KR102125358B1 - 액화력 및 당화력이 높은 신규한 아스퍼질러스 오리재 if18-2 균주 및 이의 건조 방법 - Google Patents

액화력 및 당화력이 높은 신규한 아스퍼질러스 오리재 if18-2 균주 및 이의 건조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 액화력 및 당화력이 높은 신규한 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주 및 이의 건조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) IF18-2 균주는 20 내지 60%(w/w)의 글루코스가 포함된 배지에서 생장할 수 있는 내당성을 가지고, 알파-아밀라아제 활성이 우수하며, 글루코아밀라아제 활성이 알파-아밀라아제 활성보다 더욱 우수하고, 산 프로테아제 활성은 낮다. 또한, 상기 균주를 저온냉풍건조하면 동결건조 또는 열풍건조에 비하여 미생물 오염도는 낮고 포자수는 많은 균주를 얻을 수 있고, 상기 균주의 배양 시 트레할로스를 0.1 내지 2.0%(w/w)로 포함하는 경우 많은 포자수의 막걸리용 종균을 제조할 수 있으므로, 본 발명의 IF18-2 균주, 이의 저온냉풍건조 방법 및 상기 균주를 이용한 막걸리용 종균의 제조방법은 품질 좋은 막걸리용 종균을 대량생산하고 이를 이용하여 막걸리를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

액화력 및 당화력이 높은 신규한 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주 및 이의 건조 방법{Novel Aspergillus oryzae IF18-2 with high saccharogenic power and high liquerying activity and drying method thereof}
본 발명은 액화력 및 당화력이 높은 신규한 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주 및 이의 건조 방법에 관한 것이다.
탁주는 전통주 가운데서 가장 역사가 오래된 술이며, 주로 서울이남 지역에서 서민층이 주로 즐겨 마셨던 술로 농주(農酒)라고도 불리워지는 유백색의 탁한 액으로서, 알코올 도수는 약 5∼16℃의 범위이며 보통은 6∼7℃이다. 통상 막걸리라 불려지는 탁주의 양조법은 지방에 따라 다르기는 하나, 가장 일반적인 양조법은 찹쌀 또는 멥쌀을 세미하고 침지, 절수 및 증자를 하여 만든 고두밥에 누룩과 물을 섞어 만든 것으로 7∼10일 정도 경과하면 알코올 발효가 되어 술덧을 떠서 체로 걸러 탁주로 분리하게 된다. 탁주는 음주 후, 두통이 거의 없고 그윽한 풍미와 감칠맛이 일품인 우리 민족 고유의 가장 서민적인 전통 대중주이나, 탁주 제조를 위한 종국제조 기술의 상업적 생산에 어려움이 있고, 제품의 불균일성 및 맛의 다양성이 미흡할 뿐만 아니라 또한 이상 발효로 인한 산패가 발생한다는 문제점이 있다. 따라서 탁주의 품질 고급화 및 표준화를 위해서는 우수한 특성을 가진 종균을 개발하고, 이를 안정적으로 유지 및 공급할 수 있는 기술이 필요하다.
아밀라아제(amylase)란 전분을 가수분해하는 효소로, 작용 특성에 따라 알파-아밀라아제(α-amylase), 베타-아밀라아제(β-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)로 분류된다. 이 중 알파-아밀라아제는 전분을 액화시키는데 관여하는 효소로 알파-1,4 결합을 무작위로 가수분해하여 전분을 비교적 큰 소당류로 분해하나, 알파-1,6 결합 및 그 근처에 있는 알파-1,4 결합에는 작용하지 못하여 덱스트린이 남게 된다는 한계가 있다.
글루코아밀라아제는 전분의 비환원성 말단부터 글루코스(glucose) 단위로 분해하는데 관여하는 효소로, 비환원성 말단에서 포도당을 하나씩 잘라내며 전분을 거의 완전한 포도당으로 만들어 전분으로부터 포도당을 만드는데 직접적인 역할을 하는 효소이다. 따라서, 막걸리 제조에 있어 알파-아밀라아제보다는 글루코아밀라아제 활성이 우수한 미생물이 산업적 이용가치가 더 크다고 볼 수 있다.
한편, 막걸리와 같은 전통주들은 대부분 쌀을 비롯한 곡물을 주 원료로 사용하며, 제조 특성상 복합적인 맛과 향을 갖고 있는데, 이는 주로 발효 중 입국의 곰팡이가 생성하는 프로테아제, 펩티다아제 등에 의해 생성되는 아미노산에 영향을 받는다. 특히, 아미노산은 발효 중에는 퓨젤오일(fusel oil) 성분의 전구체로 사용되어 너무 진한 향기성분을 내면서 맛을 역하게 하며, 발효 후에 아미노산 성분들이 다량 잔류하게 되면 맛을 너무 진하게 하는 지미성분으로 작용하게 된다. 또한 잔류된 아미노산 성분들은 유통 중 발효액의 당류와 반응하게 되어 마일라드 반응(Maillard reaction)을 일으켜 착색을 일으킨다. 적당한 산 프로테아제(acidic protease) 활성을 갖는 미생물은 막걸리의 감칠맛을 좋게 할 수 있으나, 너무 높은 산 프로테아제 활성을 갖는 미생물은 막걸리 제조에 적합하지 않을 수 있다.
