CN104611235A - 生产漆酶的菌株、利用菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶及其应用 - Google Patents
生产漆酶的菌株、利用菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公共了一株生产漆酶的菌株、利用该菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶以及应用，涉及微生物酶学领域。本发明生产漆酶的菌株为绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)，微生物保藏编号为CGMCC No.10308。利用本发明的菌株绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)生产的漆酶产量较高，酶活力可达到28.687U/mL，制备的漆酶对碱性条件(pH 7.0-10.0)具有较高的活性、稳定性和耐受性，对金属离子的耐受力也较高，在一定程度上能够缩短偶氮染料刚果红完全脱色所需的时间，具有潜在的应用价值，可被应用于较多工业领域，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物酶学领域，特别涉及一种生产漆酶的菌株、以及利用该菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶。
背景技术
近年来，染料由于价格低廉、对光照、温度和去污剂等稳定性强且颜色多样，已被广泛应用于纺织品与着色剂制造工业等。随着纺织工业的迅速发展，染料的品种和数量不断增加，印染行业已经成为我国自然水体最大的水资源消耗者和污染源之一。我国染料废水每年排放6.5×108吨左右，大量废水的排放又造成其他自然水体和土地的污染。数据显示，每排放1吨印染废水就会造成20吨自然水体的污染。此外，染料废水具有组成复杂、有机物含量高、水量和水质变化大、碱度高、色度深、可生化性差、难降解和浓度高等特点，而且其中的硝基、氨基化合物及铜、铬、锌、砷等重金属元素均具有较大的生物毒性，是难以处理的工业废水之一，会对环境造成极大的污染，破坏生态平衡，威胁人类健康。因此，寻找一种高效、低廉、不产生二次污染的处理方法对于减轻染料废水的危害十分必要。
近年来，随着人们环保意识的增强，白腐真菌胞外酶在污水治理方面的作用显得极为重要，成为酶工程与环境保护交叉领域研究的热点。大量研究证明，白腐真菌胞外酶不仅能够降解大量异生芳香化合物及其衍生物，还能去除复杂的木质素聚合物，因此这些胞外酶的生物催化作用在环保领域具有巨大的潜在应用价值。其中，漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜蛋白家族，广泛分布于植物、真菌、昆虫和细菌中。这类蛋白质具有四个富含组氨酸的铜原子结合区域，由于环境及光谱性质的不同而分为I-III型。漆酶可通过电子转移催化氧化一系列底物，例如单、双及多酚、芳香胺、甲氧基酚和抗坏血酸盐等化合物，这一氧化过程与氧分子还原成水分子相耦合。此外，漆酶的作用底物广泛且具一定的底物特异性，能够被应用于染料脱色、纸浆造纸、食品加工、化妆品制作、生物修复、生物检测、生物燃料和有机物合成等多个工业领域。目前为止，已从微生物中分离得到了100多种漆酶，但多数漆酶的活力及其产量较低且对极端环境的耐受力也较弱，这些均阻碍了他们被大规模商业化应用。因此，开发性质优良的酶蛋白，扩展其应用范围，具有十分重要的工业价值。
绒毛栓孔菌(Trametes pubescens)作为一种常见的白腐真菌，是重要的生物资源，目前研究已发现其产漆酶活力较高，且对染料也有较好的脱色效果。本发明中通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析和琼脂糖凝胶柱层析分离得到纯化的漆酶蛋白(Tplac)，研究其最适反应pH和温度，探索底物特异性、常见抑制剂和金属离子等对Tplac活性和稳定性的影响，并将其应用于染料脱色中，以期得到性质优良稳定的酶蛋白，为进一步将漆酶应用于更多领域提供可靠的理论依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有利用微生物生产的漆酶、漆酶生产方法存在的技术问题提供一株生产漆酶的菌株、以及利用该菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶。本发明的真菌菌株是从广东省车八岭自然保护区的栲树(Castanopsis fargesii Franch.)倒木上分离筛选获得的，该真菌菌丝生物量高，获得的漆酶活力高、对碱性条件的活性、稳定性和耐受性强；对金属离子的耐受力较高，能够缩短偶氮染料刚果红完全脱色所需的时间，具有潜在的应用价值，可被应用于较多工业领域，具有良好的开发应用前景。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一株生产漆酶的菌株绒毛栓孔菌(Trametespubescens BJFC-C1108)，其微生物保藏编号为CGMCC No.10308。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明生产漆酶的菌株为绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)，其微生物保藏编号为CGMCC No.10308，分类命名是：Trametes pubescens；保藏时间：2015年1月7日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明的绒毛栓孔菌菌株固体及液体培养条件下的形态特征：
固体培养条件下，菌株绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)于28±3℃恒温静置培养7-8天后即可铺满直径为90mm的平皿，长势较快，菌丝致密规则，呈白色绒毛状。培养7天后显微镜下观察发现，生殖菌丝具锁状联合，无色，薄壁，时有分枝，直径1-4μm；骨架菌丝嗜蓝，厚壁，多分枝，直径2-4μm。
