CN101880632A - 一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株 - Google Patents

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本发明公开了一种漆酶及其生产方法与专用生产菌株，涉及微生物发酵工业领域。本发明所提供的菌株为血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC №2932。本发明所提供的漆酶，是发酵血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC № 2932得到的。本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC № 2932经发酵培养，得到的发酵液漆酶酶活高达300U/ml，该漆酶可广泛应用于酚类、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解，造纸制浆生物漂白、废水处理和染料降解中，并且还可以在木材加工中替代化学胶合剂。

Description

一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株
技术领域
本发明涉及微生物酶学领域，特别涉及一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株。
背景技术
漆酶(p-diphenol oxygen oxidoreductase，EC 1.10.3.2.)是一种蓝色、含有多个铜离子的酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应。漆酶氧化的底物包括：酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。目前通过不断研究，漆酶可氧化的非酚底物范围还在不断扩大。漆酶(1accase)可降解木质素中的酚类和非酚类结构，在木质素的生物降解中发挥着重要的作用；另外，由于木质素中的许多化学键普遍存在于芳香族化合物中，而漆酶对木质素的降解又是氧化性的和非特异性的，这就使得漆酶也能降解芳香族化合物。漆酶能把分子氧直接还原为水，在没有H2O2存在下，可催化有机污染物的氧化。漆酶又能使木素类多酚物质以游离基方式进行氧化聚合，替代传统木材工业合成树脂胶粘剂或其它化学品，用无污染、低能耗的酶学的方法取代污染严重的化学方法，把污染消除在源头。因此，漆酶在生物技术和环境保护方面有着巨大的应用潜力。
白腐菌能够产生漆酶、木质素过氧化物酶(LiP)和锰氧化物酶(MnP)等，是目前能够将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯一生物。其产生的漆酶比木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶更具有热稳定性。因此，这一生物类群引起了世界生物学家的极大兴趣。
白腐菌中的血红密孔菌被认为是研究漆酶的理想菌株。然而，现有已知的菌株其漆酶活性较低。因此，漆酶的高产菌株的研究迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株。
本发明提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001，已于2009年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC № 2932。
菌株MK2001是从海南腐木上分离，并且通过土豆汁培养基(PDA)筛选培养获得。该菌是一种需氧菌，最适生长温度为30℃，发酵培养时分泌漆酶到培养基中。
本发明的另一目的在于提供所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC № 2932在制备漆酶中的应用。
所述应用是将血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932在有氧及避光条件下发酵培养，发酵培养温度可为30±1℃。
所述发酵培养用的发酵培养基包括碳源、氮源和无机组分。
所述发酵培养基的碳源可包括但不限于以下一种或几种：麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，所述碳源优选用麦芽糖。这三种糖作为碳源时菌株生长速度差别不大，但用麦芽糖作碳源时，比蔗糖和葡萄糖作碳源时产生的漆酶活性高。
所述发酵培养基的氮源可包括但不限于酒石酸铵；所述发酵培养基的无机组分包括硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙和氯化钴。
在实际应用中，还可加入营养成分如维生素B1、B2、B6等。在培养基中加入小麦麸皮，漆酶产量可以提高2-3倍。加入玉米粉，漆酶的产量会进一步得到提高。
所述1L发酵培养基具体由下列物质组成，麦芽糖：10-20g；酒石酸铵：1-3g，KH2PO4：1.32-1.34g；NaH2PO4·12H2O：0.38-0.4g；MgSO4·7H2O：0.4-0.6g；琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O：1.17-1.19g；FeSO4·7H2O：0.0314-0.0316g；CaCl2·2H2O：0.09-0.11g；MnSO4·H2O：0.034-0.036g；CH3COONa·3H2O：0.407-0.409g；CoCl2·6H2O：0.05-0.07g；ZnSO4·7H20：0.027-0.029g；CuSO4·5H2O：0.167-0.169g；小麦麸皮7-8克；玉米粉：24-26g；Tween-80：0.9-1.1ml；VitaminB1：9.5-10.5μg；VitaminB2：4.5-5.5μg；VitaminB6：4.5-5.5μg，其余为水。
所述发酵培养第3-5天向发酵培养基中加入2，5-二甲基苯胺，所述2，5-二甲基苯胺的终浓度为10μM。
发酵培养完成后，可用常规分离方法从培养基中分离出漆酶，包括以下步骤：离心分离、超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱、凝胶过滤柱和冷冻分离干燥技术。通过这些步骤可以去除大部分的杂蛋白和几乎全部的色素。
发酵培养MK2001 CGMCC № 2932得到的漆酶也属于本发明保护的范围。
本发明的另一目的在于提供所述MK2001 CGMCC № 2932在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的应用，在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应用，在木材加工替代化学胶合剂中的应用，在染料降解中的应用或在土壤修复中的应用。
本发明的又一目的在于提供本发明的漆酶在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的应用，在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应用，在木材加工替代化学胶合剂中的应用，在染料降解中的应用或在土壤修复中的应用。