대한민국 공개특허 제10-2018-0059415호
본 발명의 목적은 액화력 및 당화력이 높고, 산 프로테아제 활성은 낮은 신규한 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주, 이의 저온냉풍건조 방법, 상기 균주를 이용한 막걸리용 종균의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파-아밀라아제 활성, 글루코아밀라아제 활성 및 산 프로테아제 활성을 가지며, 기탁번호 KACC93289P로 기탁된 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) IF18-2 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 20 내지 40℃의 냉풍을 이용하여 건조하는 단계를 포함하는, 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주의 건조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 트레할로스(trehalose)가 0.1 내지 2.0%(w/w)로 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 막걸리용 종균의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) IF18-2 균주는 20 내지 60%(w/w)의 글루코스가 포함된 배지에서 생장할 수 있는 내당성을 가지고, 알파-아밀라아제 활성이 우수하며, 글루코아밀라아제 활성이 알파-아밀라아제 활성보다 더욱 우수하고, 산 프로테아제 활성은 낮다. 또한, 상기 균주를 저온냉풍건조하면 동결건조 또는 열풍건조에 비하여 미생물 오염도는 낮고 포자수는 많은 균주를 얻을 수 있고, 상기 균주의 배양 시 트레할로스를 0.1 내지 2.0%(w/w)로 포함하는 경우 많은 포자수의 막걸리용 종균을 제조할 수 있으므로, 본 발명의 IF18-2 균주, 이의 저온냉풍건조 방법 및 상기 균주를 이용한 막걸리용 종균의 제조방법은 품질 좋은 막걸리용 종균을 대량생산하고 이를 이용하여 막걸리를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 10종 곰팡이 종균의 내당성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 10종 곰팡이 종균의 배양 온도별 알파-아밀라아제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 10종 곰팡이 종균의 배양 온도별 글루코아밀라아제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 10종 곰팡이 종균의 배양 온도별 산 프로테아제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 5종 곰팡이 종균으로부터 제조한 액체종균 사진이다.
도 6은 2종 곰팡이 종균을 트레할로스(trehalose)가 0, 0.5, 1 또는 2%로 첨가된 배지에서 배양하여 제형화시킨 후, 저온냉풍건조한 종균의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 사진이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 알파-아밀라아제 활성, 글루코아밀라아제 활성 및 산 프로테아제 활성을 가지며, 기탁번호 KACC93289P로 기탁된 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) IF18-2 균주를 제공한다.
상기 글루코아밀라아제 활성은 알파-아밀라아제 활성 및 산 프로테아제 활성보다 높을 수 있다.
상기 균주는 20 내지 60%(w/w)의 당을 포함하는 배지에서의 생장에 내성이 있을 수 있고, 구체적으로 20 내지 40%(w/w)의 당을 포함하는 배지에서의 생장에 내성이 있을 수 있다.
상기 균주는 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 만노스(mannose), 람노스(rhamnose), 갈락토스(galactose), 프럭토스(fructose), 말토스(maltose), 글리세롤(glycerol), 멜리비오스(melibiose), 자일로스(xylose), 이노시톨(inositol), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol) 및 아라비노스(arabinose)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 탄소원으로 이용할 수 있다.
상기 균주는 질산나트륨(NaNO3), 황산암모늄((NH4)2SO4), 염화암모늄(NH4Cl), 쇠고기 추출물(Beef Extract), 트립톤(Tryptone) 및 질산칼륨(KNO3)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 질소원으로 이용할 수 있다.
상기 균주는 글루코스(glucose), 갈락토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 라피노스(raffinose), 용해성 전분(soluble starch) 및 알파-메틸-D-글루코시드(α-methyl-D-glucoside)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 탄수화물을 발효시킬 수 있다.
상기 균주는 20 내지 30℃, 20 내지 28℃, 20 내지 26℃, 22 내지 30℃, 22 내지 28℃, 22 내지 26℃, 23 내지 30℃, 23 내지 28℃, 또는 23 내지 26℃에서 배양될 수 있다.
상기 균주는 24 내지 96시간, 24 내지 84시간, 24 내지 72시간, 36 내지 96시간, 36 내지 84시간, 36 내지 72시간, 48 내지 96시간, 48 내지 84시간, 또는 48 내지 72시간 동안 배양될 수 있다.
상기 균주는 YE(yeast extract) 배지, MEA(malt extract agar) 배지, DG18(Dichloran-glycerol 18%) 배지, DRBC(Dichloran rose bengal chloramphenicol) 배지 또는 PDA(potato dextrin agar) 배지에서 배양될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 20 내지 40℃의 냉풍을 이용하여 건조하는 단계를 포함하는, 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주의 건조 방법을 제공한다.
상기 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 균주는 알파-아밀라아제 활성, 글루코아밀라아제 활성 및 산 프로테아제 활성을 가지며, 기탁번호 KACC93289P로 기탁된 균주일 수 있고, 상기 글루코아밀라아제 활성은 알파-아밀라아제 활성 및 산 프로테아제 활성보다 높을 수 있다.
