CN112852637B - 血红密孔菌wys377及其在生产漆酶中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了血红密孔菌WYS377及其在生产漆酶中的应用。本发明公开的血红密孔菌WYS377，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18573。本发明的血红密孔菌WYS377具有如下特点：漆酶产量高；所产漆酶的耐高温；所产漆酶具有较高的热稳定性，其在60℃条件下的半衰期高达15.63h；所产漆酶的pH好。本发明的血红密孔菌WYS377对于解决耐热和耐酸碱漆酶资源不足的问题作出了重要贡献，并丰富了白腐菌漆酶资源的宝库，为白腐菌漆酶资源的挖掘和推广应用奠定了基础。

Description

血红密孔菌WYS377及其在生产漆酶中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，血红密孔菌WYS377及其在生产漆酶中的应用。
背景技术
血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)，别名血红拴菌，是属于担子菌门，担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，密孔菌属的一类白腐真菌。其在我国广泛分布，比如在云南、海南、广西、江西、福建等地均有分布，是一类重要的木材腐朽菌。目前已知白腐菌是自然界中对木质素具有最强降解能力的真菌类群，这些菌株能够产生包括漆酶在内的多种木质素降解酶系来降解生物质中的木质纤维素组分，其产生的漆酶具有较强的热稳定性和pH广泛性。
漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，最早是在1883年日本学者从漆树中分离得到，其在植物、昆虫、细菌、真菌等生物类群中均有存在，但目前研究较为广泛的主要以白腐真菌为主。漆酶可以氧化多种酚类化合物，其催化氧化呈现高度的底物非专一性，对许多结构不同、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力。据统计，漆酶可催化酚类、芳胺类、芳香族羧酸类等多达200多种底物的氧化，并且在适宜的氧化还原介质存在的情况下，其还可以氧化非酚型的木质素亚基等物质。
在实际生产应用中，漆酶作为一种绿色环保型的生物催化剂具有高效率、低能耗的优点被广泛应用于废水处理、染料降解、纸浆漂白以及农作物秸秆的脱木质素预处理等方面。然而，目前大多数漆酶的反应需要在较温和的条件下进行以维持其正常的生理活性，而在实际应用的极端环境条件下，酶的耐受性却很差，从而导致催化效率不高，极大地限制了漆酶的推广和应用。因此开发一种高热稳定性和高酸碱稳定性的漆酶高产菌株是提升漆酶广泛应用的前提，具有十分重要的应用价值。
宋自力(2019)等报道了利用白腐菌产漆酶发酵培养基对30株血红密孔菌Pycnoporus sanguineus菌株进行筛选，得到了多株漆酶高产菌株，并且产量较高的两株菌对烟梗木质素表现出了较强的生物降解能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种生产具有高热稳定性和pH稳定性漆酶的菌株。
本发明提供的菌株为血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18573。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)WYS377。
上述菌剂中，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
本发明还提供了漆酶的制备方法，所述方法包括：培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377，收集发酵液即得到含有漆酶的酶液。
上述方法中，收集发酵液可包括收集所述发酵液的非菌体部分。
上述方法中，培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377所用培养基为产酶发酵培养基，所述产酶发酵培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述产酶发酵培养基中的浓度分别为：十二水合磷酸二氢钠0.39g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.0315g/L，二水合氯化钙0.1g/L，一水合硫酸锰0.035g/L，三水合乙酸钠0.408g/L，五水合硫酸铜0.168g/L，七水合硫酸锌0.028g/L，六水合氯化钴0.06g/L，酒石酸铵3g/L，琥珀酸钠1.18g/L，吐温80 1mL/L，维生素B1 10μg/L，维生素B2 5μg/L，维生素B6 5μg/L，玉米粉(即玉米面)40g/L。
上述方法还包括向培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377的发酵体系中添加2,5-二甲基苯胺。
所述2,5-二甲基苯胺在所述发酵体系中的浓度可为10μM。
所述2,5-二甲基苯胺的添加在所述培养的第3-5天(如第4天)进行。
所述培养的时间可为8-10天。
上述方法中，培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377的温度可为28-30℃。
