CN102524942B - 一种降低烟草梗丝中的木质素含量的方法 - Google Patents
一种降低烟草梗丝中的木质素含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用木质素降解复合酶法处理烟草梗丝以达到降低烟草梗丝木质素含量的方法。该方法包括在微波炉中进行加热灭菌、复合酶降解木质素、加热使复合酶变性与平衡处理等步骤。本发明使用复合酶处理烟草梗丝，降低了烟草梗丝中的木质素含量，使用本发明低含量木质素烟草梗丝生产的烟草制品在杂气、劲头、刺激性和余味方面都有非常明显的改善。
Description
【技术领域】
本发明涉及烟草加工技术领域。更具体地，本发明涉及一种利用木质素降解复合酶法处理烟草梗丝以达到降低烟草梗丝木质素含量的方法。
【背景技术】
随着卷烟技术的发展，在卷烟原料中添加一定比例的烟草梗丝可部分改善卷烟品质。烟草梗丝的主要成分是木质素、纤维素和果胶等，而木质素是造成梗丝杂气、木质气重及燃烧时产生灼喉刺激感的主要物质。因此，降低烟草梗丝木质素含量、改善其应用效果是解决这些烟草制品质量的非常关键的技术问题。
木质素是一种芳香族高分子化合物，通过形成交织网来增强细胞壁及黏合纤维，具有抗压作用。木质素分为紫丁香基木质素(syringyllignin，S-木质素)，愈创木基木质素(guajacyl lignin，G-木质素)和对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyl lignin，H-木质素)。
烟草细胞壁物质中的木质素是由苯丙烷衍生物单体(如香豆醇、松柏醇和芥子醇等)构成的一种结构复杂的立体网状物质，是具有生物多态性的生物大分子，其填充在纤维素和半纤维素的空隙之中，紧密结合形成了致密的细胞壁结构。木质素普遍存在于烟草梗丝中，对卷烟抽吸品质的影响很大，在吸食过程中木质素受高温热解会产生儿茶酚、烷基儿茶酚等引起涩口等令人不愉快的感官效果，同时，研究表明这些物质可能存在一定的致癌活性。
随着生物技术的进步，烟草工作者已开始研究木质素降解微生物及其降解酶的应用。目前应用生物复合酶处理烟草梗丝报道较少。利用生物复合酶降解烟草梗丝木质素，改善梗丝质量，提高其在卷烟中的应用效果是本申请人研究的主要目的。因此，本发明人在分析现有技术状况的基础上，通过大量试验完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种降低烟草梗丝中的木质素含量的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种降低烟草梗丝中的木质素含量的方法。
该方法的步骤如下：
A、烟草梗丝在微波炉中进行加热灭菌，得到一种无菌烟草梗丝原料；
B、在室温下，把木质素降解复合酶水溶液喷洒到步骤A)得到的无菌烟草梗丝原料上，所述木质素降解复合酶的用量是以烟草梗丝总重量计10-30％，混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中在酶解温度30-60℃下进行酶解12-72h，得到一种酶解烟草梗丝；
C、步骤B)得到的酶解烟草梗丝在微波炉中进行加热，使其木质素降解复合酶变性，得到一种酶解变性的烟草梗丝；
D、步骤C)得到的酶解变性烟草梗丝进行自然风干，使其含水率达到以酶解变性烟草梗丝总重量计11.5-12.5％，然后在温度20-24℃和相对湿度55-65％的条件下进行平衡40-60h，这样得到一种低含量木质素的烟草梗丝。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的烟草梗丝是使用水漂洗烟梗，再经切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述烟草梗丝的厚度是0.1-0.2mm，宽度是1.0-2.0mm。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的烟草梗丝在微波炉中在功率800-1200W的条件下进行灭菌2-4min。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的木质素降解复合酶是含木素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)和漆酶(Lac)的复合酶。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述木质素降解复合酶中含木素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)与漆酶(Lac)的重量比是1∶0.5-3.0∶0.8-3.0。
