采用漆酶降解烟梗中的木质素，仔细研究了影响烟梗中木质素酶解的因素。通过单因素试验，确定了利用漆酶降解烟梗中木质素的最佳条件为：酶解pH值为5.0，酶解温度为45℃，酶解时间48h，漆酶添加量为20U/mL，以g/U计，烟梗的质量与所用漆酶的酶活力值之比为1:1000。

实施例2利用漆酶酶解烟梗中木质素

准确称取烟梗20g烟梗粉置于三角瓶中，加入漆酶20000U（购买于北京诺维信公司），乙酸-乙酸钠缓冲液900mL，最后加入水至1000mL，调节酶解液的pH值为5.0，将三角瓶置于全温振荡培养箱转速150r/min，45℃条件下、酶解48h。酶解完毕后，过滤，收集沉淀，并用100mL水洗涤所得沉淀物，干燥，得17.02g产品。用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上。按照实施例1中提供的木质素含量测定方法测定酶解前后样品中木质素的含量，得酶解前烟梗中木质素的含量为4.82%，酶解后烟梗中木质素的含量为4.10%。根据实施例1中提供的木质素降解率计算公式，计算得出本实施例提供的酶解方法对烟梗中木质素的降解率为14.9%。

实施例3利用漆酶降解烟梗中木质素

准确称取烟梗20g烟梗粉置于三角瓶中，加入漆酶16000U（购买于北京诺维信公司），缓冲液700mL，最后加入水至800mL，调节酶解液的pH值为5.5，将三角瓶置于全温振荡培养箱转速160r/min，40℃条件下、酶解60h。酶解完毕后，过滤，收集沉淀，并用100mL水洗涤所得沉淀物，干燥，得17.18g产品。用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上。按照实施例1中提供的木质素含量测定方法测定酶解前后样品中木质素的含量，得酶解前烟梗中木质素的含量为4.74%，酶解后烟梗中木质素的含量为4.07%。根据实施例1中提供的木质素降解率计算公式，计算得出本实施例提供的酶解方法对烟梗中木质素的降解率为14.1%。

实施例4利用漆酶降解烟梗中木质素

准确称取烟梗20g烟梗粉置于三角瓶中，加入漆酶24000U（购买于北京诺维信公司），缓冲液（1100）mL，最后加入水至1200mL，调节酶解液的pH值为4.5，将三角瓶置于全温振荡培养箱转速170r/min，50℃条件下、酶解36h。酶解完毕后，过滤，收集沉淀，并用100mL水洗涤所得沉淀物，干燥，得16.86g产品。用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上。按照实施例1中提供的木质素含量测定方法测定酶解前后样品中木质素的含量，得酶解前烟梗中木质素的含量为4.79%，酶解后烟梗中木质素的含量为4.04%。根据实施例1中提供的木质素降解率计算公式，计算得出本实施例提供的酶解方法对烟梗中木质素的降解率为15.7%。

实施例5杂色云芝菌发酵生产漆酶的发酵条件筛选

本实施例制备漆酶所用的菌株为杂色云芝菌，该杂色云芝菌（Coriolusversicolor）由郑州轻工业学院生物实验室赠送，菌丝体于4℃保存在PDA斜面培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）上。挑取一环杂色云芝菌，接种至灭活冷却后的马铃薯葡萄糖培养基平板上，该马铃薯葡萄糖培养基平板的组成为：马铃薯提取液（称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切成边长约1cm的小块，于锅中加蒸馏水1000mL煮沸30min，后用8层纱布过滤，所得滤液即为马铃薯浸出液，补水至1000mL。）20%（体积百分比计），葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄4g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，ZnSO₄0.5g/L，维生素B₁0.001g/L，琼脂20g/L。将接种杂色云芝菌的马铃薯葡萄糖培养基平板于30℃条件下培养8天。