또한, 상기 균주는 20 내지 60%(w/w)의 당을 포함하는 배지에서의 생장에 내성이 있을 수 있고, 구체적으로 20 내지 40%(w/w)의 당을 포함하는 배지에서의 생장에 내성이 있을 수 있다.
상기 건조는 20 내지 40℃, 25 내지 40℃, 30 내지 40℃, 33 내지 40℃, 20 내지 38℃, 25 내지 38℃, 30 내지 38℃, 33 내지 38℃, 20 내지 36℃, 25 내지 36℃, 30 내지 36℃, 또는 33 내지 36℃에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 건조는 12 내지 120시간, 16 내지 120시간, 20 내지 120시간, 12 내지 96시간, 16 내지 96시간, 20 내지 96시간, 12 내지 72시간, 16 내지 72시간, 20 내지 72시간, 12 내지 48시간, 16 내지 48시간, 20 내지 48시간, 12 내지 36시간, 16 내지 36시간, 또는 20 내지 36시간 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 트레할로스(trehalose)가 0.1 내지 2.0%(w/w)로 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 막걸리용 종균의 제조방법을 제공한다.
상기 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 균주는 알파-아밀라아제 활성, 글루코아밀라아제 활성 및 산 프로테아제 활성을 가지며, 기탁번호 KACC93289P로 기탁된 균주일 수 있고, 상기 글루코아밀라아제 활성은 알파-아밀라아제 활성 및 산 프로테아제 활성보다 높을 수 있다.
또한, 상기 균주는 20 내지 60%(w/w)의 당을 포함하는 배지에서의 생장에 내성이 있을 수 있고, 구체적으로 20 내지 40%(w/w)의 당을 포함하는 배지에서의 생장에 내성이 있을 수 있다.
상기 막걸리용 종균의 제조방법은 상기 배양된 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 20 내지 40℃의 냉풍을 이용하여 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 건조는 20 내지 40℃, 25 내지 40℃, 30 내지 40℃, 33 내지 40℃, 20 내지 38℃, 25 내지 38℃, 30 내지 38℃, 33 내지 38℃, 20 내지 36℃, 25 내지 36℃, 30 내지 36℃, 또는 33 내지 36℃에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 건조는 12 내지 120시간, 16 내지 120시간, 20 내지 120시간, 12 내지 96시간, 16 내지 96시간, 20 내지 96시간, 12 내지 72시간, 16 내지 72시간, 20 내지 72시간, 12 내지 48시간, 16 내지 48시간, 20 내지 48시간, 12 내지 36시간, 16 내지 36시간, 또는 20 내지 36시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 전국 11개 지역에서 수집한 18종의 다양한 누룩으로부터 10종의 곰팡이 종균을 분리하여 20 내지 60%의 글루코스가 첨가된 배지에 대한 내당성을 확인하고, 23 내지 28℃에서 배양 후, 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 산 프로테아제 활성을 측정하여, 내당성, 알파-아밀라아제 활성 및 글루코아밀라아제 활성이 우수하고, 산 프로테아제 활성은 낮은 5종 곰팡이 종균을 선별하였다(표 1 내지 4, 및 도 1 내지 4 참조).
또한 본 발명자들은, 선별한 5종 곰팡이 종균의 탄수화물 발효, 탄소원 이용 및 질소원 이용 특성을 확인하였다(표 5 내지 7 참조).
또한 본 발명자들은, 상기 5종 중 가장 활성이 좋은 2종 곰팡이 종균에 대하여 건조 방법에 따른 품질을 비교하여 저온냉풍건조 방법이 가장 적합한 건조 방법임을 확인하였고, 상기 2종 곰팡이 종균의 배양 시 트레할로스를 농도별로 첨가하여 배양 후 저온냉풍건조한 경우 트레할로스 첨가 농도가 0.5%인 경우에 가장 포자수가 많음을 확인하였다(표 8 내지 10, 및 도 6 참조).
따라서, 본 발명의 IF18-2 균주, 이의 저온냉풍건조 방법 및 상기 균주를 이용한 막걸리용 종균의 제조방법은 품질 좋은 막걸리용 종균을 대량생산하고 이를 이용하여 막걸리를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 10종 곰팡이 종균의 내당성 확인
전국 11개 지역에서 수집한 18종의 다양한 누룩으로부터 10종의 곰팡이 종균을 분리하여, 내당성을 확인하였다.
구체적으로, 누룩 표면의 곰팡이를 분리하기 위하여, 세균류의 생육을 억제하기 위해 항생제인 클로람페니콜(chloramphenicol) 34 ㎍/㎖를 첨가한 MEA 배지(malt extract 3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)를 제작하였다. 각 누룩 표면을 일회용 백금이로 긁어 상기 MEA 배지 상에 스트리킹(streaking)하여 접종하였다. 각 배지를 28℃에서 4일간 배양하여 누룩 표면에 생육하는 단일 곰팡이를 분리하였다.