优选地，所述木质素降解复合酶水溶液的浓度是以重量计0.4-0.8％。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述烟草梗丝在酶解温度38-48℃下进行酶解25-55h。
根据本发明，在步骤A)中，在步骤C)中，所述微波加热是在800-1200w功率下加热1-5min，使其木质素降解复合酶灭活。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种降低烟草梗丝中的木质素含量的方法。
该方法的步骤如下：
A、烟草梗丝在微波炉中进行加热灭菌，得到一种无菌烟草梗丝原料；
烟草是茄科烟草属植物，烟梗即是烟叶之粗硬叶脉，约占叶重的25-30％。烟梗是烟草工业的副产物，同时也是宝贵的自然资源，目前多作弃置处理。我国是烟草大国，每年有数十万吨烟梗资源被废弃，既造成环境污染，同时也是对自然资源的浪费。研究表明，烟梗中含有的成分种类与烟叶成分基本一致。
所述的烟草梗丝是使用水漂洗烟梗，再经切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的。
水漂洗时使用的水量不是很关键的，只是需要完全洗去在烟梗上带有的或附着的各种杂质就可以，一般而言，使用的水量是烟梗重量的5-15倍。
所述烟草梗丝的厚度是0.1-0.2mm，宽度是1.0-2.0mm。
所述的切梗、闪蒸、膨化干燥处理是技术是烟草加工技术领域的技术人员最熟知的技术。
所述的烟草梗丝在微波炉中在功率800-1200W的条件下进行灭菌2-4min。
如果所述微波炉的功率低于800W，灭菌时间低于2min时，则灭菌不完全、微生物残存。如果所述微波炉的功率高于1200W，灭菌时间高于4min时，则损失、破坏致香物质。因此，在微波功率800-1200W的条件下灭菌2-4min是合适的。
本发明使用的微波炉是目前市场上大量销售的微波炉。
B、在室温下，把木质素降解复合酶水溶液喷洒到步骤A)得到的无菌烟草梗丝原料上，所述木质素降解复合酶的用量是以烟草梗丝总重量计10-30％，混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中在酶解温度30-60℃下进行酶解12-72h，得到一种酶解烟草梗丝。
所述的木质素降解复合酶是含木素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)和漆酶(Lac)的复合酶。
木素过氧化物酶是1983年首次从白腐菌中发现的一种含有血红素的木素降解酶，具有广泛的底物范围及对底物氧化的高度非特异性，在木素和小分子污染物的生物降解过程中起着关键作用。
锰过氧化物酶是一种能降解木素的酶，由担子真菌中的特定种属产生，广泛应用于生物制浆、纸浆酶法漂白、有机污染物降解和环境生物修复等方面。
漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中，反应后唯一产物水，因此本质上是一种环保型酵素。
本发明使用的木质素降解复合酶是采用下述方法制备得到的：
该木质素降解复合酶制备方法的步骤如下：
A、在常压与温度90～100℃的条件下，烟草梗丝按照其与水的重量比1∶100～500用水煮2.0～3.0h，得到一种固液混合物；
所述的烟草梗丝是烟草上、中和下部的长梗。
B、然后，按照烟草梗丝量2～10g/L，往步骤A)得到的固液混合物中添加10～20g/L葡萄糖、0.05～0.30g/L酒石酸铵、0.05～0.30g/L尿素、5mmol/L藜芦醇、1mL/L微量元素混合液，混合均匀后得到的混合液作为培养基；然后分装，在温度121℃与0.1Mpa的条件下灭菌18～25min，冷却后按照接种量以所述培养基体积计6～15％接种白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种，然后在温度28～32℃与转速140～160r/min的条件下培养8～12天。
白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种是中国微生物菌种总目录工业微生物菌种中收录的菌种。