从所得培养平板中取3片直径1cm的菌片接入发酵培养基中进行发酵生产漆酶。为了获得具有较高酶活力的漆酶，本发明对杂色云芝菌发酵产漆酶的发酵条件进行了筛选，主要考察的发酵条件包括：碳源、氮源、pH值、铜离子浓度和发酵时间。本实施例所用的发酵培养基为液体马铃薯产酶培养基，其组成为：马铃薯提取液20%（体积百分比）、碳源20g/L、氮源4.0g/L、KH₂PO₄3.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，ZnSO₄0.5g/L，CuSO₄，维生素B₁0.001g/L。本发明漆酶酶活的测定方法为ABTS法，具体为：将在一定条件下，每分钟氧化1.0μmol的底物所需要的酶量定义为1个酶活力单位（U）。本发明以2,2’-连氮-二（3-乙基苯并噻唑）-6-磺酸（简称ABTS）（λ=420nm，e₄₂₀=36000(mol/L)^-1cm^-1)为底物，在25℃下，2.5mL的缓冲液（pH=4.5，0.1mol/L醋酸-醋酸钠）中加入0.4mL ABTS（0.5mmol/L)，然后加入0.1mL的漆酶液体启动反应，在420nm下测定3min内吸光值的变化，以加热失活的酶液按照同样方法处理作为空白对照。

发酵条件的筛选：

（1）碳源：

分别以葡萄糖、羧甲基纤维素钠、乳糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉及蔗糖为碳源，浓度为20.0g/L，其他条件相同制备获得发酵培养基，接种后，于130r/min、28℃摇床恒温振荡培养7d后，取发酵液于离心管中，在12000r/min下离心10min，取上清测定其中漆酶的酶活力。各个组别的漆酶酶活力测试结果见表5。

表5不同的碳源对杂色云芝菌发酵产漆酶的影响

实验结果表明以葡萄糖作为碳源的发酵培养基产酶的酶活力效果最佳，这可能是因为单糖等小分子物质容易被杂色云芝菌所吸收而有利于漆酶的合成。因此，选择葡萄糖为杂色云芝菌发酵产漆酶所用发酵培养基的碳源。

（2）氮源：

碳源为20.0g/L的葡萄糖，分别以4.0g/L的(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、豆粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和尿素作为发酵培养基的氮源，其他条件相同制备获得发酵培养基，接种后，于130r/min、28℃摇床恒温振荡培养7d后，取发酵液于离心管中，在12000r/min下离心10min，取上清测定漆酶的酶活力。各个组别的漆酶酶活力测试结果见表6。

表6不同的氮源对杂色云芝菌发酵产漆酶的影响

氮源	(NH₄)₂SO₄	NH₄NO₃	豆粉	酵母膏	牛肉膏	蛋白胨	尿素
								酶活力(U/mL)	16.8	17.3	18.8	20.9	21.5	23.8	19.5

实验结果表明以蛋白胨为氮源时，漆酶的酶活力值最高。因此，选择蛋白胨为杂色云芝菌发酵生产漆酶所用的发酵培养基的氮源。

（3）pH值

为了考察不同的初始pH值，即发酵培养基的初始pH值对杂色云芝菌漆酶合成的影响，以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源，分别配置不同pH值的发酵培养基：pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0，其他条件相同制备获得发酵培养基，接种后，于130r/min、28℃摇床恒温振荡培养7d后，取发酵液于离心管中，在12000r/min下离心10min，取上清测定漆酶的酶活力。各个组别的漆酶酶活力测试结果见表7。

表7不同的pH值对杂色云芝菌发酵产漆酶的影响

pH值	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0
							酶活力(U/mL)	10.0	22.5	27.6	24.7	13.6	7.3

实验结果表明，杂色云芝菌发酵培养基初始pH值为5.0时，产漆酶的效果最佳，可能是由于杂色云芝菌略有嗜酸性，在略偏酸性的环境中有利用菌丝生长。因此，选择pH5.0作为杂色云芝菌发酵产漆酶的发酵培养基的最适初始pH值。