液体培养条件下，初期菌丝球表面致密光滑，形态饱满，长势良好，后期其表面呈星芒状，14天后开始出现自溶现象。
本发明的绒毛栓孔菌发酵培养时分泌漆酶到培养基中。
菌株绒毛栓孔菌是从广东省车八岭自然保护区的栲树倒木上采集后通过分离、纯化培养基筛选获得的。
本发明的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)的分离筛选方法：
从广东省车八岭自然保护区的栲树倒木上采集的白腐真菌绒毛栓孔菌，用采集刀将新鲜子实体从基物上小心剥离，去掉与子实体无关的杂质，在超净工作台中切取子实体上靠近基部的菌肉(大小约为3.5cm×3.5cm×3.5cm)接种到分离、纯化平板培养基上，于28±3℃下恒温静置培养7-8天后，挑取培养基中新长出的菌丝作为接种块转接入新的分离、纯化培养基上进行纯化培养，如此反复，直至平板培养基中的菌丝形态致密规则、呈白色绒毛状即视为完成纯化过程。
本发明菌株绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)的分离、筛选、纯化及生产漆酶的培养基如下：
分离、纯化培养基：葡萄糖20.0g/L，麦芽浸粉20.0g/L，琼脂25.0g/L，KH2PO43.0g/L，青霉素0.2g/L，链霉素0.2g/L，去离子水1000mL，pH自然。
固体平板培养基(活化培养基)：葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，琼脂粉20.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 50mg/L，维生素B110mg/L，去离子水1000mL，pH自然。
液体培养基(发酵培养基)：葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 50mg/L，维生素B110mg/L，去离子水1000mL，pH自然。
本发明的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)的培养特性：
本发明的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)是一种白腐真菌，固体培养条件下于28±3℃恒温静置培养7-8天后即可铺满直径为90mm的平皿，长势较快，菌丝致密规则，呈白色绒毛状。培养7天后显微镜下观察发现，生殖菌丝具锁状联合，无色，薄壁，时有分枝，直径1-4μm；骨架菌丝嗜蓝，厚壁，多分枝，直径2-4μm。液体培养条件下，初期菌丝球表面致密光滑，形态饱满，长势良好，后期其表面呈星芒状，14天后开始出现自溶现象。
本发明另一方面提供所述绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)在制备漆酶中的应用。
其中，所述的应用是将所述绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)在有氧及避光条件下发酵培养。
特别是，所述发酵培养的温度为28±3℃；培养过程中振荡速度为100-200rpm，优选为150rpm；培养时间为5-7天，优选为6天。
其中，所述发酵培养的发酵培养基包括碳源、氮源和无机成分。
特别是，所述发酵培养基的碳源选择麦芽糖、蔗糖或葡萄糖，优选为葡萄糖；所述氮源选择酵母浸粉；所述无机成分选择KH2PO4、MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O。
特别是，所述发酵培养基还包括维生素B1。
其中，所述1L发酵培养基由下列物质组成：葡萄糖20.0g，酵母浸粉5.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 50mg，维生素B110mg，其余为去离子水。
特别是，所述发酵培养温度为28±3℃；培养过程中振荡速度为100-200rpm，优选为150rpm；培养时间为5-7天，优选为6天。
发酵培养完成后，可以采用常规分离方法从培养基中分离出漆酶，也可以按照如下步骤分离纯化漆酶：过滤、离心分离、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析、琼脂糖凝胶柱层析。通过这些分离步骤可以去除发酵培养过程中产生的杂蛋白和其他杂质。
发酵培养绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)获得漆酶也属于本发明的保护范围。
本发明又一方面提供所述的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物的降解中的应用；在染料降解中的应用；在纸浆造纸、环境保护、食品加工、化妆品制作、生物修复、生物检测、生物燃料、生物能源、有机物合成、改善纤维性能中的应用。
本发明再一方面提供通过发酵培养绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)获得的漆酶在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物的降解中的应用；在染料降解中的应用；在纸浆造纸、环境保护、食品加工、化妆品制作、生物修复、生物检测、生物燃料、生物能源、有机物合成、改善纤维性能中的应用。
本发明提供的漆酶的生产方法简单、方便，培养条件温和，容易操作，利于控制生产的漆酶的品质；本发明提供的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)经发酵培养而获得的漆酶(Tplac)是一类单体蛋白，分子量为68.0kDa，对碱性条件(pH7.0-10.0)具有较高的活性、稳定性和耐受性；并且酶活力较高，可达到28.687U/mL；本发明提供的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)和经过其发酵培养而获得的漆酶可广泛应用于酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物的降解、还可以应用于染料降解、纸浆造纸、环境保护、食品加工、化妆品制作、生物修复、生物检测、生物燃料、生物能源、有机物合成、改善纤维性能等领域；本发明提供的漆酶对金属离子的耐受力较高，在一定程度上能够缩短偶氮染料刚果红完全脱色所需的时间，具有潜在的应用价值，可被应用于较多工业领域，如染料废水处理等。