本发明提供的漆酶制备方法简单方便，本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932经发酵培养，得到的漆酶酶活可高达300U/ml。该漆酶可广泛应用于酚类、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解中；还可应用在造纸制浆生物漂白、土壤修复、废水处理和染料降解中，并且还可以在木材加工中替代化学胶合剂。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1、发酵培养血红密孔菌MK2001制备漆酶
一、发酵培养血红密孔菌MK2001
固体种子培养基：含2g/100ml琼脂的麦芽汁培养基平板。
发酵培养基：麦芽糖15g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1.33g，NaH2PO4·12H2O 0.39g，MgSO4·7H2O 0.5g，琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O 1.18g，FeSO4·7H2O 0.0315g，CaCl2·2H2O0.1g，MnSO4·H2O 0.035g，CH3COONa·3H2O 0.408g，CoCl2·6H2O 0.06g，ZnSO4·7H2O 0.028g，CuSO4·5H2O 0.168g，小麦麸皮7.5g，玉米粉25g，Tween-80 1ml，VitaminB1 10μg，VitaminB2 5μg，VitaminB6 5μg，加水至1L，然后经8磅高压湿热灭菌30分钟。
将MK2001接种至固体种子培养基，在30℃下培养6-8天。取菌落最边沿的菌块(直径1cm，10块)，接种到500ml三角瓶内的经高压湿热灭菌过的100ml发酵培养基上，在30℃和240rpm下摇床中暗培养，第四天加入诱导物2，5二甲基苯胺(2，5-Dimethylaniline)，使之终浓度为10μM，培养12天。收集发酵液，按照下述方法测定漆酶活性，培养得到的漆酶活性为300U/ml。
本发明中漆酶活力的测定是用2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(英文简称ABTS){2，2’-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}来测定的。一个酶活力单位U的定义：在下述条件下，每分钟内催化1μM底物的酶量。
酶活力的计算公式为U＝A·V/(ε·L·T).
在以上的公式中，A表示紫外分光光度计吸收值的变化，V表示反应体系的体积(单位：mL)，ε＝3.6×104M·cm-1＝36(μmol/ml)-1·cm-1，为氧化型ABTS的摩尔消光系数，L为比色皿的光径(单位：cm)，T为反应的时间(单位：分钟)。
本发明中酶活力测定条件为：反应体积V＝1mL，比色皿的光径L＝0.5cm，反应时间T＝30秒，反应温度为30℃。其中1mL反应体系内含有的500μL的50mM的酒石酸缓冲液(pH＝4)，390μL的水，100μL的500μM的ABTS，10μL的发酵液，选用波长为420nm。如果发酵液含有漆酶活力太高，可适当稀释。
二、提取漆酶
1、制备粗漆酶制剂
将步骤二收集到的发酵液进行离心，除去发酵沉淀物，取上清液真空抽滤，获得抽滤液，然后将抽滤液经PLGC膜(10000D)超滤，进行初步浓缩。随后采用两步硫酸铵沉淀法沉淀，第一步用35g/100ml的饱和硫酸铵4℃搅拌沉淀，10000rpm离心1小时，弃沉淀，留上清；第二步用第一步所得的上清液加80g/100ml的饱和硫酸铵4℃温和搅拌沉淀，4℃静至2小时以上，然后10000rpm离心1小时，弃上清，留沉淀。将第二步得到的沉淀用两倍体积的100mM磷酸钾缓冲液(pH 5.7)溶解，然后进行透析，透析液为10mM的磷酸钾缓冲液(pH是5.7)。
2、分离纯化漆酶
取上述步骤二中1得到的经透析过的粗酶浓缩液用于离子交换柱层析。离子交换介质选用DEAE Sepharose F.F.，缓冲液为20mM的组氨酸缓冲液(pH6.0)，洗脱液为0.1-0.6M NaCl的组氨酸洗脱液，流速为1mL/分钟。凝胶过滤层析介质选用Sephadex G-100，洗脱液为水，流速为0.5mL/分钟，然后将含漆酶的洗脱液冷冻干燥浓缩得漆酶，-20℃低温保存。
实施例2、菌株MK2001对水稻秸秆进行木质素降解预处理实验
250ml三角瓶酶解作用体系包括：漆酶1800U，水稻秸秆0.4g，0.1M酒石酸缓冲液15ml(pH4.0)，补充无菌水至20mL。预处理温度为30℃，摇床转速150rpm/min，处理时间分别为24小时、48小时、72小时。木质素测定方法为范氏法，实验重复3次，处理结果：24小时木质素降解33.9％，48小时木质素降解了54.5％，72h小时木质素降解了56.3％。
此实施例对水稻秸秆进行木质素降解预处理实验，实验结果表明：MK2001漆酶可有效降解水稻秸秆中木质素成分。所述菌株MK2001产生的漆酶用于纤维素乙醇工艺中农作物秸秆的生物预处理，降解木质素组分，提高纤维素的利用率，达到生产纤维素乙醇的目的。
实施例3、菌株MK2001对多环芳烃中的蒽和苯并[a]芘两类化合物降解处理实验
分别取酶液各4.5ml置于15ml具塞棕色试剂瓶中，加入0.5ml蒽和苯并[a]芘的乙腈溶液，使反应体系的乙腈含量达到10％(体积百分比)，拧紧瓶塞，摇匀，置于暗室培养24h(28℃)，然后加入5ml乙腈终止反应，此时乙腈含量为55％(体积百分比)。振荡1h后(28℃，15000rpm)高速离心，过0.22μm滤膜，采用HPLC进行样品测定。对照用纯水代替酶液，其它步骤相同。同时利用Trametesversicolor来源的漆酶(漆酶(Tv))作为一组处理对照。本发明提供的P.sanguineus漆酶与漆酶(Ps)等同。
实验作用体系为：1)1mg/L蒽+1mg/L苯并[a]芘；2)1mg/L蒽+1mg/L苯并[a]芘+2Uml-1漆酶(Ps)；3)1mg/L蒽+1mg/L苯并[a]芘+2Uml-1漆酶(Ps)+1mMABTS；4)1mg/L蒽+1mg/L苯并[a]芘+2Uml-1漆酶(Tv)；5)1mg/L蒽+1mg/L苯并[a]芘+2Uml-1漆酶(Tv)+1mM ABTS。实验重复3次，实验结果表明：在未添加ABTS时，酶活为2Uml-1的P.sanguineusMK2001漆酶对1mg/L蒽和苯并[a]芘的降解率分别为16.6％和6.0％，显著大于T.versicolor漆酶的2.1％和0.1％。当添加1mM ABTS时，P.sanguineus漆酶对蒽和苯并[a]芘降解率显著增加，达到19.8％和34.4％，显著大于T.versicolor漆酶的7.0％和27.0％。
实验结果表明：不管是否存在ABTS，P.sanguineus漆酶与T.versicolor漆酶对蒽和苯并[a]芘的降解效果相比，P.sanguineus漆酶具有更为强大的氧化能力；ABTS是漆酶的底物又是提高漆酶氧化能力的调节物质，其存在可大大增加漆酶的转化效率。
因此，菌株MK2001产生的漆酶可以用于整治废水和污染土壤，修复被多环芳烃、联氯苯酚等污染物的污染。