（4）铜离子浓度：

铜离子参与漆酶蛋白结构的组成，它能显著提高真菌产漆酶的能力。本发明设计八个浓度梯度考察不同浓度的铜离子对杂色云芝菌产漆酶效果的影响：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L，以葡萄糖作为碳源、蛋白胨作为氮源、pH值为5.0，分别以制备获得不同铜离子浓度的发酵培养基，接种后，于130r/min、28℃摇床恒温振荡培养7d后，取发酵液于离心管中，在12000r/min下离心10min，取上清测定漆酶的酶活力。各个组别的漆酶酶活力测试结果见表8。

表8不同的铜离子浓度对杂色云芝菌发酵产漆酶的影响

CuSO₄浓度（mmol/L）	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4
									酶活力(U/mL)	27.8	35.4	38.9	43.4	52.9	69.6	55.4	48.2

实验结果表明，在较低浓度时，随着铜离子浓度的增加漆酶酶活力也逐渐增大，但当铜离子浓度大于1.0mmol/L时，漆酶酶活力反而减小，因此，选择1.0mmol/L为杂色云芝菌发酵培养基中加入铜离子的适宜浓度。

（5）发酵时间：

将杂色云芝菌接种至优化后的发酵培养基后（即发酵培养基的碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨、初始pH值为5.0、铜离子浓度为1.0mmol/L），于130r/min、28℃条件下，恒温振荡培养，每隔24h取一次样，测定上清中的漆酶酶活力，本发明研究了杂色云芝菌发酵第1d到第9d的酶活力变化情况，实验结果见表9。

表9不同的发酵时间对杂色云芝菌发酵产漆酶的影响

发酵时间	1d	2d	3d	4d	5d	6d	7d	8d	9d
										酶活力(U/mL)	0	0	4.3	12.6	42.7	66.4	78.2	65.3	50.1

实验结果表明，发酵前3天内没有漆酶生成，第4天之后开始产酶，到第7天漆酶酶活力达到最高，之后逐渐减小。这可能是因为随着发酵时间的延长，发酵液中的营养物质被消耗减少，氧气浓度也逐渐降低，导致菌丝代谢能力下降，出现自溶现象，最终导致漆酶酶活力也随之降低。因此，选择7天为杂色云芝菌发酵产漆酶的最适发酵时间。

综合考虑以上五个因素，为了获得较高的漆酶酶活力，利用杂色云芝菌发酵生产漆酶的最佳发酵条件如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨4.0g/L，CuSO4浓度为1.0mmol/L，初始pH为5.0，发酵时间为7天。

实施例6漆酶的制备

取一环杂色云芝菌，接种至灭活冷却后的马铃薯葡萄糖培养基平板上，该马铃薯葡萄糖培养基平板的组成为：马铃薯提取液（称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切成边长约1cm的小块，于锅中加蒸馏水1000mL煮沸30min，后用8层纱布过滤，所得滤液即为马铃薯浸出液，补水至1000mL。）15%（体积百分比计），葡萄糖18g/L，(NH₄)₂SO₄3.5g/L，KH₂PO₄2.5g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，MnSO₄·7H₂O0.1g/L，ZnSO₄0.1g/L，维生素B₁0.001g/L，琼脂20g/L。将接种杂色云芝菌的马铃薯葡萄糖培养基平板，于32℃条件下培养7天。

从所得培养平板中取3片直径1cm的菌片接入500mL发酵培养基中进行发酵生产漆酶。发酵培养基的组成为：马铃薯提取液20%（体积百分比）、葡萄糖20g/L、蛋白胨4.0g/L、KH₂PO₄3.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，ZnSO₄0.5g/L，CuSO₄1.0mmol/L，维生素B₁0.001g/L。发酵条件为：发酵培养基的初始pH值为5.0，发酵温度为28℃，摇床转速（通气条件）150r/min，发酵时间为7天。发酵完毕后，取所得发酵液于离心管中，在12000r/min下离心10min，所得上清液即为粗酶液，采用ABTS法检测所得粗酶液中漆酶的酶活力，进行三次测定取平均值。测定结果为78.2U/mL。