누룩 내부의 곰팡이를 분리하기 위하여 클로람페니콜 34 ㎍/㎖ 및 디클로란(Dichloran, Sigma-Aldrich, 미국) 2 ㎍/㎖를 첨가한 DG18(Dichloran-glycerol 18%) 배지(Oxoid, 미국)를 제작하였다. 클로람페니콜은 세균류의 생육을 억제하기 위하여, 디클로란은 털곰팡이 계열(Lichtheimia(Absidia) sp. 또는 Mucor sp.) 또는 리조푸스 속(Rhizopus sp.) 계열의 균주에 의한 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 계열의 누룩곰팡이(A. oryzae, A. luchuensis, A. niger 등) 생육 저해를 막기 위하여 배지에 첨가하였다. 각 누룩 10 g을 50 ㎖의 멸균 수에 현탁시킨 후, 1/10씩 단계적으로 희석하여 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 또는 10-7 배 희석한 누룩을 각각 DG18 및 DRBC 배지에 도말하였다. 각 배지를 28℃에서 7일간 배양한 후, 단일 곰팡이를 분리하였다.
균주명 균주의 학명 KACC a 기탁번호
OF5-8 Aspergillus turbengensis 93271P
OF5-10 A. oryzae 93283P
OF5-18 A. oryzae 93284P
OF5-20 A. oryzae 93285P
IF2-5 A. oryzae -
IF13-3 A. niger 93266P
IF13-4 A. niger 93269P
IF13-7 A. niger -
IF18-2 A. oryzae 93289P
IF20-25 A. oryzae 93286P
aKACC: 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection)
10종 곰팡이 종균을 106 개/㎖의 포자수로 20, 40 또는 60%의 글루코스(glucose)가 첨가된 YE(yeast extract) 액체배지(Difco, Co., 미국)에 각각 접종하고 각각 28℃의 진탕 배양기에서 3일간 배양하였다. 배양액을 회수하여 균질화기(homogenizer)로 70%의 진폭(amplitude) 조건으로 균사를 50분간 분쇄한 후, 660 nm에서 흡광도를 측정하여 곰팡이 균주들의 생육 정도를 확인하였다.
그 결과, 40%의 글루코스가 포함된 배지에서 IF13-4, IF13-7 및 IF18-2 균주가 높은 생육능을 보였고, 60% 글루코스가 포함된 배지에서 IF13-4 균주가 가장 높은 생육능을 나타냈다(도 1). 이는 IF13-4, IF13-7 및 IF18-2 균주가 우수한 내당성을 갖는 균주임을 제시한다.
실험예 2. 10종 곰팡이 종균의 배양 온도에 따른 효소활성 확인
상기 10종 곰팡이 종균을 23, 25 또는 28℃에서 배양한 후, 전분 분해에 관여하는 효소인 알파-아밀라아제(α-amylase) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성과 단백질 분해에 관여하는 효소인 산 프로테아제(acidic pretease) 활성을 정량적으로 분석하였다.
2-1. 10종 곰팡이 종균의 배양 및 조효소액의 준비
상기 10종 곰팡이 종균을 2%의 감자 전분(potato starch)이 첨가된 고체 배지에 접종한 후, 이를 동일한 크기(1 cm × 1 cm)로 잘라 YE 액체배지에 접종하여 3일 동안 진탕배양기에서 150 rpm으로 23, 25 또는 28℃ 온도 조건으로 배양한 후, 배양 상등액을 회수하여 조효소액으로 준비하였다.
2-2. 10종 곰팡이 종균의 알파-아밀라아제 활성 확인
상기 실험예 2-1에서 준비한 조효소액의 알파-아밀라아제 효소 활성을 키트(Kikkoman, 일본)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 알파-아밀라아제 효소 활성 단위인 1 유닛(unit, U)은 37℃에서 10분간 효소 반응 시 N3-G5-β-CNP(2-chloro-4-nitrophenyl-6-azide-6-deoxy-β-maltopentaside)로부터 1 μmole의 2-클로로-4-니트로페닐(2-chloro-4-nitrophenyl)이 생성된 것으로 정의하였고, 효소 활성은 하기 계산식 1에 따라 계산하였다.