培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377的温度可为28℃或30℃。
上述方法中，培养所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377可在黑暗下进行。
本发明还提供了利用所述漆酶的制备方法得到的漆酶。
本发明还提供了所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377、所述菌剂或所述漆酶的下述任一应用：
A1)在生产漆酶中的应用；
A2)在制备生产漆酶产品中的应用；
A3)在废水处理、染料降解、纸浆漂白或农作物秸秆的脱木质素预处理中的应用；
A4)在催化酚、芳胺、芳香族羧酸或非酚型的木质素亚基氧化中的应用；
A5)在降解生物质中的木质纤维素组分中的应用。
本发明还提供了一种提高所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377所产漆酶热稳定性、酸稳定性或碱稳定性的方法，所述方法包括：向所述漆酶中添加稳定剂实现所述漆酶热稳定性、酸稳定性或碱稳定性的提高；
提高所述漆酶热稳定性所用稳定剂可为甘露醇、聚乙二醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、壳聚糖、糊精、果胶、麦芽糖、硫酸铜、硫酸亚铁、牛血清白蛋白、酪蛋白或明胶。
提高所述漆酶酸稳定性所用稳定剂可为甘露醇、聚乙二醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、糊精、果胶、麦芽糖、磷酸氢二钠、牛血清白蛋白或酪蛋白。
提高所述漆酶碱稳定性所用稳定剂可为甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、糊精、麦芽糖、氯化钙、硫酸铜或硫酸亚铁。
上述方法中，所述热稳定性可为75℃下的热稳定性。
上述方法中，所述酸稳定性可为pH2下的酸稳定性。
上述方法中，所述热碱定性可为pH12下的碱稳定性。
本发明的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377具有如下特点：漆酶产量高；所产漆酶的耐高温，其最适反应温度为60℃，在20℃-90℃的温度范围内，所产漆酶的相对漆酶活性能够保持在70％以上；所产漆酶具有较高的热稳定性，在30℃到60℃的温度下处理后，其漆酶活性保留在75％以上，其在60℃条件下的半衰期高达15.63h；所产漆酶的pH好，最适反应pH为2，在pH2-5的反应范围内，漆酶活性能够保持在50％以上，并且利用pH4-9的BR缓冲液处理后的酶活仍能够保持85％以上；所产生的漆酶与底物的结合能力高，米氏常数K1m为0.0345mmol/L。本发明对于解决耐热和耐酸碱漆酶资源不足的问题作出了重要贡献，丰富了白腐菌漆酶资源的宝库，为白腐菌漆酶资源的挖掘和推广应用奠定了基础。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)
生物材料的菌株编号：WYS377
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年9月16日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18573
附图说明
图1为WYS 377菌株的形态特征。
图2为WYS 377菌株ITS-5.8SrDNA邻接树。
图3为WYS 377菌株与MK 2001菌株和H275菌株所产漆酶动力学参数Km的比较。
图4为稳定剂对血红密孔菌WYS 377所产漆酶热稳定性的影响。
图5为稳定剂对血红密孔菌WYS 377所产漆酶酸稳定性的影响。
图6为稳定剂对血红密孔菌WYS 377所产漆酶碱稳定性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
产酶发酵培养基为无菌培养基，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为：十二水合磷酸二氢钠0.39g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.0315g/L，二水合氯化钙0.1g/L，一水合硫酸锰0.035g/L，三水合乙酸钠0.408g/L，五水合硫酸铜0.168g/L，七水合硫酸锌0.028g/L，六水合氯化钴0.06g/L，酒石酸铵3g/L，琥珀酸钠1.18g/L，吐温80 1mL/L，维生素B1 10μg/L，维生素B2 5μg/L，维生素B65μg/L，玉米粉(即玉米面)40g/L。
不同pH酒石酸缓冲液的配制：首先分别配制浓度均为100mmol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液；酒石酸溶液为向水中加入酒石酸得到的溶液，酒石酸在溶液中的浓度为100mmol/L；酒石酸钠溶液为向水中加入酒石酸钠得到的溶液，酒石酸钠在溶液中的浓度为100mmol/L；分别采用100mmol/L的酒石酸溶液调节酒石酸钠溶液的pH至2、3、4、5、6，即得到为pH分别为2、3、4、5、6的酒石酸缓冲液。