将所得上清液用0.22μm的滤膜过滤，然后在保持上清液温度为0℃～4℃的情况下进行超滤浓缩，至约200mL。准确量取150mL浓缩液，缓慢加入经过研磨的硫酸铵粉末33.9g，缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液中硫酸铵的饱和度为40，即达到一级饱和度，4℃静置4h，使蛋白质充分沉淀。在4℃、14000r/min的条件下离心15min，弃去沉淀留取上清液。取所得上清液，向其中继续加入硫酸铵粉末38.7g至饱和度为80，即达到二级饱和度，缓慢搅拌充分混合，4℃静置过夜，离心后收集沉淀，溶于15mL乙酸钠缓冲液（10mmol/L，pH4.5）中，4℃存放，备用。

将透析袋剪成10cm长的片段，在烧杯中加入2%碳酸氢钠和1mmol/LEDTA溶液，放入透析袋，煮沸10min。用蒸馏水彻底洗涤后再煮沸10min，冷却，备用。取15mL所得乙酸钠溶液装入透析袋中，于pH7.0的蒸馏水中透析24h，每隔6h更换一次缓冲液。取出透析袋，在透析袋外面涂布聚乙二醇粉末，置于4℃冰箱中进行浓缩，中间更换两次干燥的聚乙二醇粉末，直至浓缩到5mL左右。

将经过透析、浓缩所得的溶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（购自于美国GE公司），然后依次用0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度10mL，洗脱流速为2.0mL/min。自动分步收集器收集洗脱液，每4mL收集一管，检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，收集具有酶活的组分。以每管洗脱液的蛋白含量（A₂₈₀表示）、酶活力值、以及NaCl洗脱浓度对洗脱样品进行作图分析漆酶纯化情况，结果见图1和图2，图1包括各个洗脱样品的蛋白浓度曲线和洗脱样品所对应洗脱液中的NaCl浓度曲线，图2包括洗脱样品的蛋白浓度曲线和酶活力曲线。图1中曲线1示各个洗脱样品A₂₈₀检测结果；曲线2示洗脱样品的酶活力值检测结果。从图1中曲线1可以看出在整个洗脱阶段出现了两个大小不等的蛋白质峰，对应曲线1和曲线2可以得出这两个蛋白质峰所对应的洗脱样品中NaCl的浓度。图2中曲线1为洗脱样品A₂₈₀检测结果，曲线2为洗脱样品的酶活力值检测结果；从图2中的曲线1可以看出，在整个洗脱阶段出现了两个大小不等的蛋白质峰；从图2中的曲线2可以看出第二十八到第四十管对应的洗脱组分中漆酶的酶活力值较高；对比图2中曲线1和曲线2，发现漆酶酶活力较高的洗脱样品与第二个蛋白质洗脱峰相一致，表示该蛋白即为漆酶酶蛋白，合并第二十八到四十管所对应的洗脱组分，将所得洗脱样品透析、浓缩至5mL，0℃～4℃保存。

采用SDS-PAGE电泳检测所得漆酶的纯度及分子量。以上海生工生物公司提供的中分子量标准蛋白为标准，电泳条件为恒压，浓缩胶70～90V，分离胶110～130V。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。纯化所得漆酶样品和标准蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图3，根据纯化所得漆酶样品和标准蛋白的相对迁移率Rf值，得出本实施例纯化获得的漆酶的相对分子质量大小约为64.4KDa，比活力为233.02U/mg，所得漆酶的酶活力值为28.41U/mL。

在本实施例的漆酶纯化过程中，粗酶液经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、以及DEAE-Sepharose F.F.柱层析的逐级分离后，漆酶粗酶液得到了纯化，且效果较好，整个分离纯化过程中漆酶被纯化了22.80倍，酶活的回收率为36.32%。