[계산식 1]
효소 활성 (U/mg extracellular protein) = (Es - Eb) × 0.171 × Df
(Es: 효소 반응 후 시료의 흡광도;
Eb: 효소 반응 전 블랭크(blank)의 흡광도; 및
Df: 시료의 희석 배수)
균주명 알파-아밀라아제 활성(U/mg extracellular protein)
23℃ 25℃ 28℃
OF5-8 1,560.822 ± 547.876 863.938 ± 121.557 932.346 ± 153.411
OF5-10 724.748 ± 96.562 780.498 ± 96.562 627.186 ± 83.625
OF5-18 710.811 ± 83.625 939.516 ± 123.483 821.542 ± 29.411
OF5-20 923.624 ± 101.079 752.623 ± 96.562 627.186 ± 83.625
IF2-5 710.811 ± 83.625 878.060 ± 83.625 665.207 ± 7.583
IF13-3 809.412 ± 192.625 1,022.628 ± 38.261 585.373 ± 96.562
IF13-4 985.352 ± 89.696 919.873 ± 118.263 836.248 ± 236.527
IF13-7 1,337.996 ± 193.123 1101.972 ± 83.34 613.248 ± 255.478
IF18-2 1,059.247 ± 96.562 1,274.794 ± 199.890 1,119.057 ± 197.922
IF20-25 794.435 ± 83.625 1,087.122 ± 96.562 759.689 ± 85.104
그 결과, 23℃에서는 OF5-8, IF13-7 및 IF18-2 균주, 25℃에서는 IF18-2, IF13-3 및 IF20-25 균주, 28℃에서는 IF18-2 균주가 높은 액화력 활성을 나타냈으며, IF18-2 균주가 다른 곰팡이 균주들에 비하여 다양한 온도 범위에서 현저히 높은 액화력을 유지하였다(도 2). 이는 IF18-2 균주가 다른 곰팡이 종균들에 비해 산업적 가치가 높음을 제시한다.
2-3. 10종 곰팡이 종균의 글루코아밀라아제 활성 확인
상기 실험예 2-1에서 준비한 조효소액의 글루코아밀라아제 효소 활성을 키트(Kikkoman)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 글루코아밀라아제 효소 활성 단위인 1 유닛은 37℃에서 10분간 효소 반응 시 4-니트로페닐-β-D-글루코시드(4-nitrophenyl-β-D-glucoside)로부터 1 μmole의 4-니트로페놀(4-nitrophenol, PNP)이 생성된 것으로 정의하였고, 효소 활성은 하기 계산식 2에 따라 계산하였다.
[계산식 2]
효소 활성 (U/mg extracellular protein) = (Es - Eb) × 0.171 × Df × 추출율 × 144.6
(Es: 효소 반응 후 시료의 흡광도;
Eb: 효소 반응 전 블랭크의 흡광도; 및
Df: 시료의 희석 배수)
균주명 글루코아밀라아제 활성(U/mg extracellular protein)
23℃ 25℃ 28℃
OF5-8 1,653.606 ± 0.000 879.730 ± 521.376 631.586 ± 0.000
OF5-10 N.Da N.D N.D
OF5-18 N.D N.D N.D
OF5-20 N.D N.D N.D
IF2-5 N.D N.D N.D
IF13-3 1,202.681 ± 179.246 1,435.214 ± 157.513 1,696.225 ± 0.000
IF13-4 1,384.04 ± 288.771 1,527.244 ± 276.154 1,610.037 ± 560.543
IF13-7 1,652.681 ± 333.892 1,537.262 ± 237.320 1,206.306 ± 275.300
IF18-2 6,989.712 ± 1040.454 6,945.115 ± 519.131 7,041.593 ± 617.816
IF20-25 1,714.652 ± 467.196 2,579.543 ± 579.246 3,026.885 ± 1,002.844
aN.D: 측정 안 됨(not determined)
그 결과, IF18-2 균주가 모든 온도 범위에서 다른 균주들에 비하여 월등히 높은 당화력 활성을 나타냈고, 그 외에 23℃에서는 OF5-8 및 IF20-25 균주, 25℃에서는 IF20-25 및 IF13-7 균주, 28℃에서는 IF20-25 및 IF13-3 균주가 비교적 높은 당화력 활성을 나타냈다(도 3). 이는 IF18-2 균주가 다른 곰팡이 종균들에 비해 산업적 가치가 높음을 제시한다.
2-4. 10종 곰팡이 종균의 산 프로테아제 활성 확인
상기 실험예 2-1에서 준비한 조효소액의 산 프로테아제 효소 활성을 키트(Kikkoman)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 산 프로테아제 효소 활성 단위인 1 유닛은 37℃에서 10분간 효소 반응 시 Cbz-Tyr-Ala(carbobenzoxy-L-tyrosyl-L-alanine)로부터 1 μmole의 L-알라닌(L-alanine)이 생성된 것으로 정의하였고, 생성된 L-알라닌은 PMS(1-methoxy-5-methyl phenazinium methosulfate) 시약을 이용하여 발색시켜 측정하였으며, 효소 활성은 하기 계산식 3에 따라 계산하였다.