不同pH的Britton-Robison(BR)缓冲液的配制：首先分别配制浓度均为0.04mol/L的磷酸、硼酸和冰乙酸水溶液，等体积混合均匀后，再用0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节至所需pH，分别得到pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12的Britton-Robison缓冲液。
实施例1：血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)WYS377高产漆酶菌株的分离与鉴定
1、菌种采集及分离：发明人李伟于2006年10月在福建省武夷山国家自然保护区采集的腐朽木材样本中通过PDA培养基分离纯化得到一株菌，将该菌株记为WYS377菌株。
2、菌株的形态鉴定：将上述获得的WYS377菌株接种于PDA培养基上，30℃培养4-6天左右可铺满90mm培养皿，8天左右时开始有红色素积累。菌丝起初为白色绒毛状，边缘呈放射状，菌落中心具有明显的同心圆结构，随着培养天数的增加，这些菌丝上会被一层白色粉状的物质覆盖，经显微观察分析此白色粉状物质为菌丝断裂形成的节孢子，呈椭圆形，光滑，大小为4-5μm×2-3μm；WYS377菌株的生殖菌丝无隔，透明，壁薄，具有锁状联合结构。而其骨架菌丝较细，具有分支结构。结果见图1。
根据菌落形态特征，查阅《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》，与《中国大型真菌》中的各种真菌的形态特征相比较，WYS377菌株为密孔菌属真菌。
3、菌株的分子生物学鉴定：通过真菌通用引物ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS5(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)扩增该WYS377菌株的5.8SrDNA。将扩增到的DNA片段测序，其序列为序列表中序列1，序列长度为660bp。将序列1在NCBI中通过BLAST比对，发现序列1与P.sanguineus(FJ810182.1)有97％的相似度。根据BLAST结果，取相似度较高的菌株的5.8SrDNA序列构建N-J树，其中以裂褶菌作为外群。根据聚类分析结果(图2)可知，WYS377菌株与P.sanguineus聚在同一分支上，二者相似度高达99％，所以WYS377菌株与血红密孔菌(P.sanguineus)的亲缘关系要高于栓菌属真菌，进而将WYS377菌株鉴定为血红密孔菌(P.sanguineus)，故WYS377菌株也可称为血红密孔菌WYS377。
血红密孔菌WYS377已于2019年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18573。
实施例2：血红密孔菌WYS377的产酶特性
血红密孔菌WYS377是一种需氧菌，生长温度为28-30℃，发酵时能够分泌包括漆酶在内的多种物质到培养基中，本实施例检测了血红密孔菌WYS377的产漆酶特性，并以文献“宋自力等，血红密孔菌高产漆酶菌株的筛选及其对烟梗的生物降解，菌物学报，2019年3月22日，38(3):381-392”中的血红密孔菌H275、XYG375、G53、XYG205、G119、H2089、G117、XYG232和YF413作为对照菌株。检测步骤如下：
1、产酶发酵：将实施例1的血红密孔菌WYS377接种于PDA培养基上，30℃培养4天，用无菌打孔器将生长有菌的培养基制成直径为1cm的菌饼，取8块菌饼置于100mL产酶发酵培养基中，然后于28℃、180r/min下黑暗培养10天，在培养第4天时加入诱导剂2,5-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺在培养体系中的浓度为10μM，培养结束后5000r/min离心20min，收集上清液，所得上清液即为WYS377漆酶粗酶液。实验设置3个重复。
按照上述方法，将血红密孔菌WYS377分别替换为各对照菌株，分别得到各对照菌株的漆酶粗酶液，接种于PDA培养基时对照菌株与血红密孔菌WYS377的接种量相等。
2、漆酶活性测定：通过ABTS(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))法测定漆酶粗酶液中漆酶活性。1mL反应体系：0.5mL pH4的酒石酸缓冲液，0.39mL蒸馏水，10μL漆酶粗酶液和100μL 100mmol/L的ABTS水溶液，每个反应体系一种漆酶粗提液。将所得反应体系于30℃反应1min，测定其在420nm波长处的吸光值，每个酶活力为在当前反应条件下每1min氧化1μmol的底物ABTS所需的酶量。根据吸光值的变化计算漆酶粗酶液的漆酶活性。
结果显示，血红密孔菌WYS377所产的漆酶在上述的条件下活性为286U/mL，均显著高于各对照菌株，结果见表1，表1中差异倍数是指血红密孔菌WYS377酶活与对照菌株酶活的比值。
表1、血红密孔菌WYS377与对照菌株漆酶产量的比较
对照菌株 XYG375 G53 XYG205 G119 H2089 G117 XYG232 YF413
酶活(U/mL) 110.44 114.78 117.67 125.32 138.89 150.67 165.66 165.85
差异倍数 2.59 2.49 2.43 2.28 2.06 1.9 1.73 1.72
实施例3：血红密孔菌WYS377所产漆酶的性质
1、血红密孔菌WYS377所产漆酶的最适反应温度