所述的微量元素混合液含有1-2g/L硼酸、0.02-0.05g/L钼酸钠二水合物、1.2-2.0g/L氯化锰四水合物、0.1-0.4g/L硫酸锌七水合物与0.05-0.20g/L硫酸铜五水合物。
C)将步骤B)培养得到的发酵混合物通过离心分离得到上清液，弃去沉淀；
所述的发酵混合物在温度0～4℃与4000～6000r/min的条件下进行离心15～25min。
D)将步骤C)得到的上清液采用超滤浓缩、用分子量8000的透析袋透析，再采用DEAE-Sephadex A-50柱层析进行纯化，检测洗脱液蛋白含量及含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活力，得到含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。
在制备含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶时，该制备方法包括超滤浓缩、透析与柱层析步骤；
所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×104。
所述的透析是使用分子量8000的透析袋，使用pH7.2、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行透析24h，每间隔8h更换一次所述的磷酸盐缓冲液。
所述的柱层析是使用DEAE-Sephadex A-50柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度为2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及含木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的活力，收集具有酶活的组分。
在制备漆酶时，该制备方法包括超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析与DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理；
所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×104；
在超滤浓缩步骤得到的浓缩液使用以重量计65％硫酸铵溶液进行沉淀，让这种沉淀与母液在温度4℃下放置过夜，然后以转速10000r/min进行离心20min，得到的沉淀用最少量的10mmol/L pH5.0醋酸盐缓冲液溶解；
得到的溶液再使用分子量8000的透析袋，使用蒸馏水进行透析48h，每间隔12h更换一次蒸馏水；
然后，得到的透析液进行离子交换分离，使用DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及漆酶活力，收集具有酶活的组分。
在本发明中，所述木质素降解复合酶中含木素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)与漆酶(Lac)的重量比是1∶0.5-3.0∶0.8-3.0。
所述木质素降解复合酶水溶液的浓度是以重量计0.4-0.8％。如果所述木质素降解复合酶水溶液的浓度低于0.4％，则不能有效降解梗丝木质素、达到改善梗丝质量的目的；如果所述木质素降解复合酶水溶液的浓度高于0.8％，酶解过程形成反馈抑制、酶液不能充分利用，造成酶液浪费及成本增加；因此，所述木质素降解复合酶水溶液的浓度为0.4-0.8％是合适的，优选地是0.4-0.6％，更优选地是0.5％。
所述木质素降解复合酶的用量是以烟草梗丝总重量计10-30％。如果所述木质素降解复合酶的用量小于10％，则酶量过少、湿度过低，不能有效降解梗丝木质素；如果所述木质素降解复合酶的用量大于30％，则湿度过大，梗丝酶解过程中易松散、变软，丝状可能被破坏；因此，所述木质素降解复合酶的用量为10-30％是合适的，优选地是14-26％，更优选地18-22％。
所述的烟草梗丝在恒温恒湿培养箱中在酶解温度30-60℃下进行酶解12-72h。优选地，所述的烟草梗丝在酶解温度38-48℃下进行酶解25-55h。更优选地，所述的烟草梗丝在酶解温度40-44℃下进行酶解32-42h。
C、步骤B)得到的酶解烟草梗丝在微波炉中进行加热，使其木质素降解复合酶变性，得到一种酶解变性的烟草梗丝；