[계산식 3]
효소 활성 (U/mg extracellular protein) = (Es - Eb) / (Estd - Ec) × 0.1 × Df
(Es: 효소 반응 후 시료의 흡광도;
Eb: 효소 반응 전 블랭크의 흡광도;
Estd: 키트 표준 반응액의 흡광도;
Ec: 증류수 반응액의 흡광도; 및
Df: 시료의 희석 배수)
균주명 산 프로테아제 활성(U/mg extracellular protein)
23℃ 25℃ 28℃
OF5-8 1,002.139 ± 63.147 1,200.488 ± 135.939 1,246.614 ± 137.253
OF5-10 1,245.991 ± 151.880 1,274.030 ± 142.759 1,235.598 ± 111.659
OF5-18 1,226.108 ± 122.461 1,237.725 ± 172.425 1,439.907 ± 141.597
OF5-20 1,250.000 ± 0.000 1,267.370 ± 0.000 1,291.001 ± 182.017
IF2-5 1,149.259 ± 167.025 1,205.403 ± 178.785 1,162.806 ± 135.399
IF13-3 1,232.169 ± 695.941 1,677.898 ± 0.000 1,837.135 ± 251.175
IF13-4 1,481.227 ± 272.564 2,064.500 ± 273.397 1,255.147 ± 290.417
IF13-7 1,165.159 ± 248.590 1,168.138 ± 139.837 1,976.942 ± 318.467
IF18-2 1,022.573 ± 134.462 954.534 ± 150.373 948.140 ± 159.143
IF20-25 1,292.831 ± 184.095 1,283.215 ± 118.331 1,272.715 ± 197.270
그 결과, 23℃에서는 OF5-8 및 IF18-2 균주, 25℃에서는 IF18-2 및 IF13-7 균주, 28℃에서는 IF18-2 및 IF2-5 균주가 낮은 단백질 분해 활성을 나타냈고, 25℃ 및 28℃에서 IF18-2 균주가 가장 낮은 활성을 보였다(도 4). 이는 IF18-2 균주가 다른 곰팡이 종균들에 비해 주류 제조에 보다 적합한 종균임을 제시한다.
실험예 3. 5종 곰팡이 종균의 탄수화물 발효 특성 확인
상기 실험예 1 및 2에서 확인한 결과에 따라, 10종 곰팡이 균주 중 전반적으로 내당성, 당화력 및 액화력이 우수하면서 단백질 분해 활성은 낮은 균주로 5종 균주를 선별하여 상기 곰팡이 균주들의 생육에 필요한 탄수화물 종류를 확인하였다.
구체적으로, 하기 표 5의 각 탄수화물이 첨가된 배지에 OF5-8, OF5-18, IF13-4, IF18-2 또는 IF20-25 균주의 포자 현탁액(4.1 × 109 개/㎖ spore) 300 ㎕를 접종하고, 28℃에서 6일간 배양하였다. 탄수화물 발효에 따른 이산화탄소 형성 유무를 확인하기 위하여 0.1% BTB(bromo thymol blue) 용액을 첨가하고 24시간 후 색 변화를 관찰하였으며, 푸른색(염기성)에서 노란색(산성)으로 변할수록 이산화탄소가 많이 생성된 것으로 판단하였다.
탄수화물 OF5-8 OF5-18 IF20-25 IF18-2 IF13-4
Glucose +++ +++ ++ + ++
Galactose ++ ++ +++ ++ ++
Sucrose ++ ++ +++ ++ +++
Maltose ++ +++ ++ ++ +++
Lactose ++ ++ + + ++
Raffinose ++ ++ ++ + ++
Soluble starch +++ +++ +++ +++ +++
α-methyl-D-glucoside ++ - - + ++
-: 변화 없음
+: 약한 변화
++: 중간 정도의 변화
+++: 강한 변화
그 결과, OF5-8 및 IF13-4 균주는 시험한 모든 탄수화물에서 중간 정도 이상의 탄수화물 발효 반응을 보였고, OF5-18 및 IF20-25 균주는 알파-메틸-D-글루코시드(α-methyl-D-glucoside)가 첨가된 배지에서 반응을 보이지 않았다(표 5).
실험예 4. 5종 곰팡이 종균의 탄소원 이용 특성 확인
상기 5종 곰팡이 종균이 이용하는 탄소원을 확인하기 위하여, 15종 탄소원이 각각 첨가된 배지를 이용하여 곰팡이 종균의 균체 성장을 측정하였다.
구체적으로, MEA 배지(malt extract 3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)의 탄소원인 맥아 추출물(malt extract) 대신 하기 표 6의 각 탄소원을 2%씩 접종하여 배지를 제조하였다. 5종 곰팡이 종균의 포자 현탁액(4.1 × 109 개/㎖ spore) 20 ㎕씩을 상기 MEA 고체 배지에 접종하여 28℃에서 4일간 배양한 후, 균체 성장능의 변화를 조사하였다.
탄소원 OF5-8 OF5-18 IF20-25 IF18-2 IF13-4
Sucrose +++ +++ +++ ++ ++
Lactose + ++ ++ ++ ++
Mannose +++ +++ +++ ++ ++
Rhamnose ++ ++ ++ ++ ++
Galactose + ++ ++ ++ ++
Fructose ++ +++ ++ +++ ++
Maltose ++ ++ ++ ++ ++
Glycerol + ++ ++ +++ +
Melibiose + ++ ++ ++ +
Xylose + +++ +++ ++ ++
Inositol + +++ ++ +++ +++
Mannitol ++ +++ ++ +++ +++
Sorbitol ++ +++ ++ +++ ++
Arabinose ++ +++ ++ +++ +++
Lactate + - - - ++
-: 변화 없음
+: 약한 성장
++: 중간 정도의 성장
+++: 강한 성장
그 결과, OF5-8 균주를 제외한 대부분의 곰팡이는 수크로스(sucrose) 또는 말토스(maltose)와 같은 이당류보다는 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 만노스(mannose), 갈락토스(galgactose), 프럭토스(fructose) 등의 단당류를 많이 이용하였으며, 이 중 IF18-2 균주는 프럭토스, 아라비노스 등 단단류 외에도 이노시톨(inositol), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol) 등의 당알코올도 많이 이용하였다(표 6).