对实施例2中获得的WYS377漆酶粗酶液进行最适反应温度的测定，并将血红密孔菌MK 2001与血红密孔菌H275的漆酶粗酶液作为对照，其中MK2001菌株为中国专利申请CN200910083514.7中的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC No.2932，血红密孔菌H275记载在文献“宋自力等，血红密孔菌高产漆酶菌株的筛选及其对烟梗的生物降解，菌物学报，2019年3月22日，38(3):381-392”中，血红密孔菌MK2001菌株和H275菌株的漆酶粗酶液按照实施例2的方法制备。实验重复三次。
(1)按照实施例2的方法配制反应体系，每种漆酶粗酶液均配制8个反应体系，将每种漆酶粗酶液的8个反应体系分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的条件下反应1min，反应结束后测定在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶粗酶液的漆酶相对活性，每个酶活力为在当前反应条件下每1min氧化1μM的底物ABTS所需的酶量。
结果发现，WYS377漆酶粗酶液的最适反应温度为60℃，其酶活为378.76U/mL，以此时的漆酶活性记为100％，再分别计算其他温度条件下的相对漆酶活性，结果发现在20℃-90℃的温度范围内，血红密孔菌WYS377的相对漆酶活性能够保持在70％以上(表2)。
(2)对于已报道的MK 2001菌株所产的漆酶来说，其在同样的条件下最适反应温度为60℃，60℃下的酶活为414.92U/mL，将此时的酶活定为100％，其余各温度下的相对漆酶活性见表2，在20℃-90℃的温度范围内的相对酶活均小于WYS377。并且MK2001漆酶粗酶液在20℃、80℃和90℃时的活性分别为211.57U/mL、354.26U/mL和286.5U/mL，比WYS377漆酶粗酶液在同等温度条件下的活性分别下降了59.02U/mL、5.49U/mL和56.77U/mL。
(3)对于H275菌株所产的漆酶，其在同样的条件下最适反应温度也为60℃，60℃下的酶活为452.73U/mL，将此时的酶活定为100％，其余各温度下的相对漆酶活性见表2，在20℃-90℃的温度范围内的相对酶活均小于WYS377。并且H275漆酶粗酶液在20℃和90℃时的活性分别为232.52U/mL和309.35U/mL，比WYS377漆酶粗酶液在同等温度条件下的活性分别下降了38.07U/mL和33.92U/mL。
(4)由表2可知，WYS377菌株与MK2001和H275菌株所产漆酶的最适反应温度均为60℃，虽在60℃时三者之间酶活相差较大,但当反应温度高于60℃或低于60℃时，WYS377菌株粗酶液的相对酶活均高于另外两株对照菌株，尤其是当反应温度为20℃和90℃时，无论是相对酶活还是绝对酶活，WYS377菌株漆酶粗酶液都要显著高于另外两株对照菌株，从而表明了WYS377菌株所产的漆酶具有更好的热稳定性，更适用于在不同的反应温度下对生物质进行降解。
表2、各菌株的漆酶粗提液在不同反应温度下的相对漆酶活性
反应温度(℃) 20 30 40 50 60 70 80 90
MK2001(％) 50.99 71.34 79.71 87.73 100 93.31 85.38 69.05
WYS377(％) 71.44 75.51 85.01 93.14 100 96.56 94.98 90.63
H275(％) 51.36 70.02 79.69 88.25 100 94.11 84.17 68.33
2、血红密孔菌WYS377所产漆酶的最适反应pH
对实施例2中获得的WYS377漆酶粗酶液进行最适反应pH的测定，并将血红密孔菌MK 2001与H275的漆酶粗酶液作为对照，实验重复三次。
(1)按照实施例2的方法，将pH4的酒石酸缓冲液分别替换为pH2、pH3、pH4、pH5、pH6的酒石酸缓冲液，其余均不变，得到不同pH的反应体系。将所得WYS377与MK2001和H275菌株漆酶粗酶液的反应体系于60℃反应1min，然后测定各反应体系在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶粗酶液的漆酶活性，每个酶活力为在当前反应条件下每1min氧化1μM的底物ABTS所需的酶量。
结果发现，WYS377漆酶粗酶液的最适反应pH为2，其酶活为460.49U/mL，以此时的漆酶活性记为100％，再分别计算其他pH条件下的相对漆酶活性，结果发现在pH2-5的反应范围内，WYS377漆酶粗酶液的酶活性能够保持在50％以上(表3)。
(2)对于已报道的MK 2001菌株来说，其最适反应pH也是2，最适反应pH下的酶活为509.65U/mL，将此时的酶活定为100％，其余各pH下的相对漆酶活性见表3。MK 2001菌株的漆酶粗酶液在ph2-6的条件下的相对酶活均小于WYS377，尤其是在pH5时的绝对酶活为151.39U/mL，比WYS377在pH5时的酶活下降了43.94U/mL，从而表明WYS377菌株漆酶粗酶液比MK2001菌株适用的pH范围更广。(3)对于H275菌株来说，其最适反应pH也是2，最适反应pH下的酶活为549.24U/mL，将此时的酶活定为100％，其余各pH下的相对漆酶活性见表3。H275菌株的漆酶粗酶液在ph2-6的条件下的相对酶活均小于WYS377，而且H275在pH5时的绝对活性为159.84U/mL，比WYS377在同等pH条件下的活性下降了35.49U/mL，表明WYS377菌株漆酶粗酶液在pH2-5的范围内更稳定，适用范围更广。