实施例7漆酶的制备

取一环杂色云芝菌，接种至灭活冷却后的马铃薯葡萄糖培养基平板上，该马铃薯葡萄糖培养基平板的组成为：马铃薯提取液（称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切成边长约1cm的小块，于锅中加蒸馏水1000mL煮沸30min，后用8层纱布过滤，所得滤液即为马铃薯浸出液，补水至1000mL。）25%（体积百分比计），葡萄糖22g/L，(NH₄)₂SO₄4.5g/L，KH₂PO₄3.5g/L，MgSO₄·7H₂O2.0g/L，MnSO₄·7H₂O0.9g/L，ZnSO₄0.9g/L，维生素B₁0.005g/L，琼脂30g/L。将接种杂色云芝菌的马铃薯葡萄糖培养基平板，于28℃条件下培养10天。

从所得培养平板中取3片直径1cm的菌片接入500mL发酵培养基中进行发酵生产漆酶。发酵培养基的组成为：马铃薯提取液25%（体积百分比）、葡萄糖22g/L、蛋白胨4.5g/L、KH₂PO₄3.5g/L，MgSO₄·7H₂O2.0g/L，MnSO₄·7H₂O0.9g/L，ZnSO₄0.9g/L，CuSO₄0.9mmol/L，维生素B₁0.005g/L。发酵条件为：发酵培养基的初始pH值为6.0，发酵温度为30℃，摇床转速（通气条件）180r/min，发酵时间为6天。取所得发酵液于离心管中，在12000r/min下离心10min，所得上清液即为粗酶液，采用ABTS法检测所得所得粗酶液中漆酶的酶活力，进行三次测定取平均值。测定结果为66.4U/mL。

将所得上清液用0.22μm的滤膜过滤，然后在保持上清液温度为0℃～4℃的情况下进行超滤浓缩，至约200mL。准确量取180mL浓缩液，缓慢加入经过研磨的硫酸铵粉末64.98g，缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液中硫酸铵的饱和度为60，即达到一级饱和度，4℃静置6h，使蛋白质充分沉淀。在4℃、18000r/min的条件下离心20min，弃去沉淀留取上清液。取所得上清液，向其中继续加入硫酸铵粉末36.18g至饱和度为90，即达到二级饱和度，缓慢搅拌充分混合，4℃静置过夜，离心后收集沉淀，溶于25mL乙酸钠缓冲液（10mmol/L，pH4.5）中，4℃存放，备用。

将透析袋剪成20cm长的片段，在烧杯中加入2%碳酸氢钠和1mmol/LEDTA溶液，放入透析袋，煮沸10min。用蒸馏水彻底洗涤后再煮沸10min，冷却，备用。取25mL所得乙酸钠溶液装入透析袋中，于pH7.0的蒸馏水中透析24h，每隔6h更换一次缓冲液。取出透析袋，在透析袋外面涂布聚乙二醇粉末，置于4℃冰箱中进行浓缩，中间更换两次干燥的聚乙二醇粉末，直至浓缩到10mL左右。

将经过透析、浓缩所得的溶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（美国GE公司），然后依次用0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度10mL，洗脱流速为2.0mL/min。自动分步收集器收集洗脱液，每4mL收集一管，检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，收集具有酶活的组分。以每管洗脱液的蛋白含量（A₂₈₀表示）、酶活力值、以及NaCl洗脱浓度对洗脱样品进行作图分析漆酶纯化情况，结果见图4和图5，图4包括各个洗脱样品的蛋白浓度曲线和洗脱样品所对应洗脱液中的NaCl浓度曲线，图5包括洗脱样品的蛋白浓度曲线和酶活力曲线。图4中曲线1示各个洗脱样品A₂₈₀检测结果；曲线2示洗脱样品的酶活力值检测结果。从图4中曲线1可以看出在整个洗脱阶段出现了三个大小不等的蛋白质峰，对应曲线1和曲线2可以得出这三个蛋白质峰所对应的洗脱样品中NaCl的浓度。图5中曲线1为洗脱样品A₂₈₀检测结果，曲线2为洗脱样品的酶活力值检测结果；从图5中的曲线1可以看出，在整个洗脱阶段出现了三个大小不等的蛋白质峰；从图5中的曲线2可以看出第三十到第四十管对应的洗脱组分中漆酶的酶活力值较高；对比图5中曲线1和曲线2，发现漆酶酶活力较高的洗脱样品与第三个蛋白质洗脱峰相一致，表示该蛋白即为漆酶酶蛋白，合并第三十到第四十管所对应的洗脱组分，将所得洗脱样品透析、浓缩至5mL，0℃～4℃保存。