附图说明
图1为本发明的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)在固体培养条件下的菌丝形态图；其中，A为于平皿中固体培养的菌丝图；B为图A中部分菌丝的放大图。
图2为本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac经DEAE-cellulose DE52阴离子交换柱层析洗脱的酶活力图。
图3为本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac经Sepharose GL-6B琼脂糖凝胶柱层析洗脱的酶活力图。
图4为通过SDS-PAGE和native PAGE测定本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac的分子量及酶谱性质的电泳图；其中，M为蛋白质分子量Marker；泳道1为粗酶液；2为经硫酸铵分级沉淀纯化的漆酶Tplac；3为经DEAE-cellulose DE52阴离子交换柱层析纯化的漆酶Tplac；4为经Sepharose GL-6B琼脂糖凝胶柱层析纯化的漆酶Tplac；5为由ABTS染色的native PAGE；6为由愈创木酚染色的native PAGE。
图5为本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac的紫外吸收光谱图。
图6为本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac与其他真菌漆酶的多重氨基酸序列比对图；其中，其他真菌漆酶的序列登记号分别为：PDB：2VDZ(Coriolopsis gallica)、EJF60081(Dichomitus squalens)、AAX07469.1(Lentinus tigrinus)、PDB：2QT6(L.tigrinus)、ABN13591.1(Polyporus brumalis)、AAG09231.1(Polyporus ciliatus)、AAW28936.1(Trametes sp.420)、PDB：3KW7(Trametes sp.AH28-2)、PDB：2HRG(Trametes trogii)、CAA77015(Trametes versicolor)、EIW62366(T.versicolor)和AAB47735(Trametesvillosa)。ClustalX1.83和DNAMAN6.0软件用于序列的比对。13条序列中相同的碱基用黑色背景标出；铜原子保守结合区域已用长方形框标出；箭头标出的氨基酸序列区域为潜在的N-糖基化位点；下划线对应的氨基酸序列区域为通过纳米液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)得到的氨基酸序列。
图7为pH对本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性和稳定性的影响图。
图8为温度对本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性和稳定性的影响图。
图9为本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac降解模式染料刚果红的途径示意图。
图10为金属离子对本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac催化偶氮染料刚果红脱色能力的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1培养基
1、分离、纯化培养基
葡萄糖20.0g/L，麦芽浸粉20.0g/L，琼脂25.0g/L，KH2PO43.0g/L，青霉素0.2g/L，链霉素0.2g/L，去离子水1000mL，pH自然，1×105Pa高压灭菌30min，温度降低至≤40℃时加入青霉素和链霉素，充分摇匀后分装于平皿中，冷却后4℃保存备用。
2、保藏斜面培养基
葡萄糖20.0g/L，麦芽浸粉20.0g/L，琼脂25.0g/L，KH2PO43.0g/L，去离子水1000mL，pH自然；1×105Pa高压灭菌30min后将试管架倾斜摆放，使培养基成斜面，冷却后4℃保存备用。
3、活化培养基(固体平板培养基)
葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，琼脂粉20.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，ZnSO4·7H2O 50mg/L，维生素B110mg/L，去离子水1000mL，pH自然，1×105Pa高压灭菌30min，温度降低至≤40℃时加入已过滤除菌的维生素B1，充分摇匀后分装于平皿中，冷却后4℃保存备用。
4、发酵培养基(液体培养基)
葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 50mg/L，维生素B110mg/L，去离子水1000mL，pH自然，1×105Pa高压灭菌30min，温度降低至≤40℃时加入已过滤除菌的维生素B1，充分摇匀，冷却后4℃保存备用。
实施例2绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)的分离、纯化及鉴定
1、绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)的分离与纯化
本发明的菌株分离自广东省车八岭自然保护区的栲树倒木上。