所述微波加热是在800-1200w功率下加热1-5min，使其木质素降解复合酶灭活。
如果所述微波炉功率低于800W，加热时间低于1min时，则会复合酶不能完全灭活，梗丝特性不稳定。如果所述微波炉功率高于1200W，灭菌时间高于5min时，则会损失、破坏梗丝中的致香成分。因此，在微波功率800-1200W的条件下灭菌1-5min是合适的。
本发明使用的微波炉是目前市场上大量销售的微波炉。
D、步骤C)得到的酶解变性烟草梗丝进行自然风干，使其含水率达到以酶解变性烟草梗丝总重量计11.5-12.5％，然后在温度20-24℃和相对湿度55-65％的条件下进行平衡40-60h，这样得到一种低含量木质素的烟草梗丝。
在本发明中，所述的平衡应该理解是使梗丝湿度达到11.0-13.0％。
在本发明中，所述的木质素含量采用Klason法测定。
使用本发明制备的低含量木质素烟草梗丝生产出烟草制品。
根据中华人民共和国烟草专卖法的规定，所述的烟草制品是卷烟、雪茄烟、烟丝或复烤烟叶。
采用常规生产方法生产的烟草制品进行感官评吸鉴定。
所述的感官评吸鉴定方法是由本公司即华宝食用香精香料(上海)有限公司的五位烟用调香师组成评定小组，采用暗评方法，按照本公司建立的香气质、量、谐调、杂气、刺激、劲头和余味六项指标等级标准进行质量评定，以便对使用现有烟草与掺有本发明低含量木质素烟草梗丝的烟草生产的烟草制品品质进行比较，试验结果表明使用掺有本发明低含量木质素烟草梗丝的烟草生产的烟草制品在杂气、劲头、刺激性和余味方面都有非常明显的改善。
[有益效果]
本发明使用白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299添加梗丝作为培养基的一部分发酵提取的复合酶(含Lip、Mnp和Lac)处理烟草梗丝，降低了烟草梗丝中的木质素含量，对梗丝品质有非常明显的改善，使用本发明低含量木质素烟草梗丝生产的烟草制品在杂气、劲头、刺激性和余味方面都有非常明显的改善。
【具体实施方式】
通过下述实施例将会更进一步深刻地理解本发明。
实施例1：降低烟草梗丝中的木质素含量
称取玉溪K326长烟草梗丝30g，在微波炉中在功率800-1200W的条件下灭菌3min，自然冷却，在室温下把以重量计0.4％木质素降解复合酶水溶液(含Lip、Mnp和Lac)喷洒到该烟草梗丝原料表面上，所述的木质素降解复合酶是3.0g，充分混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中酶解，在酶解温度30℃下酶解时间12h，同时取无菌蒸馏水做对照。酶解结束后，在微波炉中在800w功率下加热1min，使酶失活，自然风干至含水率以烟草总重量计12％，在温度22℃和相对湿度60％条件下平衡48h。采用本说明书中描述的方法测定该烟草梗丝木质素含量，并由该单一原料打烟、评吸，结果如表1、表2所示。
表1：酶处理后烟叶木质素含量的变化
表2：酶处理后的评吸结果
实施例2：降低烟草梗丝中的木质素含量
称取玉溪K326长烟草梗丝30g，在微波炉中在功率1200W的条件下灭菌3min，自然冷却，在室温下把以重量计0.6％木质素降解复合酶水溶液(含Lip、Mnp和Lac)喷洒到烟草梗丝原料表面上，所述的木质素降解复合酶是9.0g，充分混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中酶解，在酶解温度60℃下酶解时间72h，同时取无菌蒸馏水做对照。酶解结束后，于微波炉中在1200w功率下加热5min，使酶失活，自然风干，使其含水率达到以酶解变性烟草梗丝总重量计12％，在温度22℃和相对湿度60％条件下平衡48h。采用本说明书中描述的方法测定该烟草梗丝木质素含量，并由该单一原料打烟、评吸，其结果如表3、表4所示。
表3：酶处理后烟叶木质素含量的变化
表4：酶处理后的评吸结果
实施例3：降低烟草梗丝中的木质素含量
称取玉溪K326长烟草梗丝30g，在微波炉中在功率1000W的条件下灭菌3min，自然冷却，在室温下把以重量计0.8％木质素降解复合酶水溶液(含Lip、Mnp和Lac)喷洒到烟草梗丝原料表面上，所述的木质素降解复合酶是6.0g，充分混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中酶解，在酶解温度45℃下酶解时间42h，同时取无菌蒸馏水做对照。酶解结束后，于微波炉中在1000w功率下加热3min，使酶失活，自然风干，使其含水率达到以酶解变性烟草梗丝总重量计12％，于温度22℃和相对湿度60％条件下平衡48h。采用本说明书中描述的方法测定该烟草梗丝木质素含量，并由该单一原料打烟、评吸，其结果如表5、表6所示。