表3、各菌株的漆酶粗提液在不同反应pH下的相对漆酶活性
反应pH 2 3 4 5 6
MK 2001(％) 100 91 80.52 36.89 1.55
WYS377(％) 100 95.6 82.54 51.39 1.89
H275(％) 100 90.09 81.77 35.59 1.33
3、血红密孔菌WYS377所产漆酶的热稳定性
检测实施例2中获得的WYS377漆酶粗酶液的热稳定性，并将血红密孔菌H275与MK2001的漆酶粗酶液作为对照。实验重复三次。
(1)首先将WYS377漆酶粗酶液分别放置于30℃、45℃、60℃、75℃、90℃条件下孵育1h、2h、3h、4h、5h、6h后，每种温度下均有六种不同孵育时间，孵育结束后按照实施例2的方法配制反应体系，将所得反应体系在30℃下反应1min后，测定在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶酶活，每个酶活力为在当前反应条件下每1min氧化1μmol的底物ABTS所需的酶量。
将未经处理的WYS377漆酶粗酶液作为对照，并将对照的酶活记为100％(对照酶活为286U/mL))，计算不同孵育温度和时间下的相对漆酶活性(表4)。
结果发现，WYS377菌株的漆酶粗酶液具有很好的热稳定性，尤其是在30℃到60℃的温度范围内，其活性保留在75％以上，其在60℃条件下的半衰期高达15.63h(半衰期是指酶促反应速率达到最大反应速率一半时所用的时间，用T表示，反应时间用t表示，反应前的酶活用V表示，反应后的酶活用v表示，这几个指标间的关系为v＝V(1/2)t/T)。
(2)按照上述方法，将WYS377漆酶粗酶液替换为血红密孔菌MK 2001的漆酶粗酶液，其他步骤均不变，得到MK 2001的漆酶粗酶液不同孵育温度和时间后的相对于未处理的粗酶液的相对漆酶活性，未处理的粗酶液的酶活为296U/mL，结果见表5。MK 2001的漆酶粗酶液在60℃条件下的半衰期只有0.82h，比血红密孔菌WYS377在60℃条件下的半衰期低了19.1倍。
(3)按照上述方法，将WYS 377漆酶粗酶液替换为血红密孔菌H275的漆酶粗酶液，其他步骤均不变，得到H275的漆酶粗酶液不同孵育温度和时间后的相对于未处理的粗酶液的相对漆酶活性，未处理的粗酶液的酶活为317U/mL。结果见表6，H275在30℃和45℃的温度范围内，活性相对比较稳定；但当温度高于60℃时，其活性下降较快，此温度下的半衰期只有0.83h,比血红密孔菌WYS377在60℃条件下的半衰期低了18.83倍。因此WYS377菌株产生的漆酶粗酶液具有非常好的热稳定性，更适合于在不同的温度条件下实现大规模的广泛应用。
表4、血红密孔菌WYS377的漆酶粗提液不同温度下孵育不同时间后的相对漆酶活性
孵育时间(h) 0 1 2 3 4 5 6
30℃ 100 97.42 96.16 94.32 93.65 93.47 92.72
45℃ 100 93.77 92.24 90.86 88.9 88.21 87.44
60℃ 100 83.48 80.5 80.34 78.08 77.33 76.64
75℃ 100 63.81 48.45 34.03 16.74 10.31 6.75
90℃ 100 0 0 0 0 0 0
表5、血红密孔菌MK 2001的漆酶粗提液不同温度下孵育不同时间后的相对漆酶活性
孵育时间(h) 0 1 2 3 4 5 6
30℃ 100 84.30 82.73 81.81 81.68 81.54 80.43
45℃ 100 79.04 78.10 76.61 76.24 75.60 74.50
60℃ 100 42.89 18.99 11 2.66 2.41 2.29
75℃ 100 1.33 1.07 0.92 0.23 0.16 0.14
90℃ 100 0 0 0 0 0 0
表6、血红密孔菌H275的漆酶粗提液不同温度下孵育不同时间后的相对漆酶活性
孵育时间(h) 0 1 2 3 4 5 6
30℃ 100 85.19 80.33 79.97 79.06 77.89 77.31
45℃ 100 81.32 79.44 78.18 78.07 77.51 76.93
60℃ 100 43.17 20.32 10.89 2.91 2.17 1.99
75℃ 100 1.55 1.01 0.78 0.13 0 0
90℃ 100 0 0 0 0 0 0
4、血红密孔菌WYS377所产漆酶的pH稳定性
检测实施例2中获得的WYS377漆酶粗酶液的pH稳定性，并将血红密孔菌H275与MK2001的漆酶粗酶液作为对照。实验重复三次。
(1)首先分别配制pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12的Britton-Robison缓冲液，然后将WYS377漆酶粗酶液取100μL加入到900μL的上述pH的Britton-Robison缓冲液中，在30℃条件下孵育12h，孵育结束后，得到各待测酶液。按照如下方法配制反应体系：
1mL反应体系：0.5mL pH4的酒石酸缓冲液，0.39mL蒸馏水，10μL待测酶液和100μL100mmol/L的ABTS水溶液，每个反应体系一种待测酶液。将所得反应体系在30℃下反应1min后，测定在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶相对酶活，每个酶活力为在当前反应条件下每1min氧化1μM的底物ABTS所需的酶量。