从广东省车八岭自然保护区的栲树倒木上采集得到白腐真菌绒毛栓孔菌，用采集刀将新鲜子实体从基物上小心剥离，尽量去掉与子实体无关的杂质，在超净工作台()中，切取子实体上靠近基部的菌肉(大小约为3.5cm×3.5cm×3.5cm，子实体基部的营养菌丝生长最旺盛)接种到分离、纯化平板培养基上，于28±3℃下恒温静置培养7-8天后，挑取培养基中新长出的菌丝作为接种块转接入新的分离、纯化培养基上进行纯化培养，如此反复，直至分离、纯化平板培养基中的菌丝形态致密规则、呈白色绒毛状即视为完成纯化过程。
2、菌株BJFC-C1108的鉴定
2A)菌株BJFC-C1108在分离、纯化固体培养条件下的菌丝形态如图1所示。
2B)分离、纯化培养条件下，菌株BJFC-C1108于28±3℃恒温静置培养7-8天后即可铺满直径为90mm的平皿，长势较快，菌丝致密规则，呈白色绒毛状。培养7天后显微镜下观察发现，生殖菌丝具锁状联合，无色，薄壁，时有分枝，直径1-4μm；骨架菌丝嗜蓝，厚壁，多分枝，直径2-4μm。
2C)挑取分离纯化后的菌丝，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，采用通用引物ITS4/ITS5对其18S核糖体RNA(rRNA)内转录间隔区(Internaltranscribed spacer，ITS)进行PCR扩增后测序。
PCR反应体系(30μL)为：2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL；引物1(10μmol/L，正向)1μL；引物2(10μmol/L，反向)1μL；DNA模板(75ng/μL)1μL；去离子水12μL。反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性40s；54℃复性45s；72℃延伸1min；35个循环后72℃延伸10min；最后系统温度降低至4℃，保温，反应结束。
PCR扩增产物由北京六合华大基因科技有限公司测序，将测得的序列进行校对，去除两端不确定序列，得到约为538bp左右的产物片段，表明该序列含有538个碱基，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将该序列经Chromas序列拼接软件校正，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，发现菌株BJFC-C1108为Trametes pubescens属菌株。
结合菌株BJFC-C1108的形态特征及18S rRNA分析，鉴定菌株BJFC-C1108为Trametes pubescens属菌株，并确认本发明菌株为绒毛栓孔菌(Trametes pubescensBJFC-C1108)。
本发明的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)菌株已于2015年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路)，中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.10308。
实施例3发酵绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)制备及纯化漆酶Tplac
1、绒毛栓孔菌菌饼的制备
将纯化后的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)菌株接种于活化固体培养基上，于28±3℃下静置培养7-8天后通过直径为1cm的打孔器制得绒毛栓孔菌菌饼。
2、发酵种子悬液的制备
将绒毛栓孔菌菌饼接种于含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于28±3℃、150rpm下振荡培养。6天后利用内切式匀浆机以5000rpm进行匀浆处理30s，充分振荡得绒毛栓孔菌发酵种子悬液。
3、发酵培养
将绒毛栓孔菌发酵种子悬液以5.0％(V/V)的接种量加入到含100mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于28±3℃、150rpm下振荡培养。6天后采用循环水真空泵抽滤发酵混合物，得到的滤液于25±3℃下12000rpm离心20min，获得的上清液即为粗酶液；测定粗酶液的酶活性和蛋白质含量，测定结果如表1所示。
其中，漆酶活力测定方法如下：
将50μL酶液加入到1.95mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)和1.0mL1.0mmol/L 2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)的溶液中，混合均匀后25±3℃下反应3min，于420nm处测定吸光度；以去离子水替代ABTS同体积的反应混合液为对照。定义1min内催化氧化1μmol ABTS所需的酶量为1个酶活力单位(U)，设置3个平行，求平均值。已知420nm处ABTS的摩尔消光系数ε420＝3.6×104L/(mol·cm)。
采用Bradford染料结合法测定蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准品。取0.1mL粗酶液，加入5.0mL考马斯亮蓝试剂，混匀后于595nm处测定吸光度。
4、硫酸铵盐析
向粗酶液中缓慢加入硫酸铵至75％(W/V)饱和度，4℃静置至少12h后进行离心，将离心得到的上清液装入透析袋中，于4℃、至少50倍于上清液体积的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)中进行透析处理，每4h更换一次缓冲液，透析处理至少12h后，在透析袋外面覆盖聚乙二醇20000，待聚乙二醇湿透后再更换干燥的聚乙二醇，重复直至酶液浓缩至原体积的30％，即获得盐析酶液。
盐析酶液的活性、蛋白质含量按照步骤3粗酶液所述漆酶活性、蛋白质含量的方法测定，测定结果如表1所示。
5、阴离子交换柱层析