Claims (10)

1.血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932。
2.权利要求1所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932在制备漆酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用是将所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932在有氧及避光条件下发酵培养。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵培养用的发酵培养基包括碳源、氮源和无机组分。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基的碳源包括下述至少一种物质：麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，优选为麦芽糖；所述发酵培养基的氮源包括酒石酸铵；所述发酵培养基的无机组分包括硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙和氯化钴。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述1L发酵培养基由下列物质组成，麦芽糖：10-20g；酒石酸铵：1-3g，KH2PO4：1.32-1.34g；NaH2PO4·12H2O：0.38-0.4g；MgSO4·7H2O：0.4-0.6g；琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O：1.17-1.19g；FeSO4·7H2O：0.0314-0.0316g；CaCl2·2H2O：0.09-0.11g；MnSO4·H2O：0.034-0.036g；CH3COONa·3H2O：0.407-0.409g；CoCl2·6H2O：0.05-0.07g；ZnSO4·7H2O：0.027-0.029g；CuSO4·5H2O：0.167-0.169g；小麦麸皮7-8克；玉米粉：24-26g；Tween-80：0.9-1.1ml；VitaminB1：9.5-10.5μg；VitaminB2：4.5-5.5μg；VitaminB6：4.5-5.5μg，其余为水。
7.根据权利要求2-6任一所述的应用，其特征在于：所述发酵培养第3-5天向发酵培养基中加入2，5-二甲基苯胺，所述2，5-二甲基苯胺的终浓度为10μM。
8.一种漆酶，是发酵培养血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC№ 2932得到的。
9.权利要求1所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的应用，在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应用，在木材加工替代化学胶合剂中的应用，在燃料降解中的应用或在土壤修复中的应用。
10.权利要求8所述漆酶在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的应用，在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应用，在木材加工替代化学胶合剂中的应用，在燃料降解中的应用或在土壤修复中的应用。
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