将孵育结束后最高的活性作为对照记为100％，此时的酶活为226U/mL，再分别计算其余处理的WYS377漆酶粗酶液在不同pH下孵育后的相对漆酶活性(表7)。
(2)按照上述方法，将WYS377漆酶粗酶液替换为血红密孔菌MK 2001的漆酶粗酶液，其他步骤均不变，将孵育结束后最高的活性作为对照记为100％，此时的酶活为179.66U/mL，再分别计算其余处理的MK2001漆酶粗酶液在不同pH下孵育后的相对漆酶活性(表7)。
(3)按照上述方法，将WYS377漆酶粗酶液替换为血红密孔菌H275的漆酶粗酶液，其他步骤均不变，将孵育结束后最高的活性作为对照记为100％，此时的酶活为174.35U/mL，再分别计算其余处理的H275漆酶粗酶液在不同pH下孵育后的相对漆酶活性(表7)。
结果发现，WYS377与对照菌株MK2001和H275的漆酶粗酶液均是在pH6的条件下孵育后的酶活最高，但是WYS377漆酶粗酶液在pH4-9的范围内能够保持85％以上的活性，并且在不同的pH条件下孵育后的相对和绝对漆酶活性都要高于已报道的MK 2001和H275菌株，从而表明WYS377菌株的漆酶粗酶液更加具有宽广的pH适用性。
表7、不同菌株的漆酶粗提液在不同pH条件下孵育后的漆酶相对漆酶活性
孵育pH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
MK2001(％) 53.33 69.03 83.05 88.89 100 91.94 88.89 84.44 74.58 61.67 45.55
WYS377(％) 60.34 73.32 86.93 89.93 100 95.59 91.69 89.23 84.99 81.1 71.64
H275(％) 50.77 67.66 82.17 87.93 100 90.39 87.66 81.89 70.57 57.79 40.02
5、血红密孔菌WYS377所产漆酶的动力学参数Km
米氏常数Km是酶的重要动力学参数之一，其大小与酶的性质有关。首先分别配制浓度为1/100mmol/L、1/80mmol/L、1/60mmol/L、1/40mmol/L、1/20mmol/L的ABTS水溶液，按照实施例2的方法将“100mmol/L的ABTS水溶液”分别替换为浓度为1/100mmol/L、1/80mmol/L、1/60mmol/L、1/40mmol/L、1/20mmol/L的ABTS水溶液配制反应体系，将所得反应体系在30℃下反应1min后，测定在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶相对酶活，每个酶活力为在当前反应条件下每1min氧化1μM的底物ABTS所需的酶量。所用酶液为WYS377漆酶粗酶液，并将血红密孔菌MK 2001与H275的漆酶粗酶液作为对照。
通过双倒数作图分别画出WYS377菌株、MK 2001菌株与H275菌株所产生的漆酶的反应速度与底物浓度的关系，WYS377菌株产生的漆酶的米氏常数K1m为0.0345mmol/L；MK2001菌株产生的漆酶的米氏常数K2m为0.04mmol/L，H275菌株产生的漆酶的米氏常数K3m为0.0385mmol/L。经过分析比较K1m要显著小于K2m与K3m，表明WYS377菌株所产生的漆酶与底物的结合能力要显著高于MK 2001菌株与H275菌株所产生的漆酶。结果见图3。
实施例4：稳定剂对血红密孔菌WYS377所产漆酶稳定性的影响
1、稳定剂对血红密孔菌WYS377所产漆酶热稳定性的影响
由上述漆酶热稳定性的研究可知，血红密孔菌WYS377所产漆酶在75℃条件下的半衰期为1.91h，虽然已经显著高于同属的其他菌株，但要想达到在高温条件下的稳定应用，还需要进一步的提高其在高温条件下的稳定性。发明人选用了24种稳定剂来改善漆酶的热稳定性，所用稳定剂涵盖了醇类、糖类、金属离子类、蛋白类等类型的稳定剂，所用稳定剂具体为甘露醇、聚乙二醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、壳聚糖、糊精、果胶、麦芽糖、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、硝酸钠、磷酸氢二钠、氯化钠、硫酸铜、硫酸亚铁、牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、黄原胶，依次编号为1-24，1-4号为醇类化合物，5-12号为糖类化合物，13-20号为金属离子类化合物，21-24号为蛋白类化合物。
首先分别取1mL的实施例2中获得的WYS377漆酶粗酶液24份，按量加入相应的24种稳定剂，添加稳定剂后混合均匀，然后在75℃条件下孵育5h后作为待测酶液，测定漆酶活性。稳定剂的添加量分别为：醇类化合物20mg/mL、糖类化合物30mg/mL、金属离子类化合物15mmol/L、蛋白类化合物5mg/mL。
1mL反应体系：0.5mL pH4的酒石酸缓冲液，0.39mL蒸馏水，10μL待测酶液和100μL100mmol/L的ABTS水溶液，每个反应体系一种待测酶液。将所得各反应体系于30℃反应1min，测定其在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶相对酶活。每种稳定剂均设置三个重复。