采用SDS-PAGE电泳检测所得漆酶的纯度及分子量。以上海生工生物公司提供的中分子量标准蛋白为标准，电泳条件为恒压，浓缩胶70～90V，分离胶110～130V。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。纯化所得漆酶样品和标准蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图6，根据纯化所得漆酶样品和标准蛋白的相对迁移率Rf值，得出本实施例纯化获得的漆酶的相对分子质量大小约为64.4KDa，比活力为225.32U/mg，所得漆酶的酶活力值为27.94U/mL。

在本实施例的漆酶纯化过程中，粗酶液经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、以及DEAE-Sepharose F.F.柱层析的逐级分离后，漆酶粗酶液得到了纯化，且效果较好，整个分离纯化过程中漆酶被纯化了21.18倍，酶活的回收率为35.69%。

实施例8漆酶的制备

取一环杂色云芝菌，接种至灭活冷却后的马铃薯葡萄糖培养基平板上，该马铃薯葡萄糖培养基平板的组成为：马铃薯提取液（称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切成边长约1cm的小块，于锅中加蒸馏水1000mL煮沸30min，后用8层纱布过滤，所得滤液即为马铃薯浸出液，补水至1000mL。）20%（体积百分比计），葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄4g/L，KH₂PO₄3.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，ZnSO₄0.5g/L，维生素B₁0.002g/L，琼脂25g/L。将接种杂色云芝菌的马铃薯葡萄糖培养基平板，于30℃条件下培养8天。

从所得培养平板中取3片直径1cm的菌片接入500mL发酵培养基中进行发酵生产漆酶。发酵培养基的组成为：马铃薯提取液15%（体积百分比）、葡萄糖18g/L、蛋白胨3.5g/L、KH₂PO₄2.5g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，MnSO₄·7H₂O0.1g/L，ZnSO₄0.1g/L，CuSO₄0.8mmol/L，维生素B₁0.002g/L。发酵条件为：发酵培养基的初始pH值为4.0，发酵温度为29℃，摇床转速（通气条件）120r/min，发酵时间为8天。取所得发酵液于离心管中，在12000r/min下离心10min，所得上清液即为粗酶液，采用ABTS法检测所得所得粗酶液中漆酶的酶活力，进行三次测定取平均值。测定结果为65.3U/mL。

将所得上清液用0.22μm的滤膜过滤，然后在保持上清液温度为0℃～4℃的情况下进行超滤浓缩，至约200mL。准确量取160mL浓缩液，缓慢加入经过研磨的硫酸铵粉末46.56g，缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液中硫酸铵的饱和度为50，即达到一级饱和度，4℃静置5h，使蛋白质充分沉淀。在4℃、16000r/min的条件下离心18min，弃去沉淀留取上清液。取所得上清液，向其中继续加入硫酸铵粉末36.8g至饱和度为85，即达到二级饱和度，缓慢搅拌充分混合，4℃静置过夜，离心后收集沉淀，溶于20mL乙酸钠缓冲液（10mmol/L，pH4.5）中，4℃存放，备用。

将透析袋剪成15cm长的片段，在烧杯中加入2%碳酸氢钠和1mmol/LEDTA溶液，放入透析袋，煮沸10min。用蒸馏水彻底洗涤后再煮沸10min，冷却，备用。取20mL所得乙酸钠溶液装入透析袋中，于pH7.0的蒸馏水中透析24h，每隔6h更换一次缓冲液。取出透析袋，在透析袋外面涂布聚乙二醇粉末，置于4℃冰箱中进行浓缩，中间更换两次干燥的聚乙二醇粉末，直至浓缩到5mL左右。