将预处理的DEAE-cellulose DE52阴离子交换层析柱填料装柱(Ф30×2.6cm，Pharmacia公司)后，用0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)以1.0mL/min平衡24h。随后，将步骤4获得的盐析酶液上样，室温(25±3℃)下以0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0mol/L NaCl溶液逐步线性梯度洗脱并分部收集洗脱液，洗脱速度为2.0mL/min。最后分别测定各收集管内的漆酶活力及蛋白质含量，将含有较高活力的酶液部分合并，装入透析袋中，于4℃、至少50倍于合并酶液体积的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)中进行透析处理，每4h更换一次缓冲液，透析处理至少12h后，在透析袋外面覆盖聚乙二醇20000，待聚乙二醇湿透后再更换干燥的聚乙二醇，重复直至酶液浓缩至原体积的30％，获得阴离子交换柱层析酶液。
阴离子交换柱层析酶液的活性、蛋白质含量按照步骤3粗酶液所述漆酶活性、蛋白质含量的方法测定，测定结果如图2、表1所示。
6、琼脂糖凝胶柱层析
将阴离子交换柱层析酶液上样至预先经0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)平衡12h的Sepharose GL-6B凝胶层析柱上(Ф60×2.6cm，Pharmacia)，以1.0mol/LNaCl溶液为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，洗脱完毕后进行蛋白质含量和漆酶活性的测定，收集合并具活性的组分并保存至-20℃备用。
琼脂糖凝胶柱层析酶液的活性、蛋白质含量按照步骤3粗酶液所述漆酶活性、蛋白质含量的方法测定，测定结果如图3、表1所示。
结果以平均值和标准差表示。利用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)、t-检验和LSD检验。**P<0.05和*P<0.01分别为差异显著和差异极显著。
表1绒毛栓孔菌漆酶Tplac的纯化结果
如图2、3和表1所示，将培养6天的绒毛栓孔菌所分泌的漆酶Tplac经硫酸铵分级沉淀纯化后，蛋白质含量和酶活性分别达8.390mg/mL和36.253U/mL。随后将收集的沉淀上样至DEAE-cellulose DE52阴离子交换层析柱，可以看到，经0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)和0-1.0mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱后，绒毛栓孔菌漆酶Tplac的洗脱图出现两个酶活峰。与现有已知漆酶的洗脱结果不同的是，Tplac活性很高的第一个峰是被缓冲液洗脱下来的，此时比活力为5.798U/mg，是粗酶液的5.008倍。收集此处的酶液继续进行Sepharose GL-6B柱层析纯化。经三步分离纯化后，漆酶Tplac的比活力可达到18.543U/mg，是粗酶液的16.016倍，此时回收率为49.34％。
实施例4漆酶Tplac分子量及光谱性质的测定
1、漆酶Tplac分子量的测定
采用5％浓缩胶(W/V)和12％分离胶(W/V)的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)对纯化后的漆酶Tplac的分子量进行测定。将经过考马斯亮蓝R-250染色并显带的凝胶拍照保存，根据胶中标准蛋白质Marker估计其分子量。
采用5％浓缩胶(W/V)和12％分离胶(W/V)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)探索Tplac的酶谱性质，其中，在两种胶的配制过程中均不添加SDS，且酶液不经过加热变性直接上样进行电泳。电泳后各凝胶分别用含1.0mmol/L ABTS或1.0mmol/L愈创木酚的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)活性染色，显带后拍照保存。
分子量测定结果如图4所示，SDS-PAGE中漆酶Tplac呈现单一条带，与蛋白质Marker比对后得到其分子量约为68.0kDa。利用ABTS及愈创木酚活性染色后结果显示，native PAGE也只呈现出单一条带，进一步说明Tplac在构型上可能是一种单体蛋白。
2、漆酶Tplac光谱性质的测定
将纯化的酶液溶于0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)中，25±3℃下置于紫外可见分光光度计中，在波长200-800nm范围内对其进行扫描，以探索Tplac的光谱性质。
绒毛栓孔菌漆酶Tplac的光谱学性质测定结果如图5所示，漆酶Tplac在340nm处有特征吸收峰，这是活性中心中III型Cu2 4+存在的典型特征；在610nm处也有特征吸收峰，表明Tplac活性中心含有一个I型Cu2+，这也就是漆酶显现蓝色的原因。
实施例5漆酶Tplac内侧氨基酸序列的测定
将纯化的酶液进行SDS-PAGE，电泳完毕后切取目标条带，用胰蛋白酶进行酶解处理，酶解处理时间至少12h(酶切过夜)。将酶切后的肽段进行纳米液相色谱质谱联用(Nano liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。根据漆酶序列具有同源性等特点，利用质谱数据分析软件SEQUEST(Thermo Finnigan，San Jose，CA，USA)、多序列分析软件ClustalX1.83和DNAMAN6.0等测定及与其他序列比对，通过查阅国际生物技术信息中心(NCBI)真菌漆酶序列数据库，获得绒毛栓孔菌漆酶Tplac的内侧氨基酸序列。