利用未添加稳定剂的WYS377漆酶粗酶液作为对照(CK)，对照酶活为30.497U/mL，将对照酶活定为100％，计算添加各稳定剂后的相对漆酶活性，添加1-24号稳定剂后的相对漆酶活性依次为136.850％、110.930％、129.153％、169.640％、221.470％、487.857％、280.167％、127.547％、114.590％、146.567％、648.593％、217.403％、31.980％、28.740％、68.420％、42.110％、27.930％、42.110％、273.693％、785.443％、195.553％、455.063％、165.193％、86.240％。见图4。
结果发现，4种醇类均能改善漆酶的热稳定性，其中以4号醇类的改善作用最为明显，将漆酶活性提高了1.7倍；8种糖类中以5、6、7、11、12号糖类的改善作用最为明显，分别将漆酶活性提高了2.2倍、4.9倍、2.8倍、6.49倍、2.17倍；8种金属离子中有6种离子均对活性有一定的抑制作用，而19和20号离子有较强的改善作用，分别将漆酶活性提高了2.7倍和7.9倍；4种蛋白类中21号、22号和23号对漆酶活性有一定的改善作用，其中以22号的改善作用最为明显，将漆酶活性提高了4.6倍。
2、稳定剂对血红密孔菌WYS377所产漆酶酸稳定性的影响
由上述漆酶pH稳定性的研究可知，血红密孔菌WYS377所产漆酶在酸性条件下的活性下降很快，在pH2条件下孵育12h的相对漆酶活性只有60.34％，虽然已经高于同属的其他菌株，但要想达到其在酸性条件下的广泛应用，还需要进一步的提高其在强酸条件下的稳定性。所以同样的选择上述24种稳定剂来改善漆酶在酸性条件下的稳定性。
向实施例2中获得的WYS377漆酶粗酶液按酶液与BR缓冲液的体积比为1:9的量加入pH2的BR缓冲液混匀之后分别加入上述稳定剂，混合均匀后在30℃条件下孵育12h后作为待测酶液测定漆酶活性。稳定剂的添加量分别为：醇类化合物20mg/mL、糖类化合物30mg/mL、金属离子类化合物15mmol/L、蛋白类化合物5mg/mL。
1mL反应体系：0.5mL pH4的酒石酸缓冲液，0.39mL蒸馏水，10μL待测酶液和100μL100mmol/L的ABTS水溶液，每个反应体系一种待测酶液。将所得各反应体系于30℃反应1min，测定其在420nm波长处的吸光值，根据吸光值的变化计算漆酶相对酶活。每种稳定剂均设置三个重复。
利用未添加稳定剂的WYS377漆酶粗酶液作为对照(CK)，对照酶活为136.37U/mL，将对照酶活定为100％，计算添加各稳定剂后的相对漆酶活性，添加1-24号稳定剂后的相对漆酶活性依次为103.11％、117.593％、117.727％、115.187％、117.593％、110％、107.26％、112.073％、55.19％、124.48％、118.63％、121.037％、74.15％、73.11％、57.26％、88.63％、114.147％、64.15％、94.48％、22.41％、122.777％、106.223％、98.63％、94.15％，见图5。
结果发现醇类和糖类稳定剂在酸性条件下对漆酶活性的改善较弱；而在金属离子类中，只有17号稳定剂对漆酶活性有所改善；在蛋白类的稳定剂中，只有21号、22号有改善，尤其是21号的改善作用最为明显。
3、稳定剂对血红密孔菌WYS377所产漆酶碱稳定性的影响
漆酶在碱性条件下的稳定性同样是一个不容忽视的重要内容，由上述漆酶pH稳定性的研究可知，血红密孔菌WYS377所产漆酶在pH12时孵育12h的相对漆酶活性为71.64％，但在pH12的条件下孵育24h后的相对漆酶活性只有16.84％。所以选择不同的稳定剂来改善漆酶在碱性条件下的稳定性至关重要。
按照步骤2的方法，将pH2的BR缓冲液替换为pH12的BR缓冲液，其他均不变，检测各稳定剂对血红密孔菌WYS377所产漆酶碱稳定性的影响。
同样，利用未添加稳定剂的WYS377漆酶粗酶液作为对照(CK)，对照酶活为161.91U/mL，将对照酶活定为100％，计算添加各稳定剂后的相对漆酶活性，添加1-24号稳定剂后的相对漆酶活性依次为118.39％、80.9％、124.52％、128.293％、119.813％、94.36％、32.55％、41.03％、37.74％、109.42％、82.07％、119.813％、80.42％、105.877％、19.13％、18.16％、21.46％、17.22％、105.42％、127.357％、29％、68.39％、24.06％、70.04％，见图6。
结果发现，在4种醇类稳定剂中，改善作用最为明显的是4号；在8种糖类中5、10、12号均有较强的改善；在8种离子类中14、19、20号均有改善，其中改善最为明显的是20号；在4种蛋白类中稳定剂均对漆酶粗酶液在碱性环境中的活性有抑制作用。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 血红密孔菌WYS377及其在生产漆酶中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 660
<212> DNA
<213> 血红密孔菌（P. sanguineus）
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc ttaagttctg cgggtagtcc tacctgattt gaggtcagat 60