将经过透析、浓缩所得的溶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，然后依次用0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度10mL，洗脱流速为2.0mL/min。自动分步收集器收集洗脱液，每4mL收集一管，检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，收集具有酶活的组分。以每管洗脱液的蛋白含量（A₂₈₀表示）、酶活力值、以及NaCl洗脱浓度对洗脱样品进行作图分析漆酶纯化情况，结果见图7和图8，图7包括各个洗脱样品的蛋白浓度曲线和洗脱样品所对应洗脱液中的NaCl浓度曲线，图8包括洗脱样品的蛋白浓度曲线和酶活力曲线。图7中曲线1示各个洗脱样品A₂₈₀检测结果；曲线2示洗脱样品的酶活力值检测结果。从图7中曲线1可以看出在整个洗脱阶段出现了两个大小不等的蛋白质峰，对应曲线1和曲线2可以得出这两个蛋白质峰所对应的洗脱样品中NaCl的浓度。图8中曲线1为洗脱样品A₂₈₀检测结果，曲线2为洗脱样品的酶活力值检测结果；从图8中的曲线1可以看出，在整个洗脱阶段出现了两个大小不等的蛋白质峰；从图8中的曲线2可以看出第三十三到第三十五管对应的洗脱组分中漆酶的酶活力值较高；对比图8中曲线1和曲线2，发现漆酶酶活力较高的洗脱样品与第二个蛋白质洗脱峰相一致，表示该蛋白即为漆酶酶蛋白，合并第三十三到第三十五管所对应的洗脱组分，将所得洗脱样品透析、浓缩至5mL，0℃～4℃保存。

采用SDS-PAGE电泳检测所得漆酶的纯度及分子量。以上海生工生物公司提供的中分子量标准蛋白为标准，电泳条件为恒压，浓缩胶70～90V，分离胶110～130V。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。纯化所得漆酶样品和标准蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图9，根据纯化所得漆酶样品和标准蛋白的相对迁移率Rf值，得出本实施例纯化获得的漆酶的相对分子质量大小约为64.4KDa，比活力为208.87U/mg，所得漆酶的酶活力值为27.03U/mL。

在本实施例的漆酶纯化过程中，粗酶液经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、以及DEAE-Sepharose F.F.柱层析的逐级分离后，漆酶粗酶液得到了纯化，且效果较好，整个分离纯化过程中漆酶被纯化了20.42倍，酶活的回收率为32.97%。

实施例9利用漆酶酶解烟梗中木质素

准确称取烟梗20g烟梗粉置于三角瓶中，加入实施例6提供的制备方法制备获得的漆酶704mL（转化为漆酶的酶活力值为20000U），缓冲液260mL，最后加入水至1000mL，调节酶解液的pH值为5.0，将三角瓶置于全温振荡培养箱转速150r/min，45℃条件下、酶解48h。酶解完毕后，过滤，收集沉淀，并用100mL水洗涤所得沉淀物，干燥，得16.62g产品。用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上。按照实施例1中提供的木质素含量测定方法测定酶解前后样品中木质素的含量，得酶解前烟梗中木质素的含量为4.85%，酶解后烟梗中木质素的含量为4.03%。根据实施例1中提供的木质素降解率计算公式，计算得出本实施例提供的酶解方法对烟梗中木质素的降解率为16.9%。

实施例10利用漆酶降解烟梗中木质素

准确称取烟梗20g烟梗粉置于三角瓶中，加入实施例7提供的制备方法制备获得的漆酶859mL（转化为漆酶的酶活力值为24000U），缓冲液100mL，最后加入水至1200mL，调节酶解液的pH值为4.5，将三角瓶置于全温振荡培养箱转速170r/min，48℃条件下、酶解36h。酶解完毕后，过滤，收集沉淀，并用100mL水洗涤所得沉淀物，干燥，得16.70g产品。用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上。按照实施例1中提供的木质素含量测定方法测定酶解前后样品中木质素的含量，得酶解前烟梗中木质素的含量为4.78%，酶解后烟梗中木质素的含量为3.99%。根据实施例1中提供的木质素降解率计算公式，计算得出本实施例提供的酶解方法对烟梗中木质素的降解率为16.5%。