测定结果与现有已知的其他真菌漆酶的氨基酸对比如图6所示。漆酶Tplac的内侧氨基酸序列中，部分片段如HWHG、GTFWYHSHLSTQYCD GLRG、KRYRFRLVS和NSAILRY与其他现有已知真菌漆酶氨基酸片段如法国革孔菌(Coriolopsis gallica)PDB：2VDZ、污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)EJF60081、虎皮香菇(Lentinus tigrinus)AAX07469.1、PDB：2QT6、冬生多孔菌(Polyporus brumalis)ABN13591.1、缘毛多孔菌(Polyporus ciliatus)AAG09231.1、栓孔菌420(Trametes sp.420)AAW28936.1、栓孔菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)PDB：3KW7、硬毛栓孔菌(Trametes trogii)PDB：2HRG、云芝栓孔菌(T.versicolor)CAA77015、EIW62366和长绒栓孔菌(Trametes villosa)AAB47735等有一定的相似度，均属于多铜氧化酶家族，同源性分别达78.01％、76.76％、82.16％、82.16％、80.50％、82.16％、76.35％、79.67％、76.76％、76.35％、77.18％和77.18％。此外，氨基酸序列测定结果还显示本发明的绒毛栓孔菌漆酶Tplac含有两个铜原子保守结合区域(I和II型)和三个潜在的N-糖基化位点。这些均表明绒毛栓孔菌漆酶Tplac是一种典型漆酶，而又与其他真菌漆酶在氨基酸序列上存在差异，亦是一种新型漆酶。
实施例6pH和温度对漆酶Tplac活性和稳定性的影响
1、pH对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性和稳定性的影响
用pH计调制不同pH(1.0-13.0)的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，以1.0mmol/L ABTS为底物，将反应体系置于25±3℃下测定酶活，探索不同pH对漆酶Tplac活性的影响。将酶活测定体系在25±3℃、pH 1.0-13.0条件下保温72h，测定pH对漆酶Tplac稳定性的影响。
pH对漆酶Tplac的影响如图7所示，绒毛栓孔菌漆酶Tplac偏好酸性，最适pH为5.0，此时酶活力可达22.157U/mL。此外，在pH为4.5-10.0范围内Tplac活性均较为稳定，30℃保温72h后仍可以维持初始活性的75％。当pH为5.0时，72h后酶活仍可达20.218U/mL，说明酸性至碱性条件有利于漆酶Tplac活性的保持。相反，同等条件下Tplac在pH 1.0-4.0范围内时活性仅剩下初始的5％。Tplac的这种对碱性条件具有较高的活性、稳定性和耐受性使得其可以应用于染料脱色工艺中，较其他漆酶具有更为突出的优势和更为广阔的应用前景。
2、温度对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性和稳定性的影响
在最适pH(5.0)条件下，将酶活测定体系置于不同温度(10℃-90℃)中，以1.0mmol/L ABTS为底物，探索温度对漆酶Tplac活性的影响。此外，将酶活测定体系分别在不同温度(10℃-90℃)保温2h，以1.0mmol/L ABTS为底物，探索温度对漆酶Tplac稳定性的影响。
根据上述反应时间取样，4±3℃下12000rpm离心20min，获得的上清液用于漆酶活性的测定。试验设置3次重复，以最适pH或最适温度条件下得到的酶活为对照(100％)。
如图8所示，绒毛栓孔菌漆酶Tplac的最适温度为50℃，此时酶活力达28.687U/mL，且当温度在25℃-75℃范围内其相对酶活均高于50％。而将Tplac在25℃-55℃保温2h后，其酶活仍较为稳定，尤其在50℃保温2h后，酶活可达20.744U/mL。但当在75℃保温2h后酶活会减少50％，80℃时几乎检测不到酶活。推测绒毛栓孔菌漆酶Tplac的这种偏好适中或高温条件的特性主要是由于其菌株生长的地理环境所致。
实施例7底物及抑制剂对漆酶Tplac活性的影响
1、底物对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性的影响
在最适pH(5.0)及最适温度(50℃)条件下，3.0mL反应体系中，分别含1.95mL0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)、50μL粗酶液和1.0mmol/L不同的底物(ABTS、2,6-二甲氧基酚、愈创木酚、丁香醛连氮、苯酚、阿魏酸、对苯二酚、儿茶酚、藜芦醇、酪氨酸、没食子酸和左旋多巴)，于各底物的特征波长(如表2所示)处测定其反应速度，计算相对漆酶活力。以最适底物条件下得到的酶活为对照(100％)，设置3次重复。底物对漆酶Tplac活性的影响如表2所示。
2、抑制剂对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性的影响
在最适pH(5.0)条件下，将不同浓度(0.05、0.1和1.0mmol/L)的抑制剂(乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、L-半胱氨酸和叠氮化钠)加入到以1.0mmol/L ABTS为底物的酶促反应体系中，50±3℃下保温15min。以未添加抑制剂时所得到的酶活为对照(100％)，设置3次重复，计算相对酶活，测定结果如表3所示。
表2底物对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性的影响
表2的测定结果表明，绒毛栓孔菌漆酶Tplac能够氧化多种酚类及非酚类化合物，作用底物十分广泛，且Tplac对不同底物的氧化能力可排序为：ABTS>2,6-二甲氧基酚>左旋多巴>愈创木酚>丁香醛连氮>阿魏酸>藜芦醇>对苯二酚>儿茶酚>没食子酸>苯酚。然而，试验过程中并未检测到Tplac对酪氨酸的氧化作用。以0.1-1.0mmol/L ABTS为底物时，Tplac催化氧化过程中的动力学常数Km、kcat和kcat/Km分别为105.0μM、876s-1和8.34s-1μM-1。其中，相对低的Km也说明Tplac对底物ABTS具有较高的亲和力。
表3抑制剂对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性的影响
表3的测定结果表明，常见的抑制剂可不同程度地抑制绒毛栓孔菌漆酶Tplac的活性，0.05mmol/L叠氮化钠、0.1mmol/L二硫苏糖醇和0.1mmol/L L-半胱氨酸可导致漆酶Tplac活力下降。而0.1mmol/L金属螯合剂乙二胺四乙酸对Tplac的活力并没有明显影响，甚至当乙二胺四乙酸浓度达到1.0mmol/L时，其活力仍维持在95％以上，这可能是由于氧化底物的不同所致。