실험예 5. 5종 곰팡이 종균의 질소원 이용 특성 확인
상기 5종 곰팡이 종균이 이용하는 질소원을 확인하기 위하여, 6종 질소원이 각각 첨가된 배지를 이용하여 곰팡이 종균의 균체 성장을 측정하였다.
구체적으로, MEA 배지(malt extract 3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)의 질소원인 펩톤(peptone) 대신 하기 표 7의 각 질소원을 2%씩 접종하여 배지를 제조하였다. 5종 곰팡이 종균의 포자 현탁액(4.1 × 109 개/㎖ spore) 20 ㎕씩을 상기 MEA 고체 배지에 접종하여 28℃에서 4일간 배양한 후, 균체 성장능의 변화를 조사하였다.
질소원 OF5-8 OF5-18 IF20-25 IF18-2 IF13-4
NaNO3 + ++ ++ +++ ++
(NH4)2SO4 +++ +++ +++ ++ +++
NH4Cl ++ +++ +++ +++ +++
Beef Extract ++ ++ ++ ++ ++
Tryptone + ++ ++ ++ +++
KNO3 + ++ ++ ++ +++
-: 변화 없음
+: 약한 성장
++: 중간 정도의 성장
+++: 강한 성장
그 결과, OF5-8 균주는 황산암모늄((NH4)2SO4)이 첨가된 배지에서, OF5-18 및 IF20-25 균주는 황산암모늄 또는 염화암모늄(NH4Cl)이 첨가된 배지에서, IF18-2 균주는 질산나트륨(NaNO3) 또는 염화암모늄이 첨가된 배지에서, IF13-4는 황산암모늄, 염화암모늄, 트립톤(Tryptone) 또는 질산칼륨(KNO3)이 첨가된 배지에서 곰팡이의 자화능이 우수하게 나타났고, 특히 염화암모늄은 대부분의 곰팡이 생육에 유용한 질소원임을 알 수 있었다(표 7).
액체종균의 제조
상기 5종의 곰팡이 종균들을 각각 밀기울 배지에 동일한 포자수(108 개/㎖)로 접종하여 28℃에서 120 rpm으로 진탕배양하면서 5일간 배양한 후, 여과하여 액체종균을 제조하였다(도 5).
실험예 6. 2종 곰팡이 종균의 건조 방법에 따른 품질 비교
상기 실험예 1 및 2의 결과로부터 액화력 및 당화력이 우수한 2종 곰팡이 종균(IF18-2 및 IF20-25 균주)을 선별하여 건조 방법에 따른 품질을 비교하였다.
6-1. 건조 방법에 따른 시료 제조
상기 2종 곰팡이를 동결건조기(Ilshin Lab, 대한민국)를 이용하여 -40℃ 이하에서 48시간 동안 건조하거나, 오븐(Drying Oven, Cat. #. DS-80-3, 다솔과학, 대한민국)을 이용하여 50℃에서 18시간 동안 열풍건조하거나, 또는 하이브리드(Hybrid) 냉풍제습 건조기(HT&G Co., 대한민국)를 이용하여 35℃에서 24시간 동안 건조하여 각 시료를 제조하였다.
6-2. 건조 방법에 따른 2종 곰팡이 종균의 수분함량 확인
상기 실험예 6-1에서 제조한 각 시료의 수분함량을 수분 측정용 저울(MX-50, And Co., Ltd., 일본)을 이용하여 측정하였다.
균주명 수분함량(%)
동결건조 열풍건조 저온냉풍건조
IF18-2 3.86 ± 0.04 1.77 ± 0.14 2.5 ± 0.2
IF20-25 3.73 ± 0.02 1.80 ± 0.13 2.53 ± 0.29
그 결과, 상기 표 8에 나타난 바와 같이 건조 방법에 따라 수분함량에 차이가 나타남을 확인하였다.
6-3. 건조 방법에 따른 2종 곰팡이 종균의 미생물 오염도 확인
상기 실험예 6-1에서 제조한 각 시료의 미생물 오염도를 측정하였다.
구체적으로, 각 고체종균 시료 10 g을 취하여 멸균 백에 넣고 90 ㎖의 멸균 생리식염수를 가하여 균질기로 용해한 후, 멸균 생리식염수로 단계적으로 희석하여 PCA(plate count agar) 배지에 도말하였다. 이후, 배지에 나타난 균체 수를 계수하여 CFU/g으로 나타내었다.