gtcaagaggt tgtcccatac aggacggtta gaagctcgcc aaacgcttca cggtcacagc 120
gtagacaatt atcacactga gagccgatcc gcacggaatc aagctaatgc attcaagagg 180
agccgaccga cgagggccag caagcctcca agtccaagcc cacagcatca caaggacgtg 240
tgggttgaga attccatgac actcaaacag gcatgctcct cggaatacca aggagcgcaa 300
ggtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacattact tatcgcattt 360
cgctgcgttc ttcatcgatg cgagagccaa gagatccgtt gctgaaagtt gtatttagat 420
gcgttagacg ctaatacatt ctgttacttt atgtgtttgt agtgatacat aggccggcag 480
aatgcctcaa agacccggag gccccgaagc ccacgccaaa cctacagtaa gtgcacaggt 540
gtagagtgga tgagcagggt gtgcacatgc cccggaaggc cagctacaac ccctttcaga 600
actcgttaat gatccttccg caggttcacc tacggaaacc ttgttacgac ttttacttcc 660

Claims (9)

1.血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18573。
2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377。
3.漆酶的制备方法，包括：培养权利要求1所述的血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377，收集发酵液即得到含有漆酶的酶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：培养所述血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377所用培养基为产酶发酵培养基，所述产酶发酵培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述产酶发酵培养基中的浓度分别为：十二水合磷酸二氢钠0.39g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.0315g/L，二水合氯化钙0.1g/L，一水合硫酸锰0.035g/L，三水合乙酸钠 0.408g/L，五水合硫酸铜0.168g/L，七水合硫酸锌0.028g/L，六水合氯化钴0.06g/L，酒石酸铵3g/L，琥珀酸钠1.18g/L，吐温80 1mL/L，维生素B1 10μg/L，维生素B2 5μg/L，维生素B6 5μg/L，玉米粉40 g/L。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括向培养权利要求1所述的血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377的发酵体系中添加2,5-二甲基苯胺。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：培养所述血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377在黑暗下进行。
7.利用权利要求3-6中任一所述的方法得到的漆酶。
8.权利要求1所述的血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377、权利要求2所述的菌剂或权利要求7所述的漆酶的下述任一应用：
A1）在生产漆酶中的应用；
A2）在制备生产漆酶产品中的应用；
A3）在废水处理、染料降解、纸浆漂白或农作物秸秆的脱木质素预处理中的应用；
A4）在降解生物质中的木质纤维素组分中的应用。
9.一种提高权利要求1所述的血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus)WYS377所产漆酶热稳定性、酸稳定性或碱稳定性的方法，包括：向所述漆酶中添加稳定剂实现所述漆酶热稳定性、酸稳定性或碱稳定性的提高；
提高所述漆酶热稳定性所用稳定剂为甘露醇、聚乙二醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、壳聚糖、糊精、果胶、麦芽糖、硫酸铜、硫酸亚铁、牛血清白蛋白、酪蛋白或明胶；
提高所述漆酶酸稳定性所用稳定剂为甘露醇、聚乙二醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、糊精、果胶、麦芽糖、磷酸氢二钠、牛血清白蛋白或酪蛋白；
提高所述漆酶碱稳定性所用稳定剂为甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、糊精、麦芽糖、氯化钙、硫酸铜或硫酸亚铁。
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