实施例8金属离子对漆酶Tplac活性的影响
在最适pH(5.0)条件下，将终浓度为25.0mmol/L的金属离子(Cu2+(CuSO4·5H2O)、K+(KCl)、Na+(NaCl)、Mn2+(MnSO4·H2O)、Ca2+(CaCl2)、Fe2+(FeSO4·7H2O)、Fe3+(FeCl3)、Mg2+(MgSO4·7H2O)、Zn2+(ZnSO4·7H2O)、Ba2+(BaCl2)和Al3+(AlCl3))分别加入到以1.0mmol/L ABTS为底物的酶促反应体系中，50±3℃下保温15min。以未添加金属离子时所得到的酶活为对照(100％)，设置3次重复，计算相对酶活。
以不同浓度(0.1-1.0mmol/L)ABTS为底物，检测添加25.0mmol/L金属离子对漆酶Tplac催化氧化ABTS速率的影响，并计算相应的动力学参数Km、kcat和kcat/Km。金属离子对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性的影响如表4所示。
表4金属离子对绒毛栓孔菌漆酶Tplac活性和氧化ABTS能力的影响
表4的测定结果说明，添加终浓度为25.0mmol/L金属离子并在50±3℃下保温15min后，漆酶Tplac的活力仍可维持初始活力的88％以上。值得注意的是，添加Cu2+、Mn2+、Na+、Zn2+和Mg2+可分别将Tplac的相对酶活提高至111.32％、106.93％、104.90％、104.08％和100.35％。此外，随着Cu2+等金属离子的添加，Tplac氧化ABTS时的kcat/Km逐渐降低。其中，25.0mmol/L Cu2+、Mn2+、Na+、Zn2+和Mg2+的添加可显著提高Tplac对底物的亲和力，进而使得其酶活力上升。这可能是由于上述金属离子的结合可诱导酶的构象发生改变，刺激包括底物、酶和金属离子在内的类似于非竞争抑制模型中三元聚合物的分解，进而使得酶与底物的亲和力上升；而另外一些金属离子如Ca2+、K+、Fe2+、Fe3+、Al3+和Ba2+可结合到漆酶T1Cu位点的邻近部位，阻塞底物与T1Cu位点的通路或抑制T1活性位点的电子转移而充当电子供体的竞争性抑制剂，进而导致酶活性下降。
实施例9漆酶Tplac对染料的脱色作用
1、配制染料溶液
将刚果红、结晶紫、活性亮蓝X-BR、亚甲基蓝和中性红5种染料溶于去离子水中，分别制成浓度为50mg/L的染料溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌后避光保存备用。
2、脱色反应
2-1)分别将5种染料溶液各4.0mL、0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)5.5mL和1.0U/mL纯化的漆酶Tplac酶液0.5mL置于50mL三角瓶中，制成10.0mL脱色体系，将其放置于摇床上，于50±3℃、150rpm下进行脱色处理。
2-2)分别以同等条件下未添加酶液(即脱色体系含有染料溶液(4.0mL)和6.0mL、0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0))及未添加染料(即脱色体系含有9.5mL0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)和0.5mL 1.0U/mL纯化的漆酶Tplac酶液)的反应体系为对照。每个处理设置3次重复。
2-3)振荡脱色处理72h后，于4±3℃下12000rpm离心30min得上清液，用紫外可见分光光度计(UNICO 4802，尤尼柯上海仪器有限公司)按照如表5所示的特征波长测定各种染料的吸光度A，计算染料脱色率(％)，测定结果如表5所示。染料脱色率的计算公式如下：
其中，Ai为50mg/L染料溶液吸光度，Af为染料溶液被漆酶Tplac脱色后的吸光度。
表5绒毛栓孔菌漆酶Tplac对染料的脱色作用
如表5所示，脱色反应72h后，漆酶Tplac(0.1U/mL)对5种染料(50mg/L)均有不同程度的脱色作用，尤其以对刚果红的脱色效果最好，因此，选取偶氮染料刚果红作为模式染料进行以下试验。
实施例10染料刚果红经漆酶Tplac降解后的代谢产物研究
将模式染料刚果红溶于去离子水中，制成浓度为50mg/L的刚果红溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃避光保存备用。
将刚果红溶液(4.0mL)、0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0，5.5mL)和1.0U/mL纯化的漆酶Tplac酶液(0.5mL)置于50mL三角瓶中，制成10.0mL脱色体系，将其放置于摇床上，于50±3℃、150rpm下进行脱色处理。
脱色96h后用循环水真空泵抽滤脱色体系，收集脱色反应液，分别用与脱色体系相同体积的乙酸乙酯重复萃取模式染料降解产物3次，随后加入适量无水硫酸钠进行干燥，真空泵抽滤，所得滤液在旋转蒸发器中减压挥发至干，然后向降解产物中加入2.0mL甲醇(色谱纯)，溶解后进行气相色谱-质谱联用分析。
气相色谱分析条件：PE-5MS毛细管色谱柱，柱箱初始温度为80℃，保持2min，以10℃/min的速率升温至150℃，然后再以25℃/min的速率升温至280℃，最后保持7min，程序总运行时间为18min。载气为高纯氦气(纯度为99.999％以上)，流量为1.0mL/min。进样口温度为280℃，手动进样，进样量为1.0μL，分流比为20:1；质谱分析条件：传输线温度为280℃；电子轰击(EI)方式为电离；电离能量为70eV；倍增电压为470V；离子源温度为250℃；溶剂延迟2.3min；扫描方式：质量扫描范围为15-300amu；SIM扫描方式定量。