表5：酶处理后烟叶木质素含量的变化
表6：酶处理后评吸结果
实施例4：降低烟草梗丝中的木质素含量
称取玉溪K326长烟草梗丝30g，在微波炉中在功率1000W的条件下灭菌3min，自然冷却，在室温下把以重量计0.4-0.8％木质素降解复合酶水溶液(含Lip、Mnp和Lac)喷洒到烟草梗丝原料表面上，所述的木质素降解复合酶是4.5g，充分混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中酶解，在酶解温度50℃下酶解时间54h，同时取无菌蒸馏水做对照。酶解结束后，于微波炉中在1100w功率下加热2min，使酶失活，自然风干，使其含水率达到以酶解变性烟草梗丝总重量计12％，于温度22℃和相对湿度60％条件下平衡48h。采用本说明书中描述的方法测定该烟草梗丝木质素含量，并由该单一原料打烟、评吸，其结果如表7、表8所示。
表7：酶处理后烟叶木质素含量的变化
表8：酶处理后的评吸结果
实施例5：降低烟草梗丝中的木质素含量
称取玉溪K326长烟草梗丝30g，在微波炉中在功率850W的条件下灭菌3min，自然冷却，在室温下把以重量计0.5％木质素降解复合酶水溶液(含Lip、Mnp和Lac)喷洒到烟草梗丝原料表面上，所述的木质素降解复合酶是9g，充分混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中酶解，在酶解温度60℃下酶解时间72h，同时取无菌蒸馏水做对照。酶解结束后，于微波炉中在1200w功率下加热5分钟，使酶失活，自然风干，使其含水率达到以酶解变性烟草梗丝总重量计12％，于温度22℃和相对湿度60％条件下平衡48h。采用本说明书中描述的方法测定该烟草梗丝木质素含量，并由该单一原料打烟、评吸，其结果如表9、表10所示。
表9：酶处理后烟叶木质素含量的变化
表10：酶处理后的评吸结果
Claims (6)
1.一种降低烟草梗丝中的木质素含量的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、烟草梗丝在微波炉中进行加热灭菌，得到一种无菌烟草梗丝原料；
B、在室温下，把木质素降解复合酶水溶液喷洒到步骤A）得到的无菌烟草梗丝原料上，所述木质素降解复合酶水溶液的浓度是以重量计0.4-0.8%，所述木质素降解复合酶水溶液的用量是以烟草梗丝总重量计10-30%，混合均匀后置于恒温恒湿培养箱中在酶解温度30-60℃下进行酶解12-72h，得到一种酶解烟草梗丝；所述木质素降解复合酶含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶与漆酶的重量比是1:0.5-3.0:0.8-3.0；
C、步骤B)得到的酶解烟草梗丝在微波炉中进行加热，使其木质素降解复合酶变性，得到一种酶解变性的烟草梗丝；
D、步骤C）得到的酶解变性烟草梗丝进行自然风干，使其含水率达到以酶解变性烟草梗丝总重量计11.5-12.5%，然后在温度20-24℃和相对湿度55-65%的条件下进行平衡40-60h，这样得到一种低含量木质素的烟草梗丝。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的烟草梗丝是使用水漂洗烟梗，再经切梗、闪蒸、膨化干燥处理得到的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述烟草梗丝的厚度是0.1-0.2mm，宽度是1.0-2.0mm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的烟草梗丝在微波炉中在功率800-1200W的条件下进行灭菌2-4min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述烟草梗丝在酶解温度38-48℃下进行酶解25-55h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤C）中，所述 微波加热是在800-1200w功率下加热1-5min，使其木质素降解复合酶灭活。
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