实施例11利用漆酶降解烟梗中木质素

准确称取烟梗20g烟梗粉置于三角瓶中，加入实施例8提供的制备方法制备获得的漆酶592mL（转化为漆酶的酶活力值为16000U），缓冲液（180）mL，最后加入水至800mL，调节酶解液的pH值为5.5，将三角瓶置于全温振荡培养箱转速150r/min，40℃条件下、酶解60h。酶解完毕后，过滤，收集沉淀，并用100mL水洗涤所得沉淀物，干燥，得16.66g产品。用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上。按照实施例1中提供的木质素含量测定方法测定酶解前后样品中木质素的含量，得酶解前烟梗中木质素的含量为4.73%，酶解后烟梗中木质素的含量为3.94%。根据实施例1中提供的木质素降解率计算公式，计算得出本实施例提供的酶解方法对烟梗中木质素的降解率为16.7%。

实施例12酶解所得产品性能的研究

分别取实施例2、实施例3、实施例4、实施例9、实施例10和实施例11提供的制备方法制备获得的烟梗酶解产品100g，按照卷烟制品常规制备方法制备卷烟制品，以质量百分比计，其中含20%的烟梗丝（即烟梗酶解产品），具体为：分别将实施例2、实施例3、实施例4、实施例9、实施例10和实施例11提供的制备方法制备获得的烟梗酶解产品均匀混合到成品烟丝中，卷制成形，即得。根据国家标准GB5606.4-2005对所得卷烟进行感官质量考核，感官质量评价标准见表10。

表10卷烟感官质量评价标准

本发明实施例2、实施例3、实施例4、实施例9、实施例10和实施例11提供的酶解产品制得的卷烟为实验组，实施例2中灭活的酶解液进行处理制备获得的产品作为对照组，所得卷烟样品由国内具有国家或省级卷烟感官质量评吸资格证书的20位专业技术人员进行评吸，结果见表11。

表11评吸结果

项目	光泽	香气	谐调	杂气	刺激性	余味	合计
								对照组	5	22.89	5	7.85	13.23	18.60	72.57
实施例2	5	27.17	5	9.18	17.07	21.75	85.17
								实施例3	5	26.75	5	9.76	16.88	22.03	85.42
实施例4	5	26.80	5	9.62	17.00	21.87	85.29
								实施例9	5	30.96	5	11.02	18.83	24.01	94.82
实施例10	5	30.60	5	10.97	18.89	23.77	94.23
								实施例11	5	31.15	5	11.27	18.90	23.68	95.00

根据实验结果可知，相比对照组，实验组的卷烟产品（实施例2、实施例3、实施例4、实施例9、实施例10和实施例11制备获得的酶解产品制备获得的卷烟产品）的杂气、刺激性明显降低，木质气大幅减弱，差异显著，提高了卷烟的香气和余味，说明本发明提供的降解烟梗中木质素的方法提升了烟梗丝的品质，更有利于烟梗丝资源的充分利用。相比实施例2、实施例3和实施例4制备获得的烟梗酶解产品制得的卷烟产品，实施例9、实施例10和实施例11制备获得的酶解产品制备获得的卷烟产品的杂气、刺激性进一步降低、木质气进一步减弱，差异显著，显著提高了卷烟的香气和余味，说明利用本发明提供的漆酶降解烟梗中木质素，进一步提升了烟梗丝的品质，更有利于烟梗丝资源的充分利用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种降解烟梗中木质素的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为45℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的pH值为5.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的时间为48h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以g/U计，所述烟梗的质量与所述漆酶的酶活力之比为1:800～1200。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述漆酶的制备方法包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28℃。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵的pH值为5.0。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为7d。