균주명 미생물 오염도(CFU a /g)
동결건조 열풍건조 저온냉풍건조
IF18-2 (5.10 ± 0.58) × 102 (4.73 ± 1.53) × 102 (4.67 ± 6.02) × 102
IF20-25 (5.80 ± 2.64) × 102 (4.27 ± 4.04) × 102 (4.30 ± 4.35) × 102
aCFU: 집락형성단위(Colony-forming unit)
그 결과, 건조된 2종 균주의 오염 수치는 약 4 내지 5 × 102 CFU/g 정도로, 전반적으로 오염도가 낮았으며, 동결건조 방법보다는 열풍건조 또는 저온냉풍건조 방법으로 건조한 종균이 미생물 오염도가 낮게 나타났다(표 9).
6-4. 건조 방법에 따른 2종 곰팡이 종균의 포자수 확인
상기 실험예 6-1에서 제조한 각 시료의 포자수를 측정하였다.
구체적으로, 상기 2종 곰팡이 균주의 고체종균 1 내지 2 g을 준비하여 5% 트윈(tween) 용액 10 ㎖에 넣고, 1% 메틸렌 블루(methylene blue) 2 내지 3 방울을 가하여 묽게 희석한 후, 헤모사이토미터(hemocytometer)에 올려놓고 현미경을 이용하여 포자수를 검경하였다.
균주명 포자수(개)
동결건조 열풍건조 저온냉풍건조
IF18-2 (2.02 ± 4.92) × 108 (1.93 ± 2.75) × 108 (2.31 ± 5.99) × 108
IF20-25 (2.30 ± 5.47) × 108 (1.35 ± 4.13) × 108 (2.52 ± 6.9) × 108
그 결과, 저온냉풍건조 방법으로 건조한 종균의 포자수가 가장 많았으며, 특히 열풍건조 방법으로 건조한 종균에 비하여 약 1.2 내지 1.8배 높은 포자수를 나타냈다(표 10). 이를 상기 실험예 6-3의 결과와 종합하여 보면, 포자수는 높게 나타나면서 미생물 오염도가 낮은 저온냉풍건조 방법이 상기 곰팡이 균주들의 건조 방법으로 가장 적합한 방법임을 제시한다.
실험예 7. 2종 곰팡이 종균의 부형제 농도에 따른 포자수 확인
상기 2종 곰팡이 종균(IF18-2 및 IF20-25 균주)의 부형제인 트레할로스(trehalose) 농도에 따른 포자수를 확인하였다.
구체적으로, 상기 2종 곰팡이 종균을 부형제인 트레할로스를 0, 0.5, 1 또는 2%로 첨가한 후, 상기 실험예 6에 기재된 것과 동일한 방법으로 저온냉풍건조하였다. 이후, 각 건조된 고체종균에 락토밀(Lactomeal)을 처리하고, 양면 금속 접착제를 사용하여 스텁(stub)에 부착하고, 스퍼터 코팅기(sputter coater, WI-RES-Coater-001)의 챔버(chamber)에 넣은 후 금으로 코팅하였다. 이를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM; SU8820, Hitachi, 일본)으로 5 kV에서 2,000 ×의 배율로 사진을 찍어 종균의 형태를 관찰하였다.
그 결과, IF20-25 균주는 트레할로스를 1% 첨가한 경우에, IF18-2 균주는 트레할로스를 0.5% 첨가한 경우에 부형제가 포자를 잘 감싸고 있어 공극 사이가 촘촘하였고, 특히 IF18-2 균주에서 트레할로스를 0.5% 첨가한 경우에 트레할로스를 무처리하거나 다른 농도로 첨가한 경우에 비하여 더 많은 포자를 형성하고 있음을 확인하였다(도 6). 이는 IF18-2 균주에 트레할로스를 0.5%로 첨가하는 방법이 제형화에 가장 적합한 조건임을 제시한다.

Claims (10)

  1. 20 내지 60%(w/w)의 당을 포함하는 배지에서의 생장에 내성을 가지는 기탁번호 KACC93289P로 기탁된 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) IF18-2 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 만노스(mannose), 람노스(rhamnose), 갈락토스(galactose), 프럭토스(fructose), 말토스(maltose), 글리세롤(glycerol), 멜리비오스(melibiose), 자일로스(xylose), 이노시톨(inositol), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol) 및 아라비노스(arabinose)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 탄소원으로 이용하는, 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 질산나트륨(NaNO3), 황산암모늄((NH4)2SO4), 염화암모늄(NH4Cl), 쇠고기 추출물(Beef Extract), 트립톤(Tryptone) 및 질산칼륨(KNO3)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 질소원으로 이용하는, 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 균주는 글루코스(glucose), 갈락토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 라피노스(raffinose), 용해성 전분(soluble starch) 및 알파-메틸-D-글루코시드(α-methyl-D-glucoside)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 탄수화물을 발효시키는, 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주.
  7. 제1항의 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 20 내지 40℃의 냉풍을 이용하여 건조하는 단계를 포함하는, 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주의 건조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 건조는 12 내지 120시간 동안 수행되는 것인, 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주의 건조 방법.
  9. 제1항의 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 트레할로스(trehalose)가 0.1 내지 2.0%(w/w)로 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 막걸리용 종균의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양된 아스퍼질러스 오리재 IF18-2 균주를 20 내지 40℃의 냉풍을 이용하여 건조하는 단계를 더 포함하는, 막걸리용 종균의 제조방법.
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