根据上述气相色谱-质谱联用分析结果断定，绒毛栓孔菌漆酶Tplac对偶氮染料刚果红的降解过程中产生的代谢产物为萘胺(分子量143，中波143，保留时间19.657min，区域18.31％)、联苯胺(分子量169，中波169，保留时间10.856min，区域4.56％)、联苯(分子量154，中波154，保留时间17.753min，区域9.37％)和叠氮萘(分子量156，中波156，保留时间14.287min，区域14.22％)。根据上述结果推断出绒毛栓孔菌漆酶Tplac降解刚果红的途径，如图9所示。可以看到，偶氮染料刚果红被Tplac降解的第一步即为-N＝N-的断裂，而这种酶系造成的不对称断裂诱导了活性中间体A和B的形成，进而参与合成稳定性更高的产物。
实施例11漆酶Tplac对染料的脱毒作用
将实施例10中有机溶剂萃取的经绒毛栓孔菌漆酶Tplac降解的染料刚果红的代谢产物溶解于去离子水中，使其终浓度达到2.0g/L，获得漆酶Tplac降解染料刚果红溶液，用以进行植物毒性试验。
以常见种子菜豆(Phaseolus mungo)、高粱(Sorghum vulgare)和小麦(Triticumaestivum)为材料，于25±3℃温水中浸泡12h，选取10粒膨胀的种子均匀置于培养皿中的滤纸上。每天分别用5.0mL漆酶Tplac降解染料刚果红溶液浇灌，以保持种子萌发所需要的湿度，同时以去离子水和染料刚果红溶液(浓度为2.0g/L)处理作为对照。将种子于25±3℃下萌发，7天后测定种子的萌发率(％)、胚芽、胚根生长状况及长度(cm)，测定结果如表6所示。
表6染料刚果红及其经绒毛栓孔菌漆酶Tplac降解的代谢产物对植物的毒性研究
如表6所示，对照组去离子水和刚果红降解产物对种子萌发率(％)和胚根、胚芽生长状况的抑制作用明显低于染料本身对其的抑制作用。因此，植物毒性试验表明，经白腐真菌绒毛栓孔菌漆酶Tplac处理的染料溶液毒性明显减小，可以应用于农业灌溉等。
实施例12金属离子对漆酶Tplac催化模式染料脱色能力的影响
将3种不同浓度(20.0-60.0mmol/L)的金属离子(Cu2+(CuSO4·5H2O)、Zn2+(ZnSO4·7H2O)和Fe3+(FeCl3))分别加入到染料脱色体系(10.0mL脱色体系中含有50mg/L刚果红4.0mL、0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0，5.5mL)和1.0U/mL纯化的漆酶Tplac酶液0.5mL)中，于50±3℃、150rpm下进行振荡反应。
分别以同等条件下未添加金属离子、未添加酶液及未添加染料的反应体系为对照，设置3次重复。每隔0.5h测定497nm下刚果红的吸光度Af，直至该吸光度为0，获得模式染料刚果红100％脱色所需的时间，探索金属离子对漆酶Tplac催化模式染料脱色能力的影响，测定结果如图10所示。
未添加金属离子时纯化的漆酶Tplac对刚果红完全脱色所需的时间为78h，而添加30.0mmol/L Cu2+使得染料100％脱色所需时间减少了21h，但当Cu2+的添加浓度为40.0mmol/L时，Tplac对刚果红完全脱色所需的时间又返回至起始水平，这可能是由于Tplac的高效耐金属能力，使得其对含Cu2+等金属离子的染料溶液有较好的脱色效果。当添加20.0-30.0mmol/L Zn2+时，刚果红100％脱色所需时间略微减少，但当Zn2+的添加浓度为60.0mmol/L时，染料刚果红完全脱色所需的时间大大增加，是未添加的1.46倍。此外，少量Fe3+的添加促使Tplac催化染料完全脱色所需的时间大大增加，尤其当添加浓度为60.0mmol/L，完全脱色时间达133h，可见一些重金属离子的存在可能会造成纺织废水的降解率降低且脱色处理的时间增长。
Claims (10)
1.一株生产漆酶的菌株绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)，其微生物保藏编号为CGMCC No.10308。
2.如权利要求1所述的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)在制备漆酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述应用是将所述的绒毛栓孔菌(Trametespubescens BJFC-C1108)在有氧及避光条件下发酵培养。
4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述发酵培养的发酵培养基包括碳源、氮源和无机成分。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是，所述发酵培养基的碳源选择麦芽糖、蔗糖或葡萄糖；所述氮源选择酵母浸粉；所述无机成分选择KH2PO4、MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述1L发酵培养基由下列物质组成：葡萄糖20.0g，酵母浸粉5.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 50mg，维生素B110mg，去离子水1000mL。
7.如权利要求2-6任一所述的应用，其特征是，所述发酵培养温度为28±3℃；培养过程中振荡速度为100-200rpm；培养时间为5-7天。
8.一种漆酶，其特征是通过发酵培养绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)而产生。
9.如权利要求1所述的绒毛栓孔菌(Trametes pubescens BJFC-C1108)在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物的降解中的应用；在染料降解中的应用；在纸浆造纸、环境保护、食品加工、化妆品制作、生物修复、生物检测、生物燃料、生物能源、有机物合成、改善纤维性能中的应用。
10.如权利要求8所述漆酶在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物的降解中的应用；在染料降解中的应用；在纸浆造纸、环境保护、食品加工、化妆品制作、生物修复、生物检测、生物燃料、生物能源、有机物合成、改善纤维性能中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150513 |