KR20180055418A - 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 프로테아제 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재 tna15 및 tna24 균주 및 이의 용도 - Google Patents

알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 프로테아제 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재 tna15 및 tna24 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15 및 TNA24 균주에 관한 것으로, 본 발명의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15 및 TNA24 균주는 고분자인 전분을 저분자인 이당류나 단당류로 분해하는 데에 관여하는 알파-아밀라아제 고활성능을 가짐과 동시에 글루코아밀라아제 고활성능을 가지고 또한 프로테아제 활성능을 가지므로, 누룩 발효의 최적 조건 성립에 기여할 것이며, 더불어 양조, 유기산 발효, 녹말분해효소와 같은 효소제품제조 등 발효공업 분야에서 다양하게 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 프로테아제 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재 TNA15 및 TNA24 균주 및 이의 용도{Aspergillus oryzae TNA15 and TNA24 strains having excellent alpha-amylase, glucoamylase and protease secretion activity and uses thereof}
본 발명은 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 프로테아제 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재 TNA15 및 TNA24 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
전통적 발효 스타터(starter)인, 자연 혼입 미생물의 혼합 배양물로 이루어진 누룩은 알코올 음료 양조에 광범위하게 이용된다. 누룩과 연관된 다양한 자연 세균총은 전통 알코올 음료 제조와 연관된 당화, 발효 및 숙성의 주된 세 가지 프로세스를 촉진한다. 진균 종(fungal species)은 당화 프로세스에 관련되어 있는 반면, 효모는 발효 프로세스를 보조한다.
아시아에서 누룩곰팡이 속(Aspergillus)의 균주들은 알코올 발효에 있어 중요한 균주로 알려졌다. 또한, 일본 및 중국에서 코지(koji)는 알코올 발효의 당화 및 숙성 프로세스에 크게 기여한다고 알려져 있다. 누룩곰팡이(Aspergilli)는 알코올 발효 동안 녹말분해 효소뿐만 아니라 단백질가수분해 효소, 예를 들어 α-아밀라아제, 산 프로테아제, 글루타미나제 및 메탈로펩티다아제를 생산한다. 상기 효소들은 복합 탄수화물 및 단백질을 분해하여, 발효용으로 효모에 의해 이용되는 당류 및 더 작은 펩티드들을 생성한다.
플라비(Flavi) 섹션(section)의 누룩곰팡이, 특히 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae)가 분비성 히드롤라아제를 다량 생산하여 고체 상태 발효에서 효과적인 것으로 널리 공지되어 있다. 그러나, 아스퍼질러스 속 균주 중 일부는 강력한 발암물질로 공지된 이차대사 산물인 아플라톡신을 생산하는데, 그들의 형태적 및 계통발생적 유사성 때문에 타 균주들과 거의 구분이 불가능하다. 발효 산업에서 사용되는 균주들의 중요성 때문에, 비독소 생성의 고도의 당화 누룩곰팡이 균주들의 적절한 선발에 따른 정확한 분류가 더욱 안전하고 효율적인 스타터의 생산에 필수적이다.
미토콘드리아 시토크롬 b 유전자, 내부 전사된 스페이서(ITS) 영역, 칼모듈린 유전자(CF) 및 아플라톡신 유전자 클러스터의 서열 분석을 포함한 분자적 접근이 누룩곰팡이 속 균주의 상이한 종들을 동정하기 위해 오랫동안 이용되어 왔다. 각각의 방법이 종들 사이에서의 계통발생론적 관계에 대한 중요한 정보를 제공했음에도, 단독으로 모든 종의 누룩곰팡이 속 균주를 동정하는 것은 불가능했다.
한편, 한국공개특허 제2011-0115923호에서는 '글루코아밀라제 및 알파아밀라제를 발현하는 효모 및 이를 이용한 에탄올 제조 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 프로테아제 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재 TNA15 및 TNA24 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 상이한 온도 및 습도 조건 하에 전통적 밀-기반 누룩 시료들로부터 입수가능한 균주를 가능한 많이 분리하였고, 그 중 1차로 ITS(internal transcribed spacer) 및 CF(calmodulin gene) 유전자 서열을 근거로 유전자적 유연관계 및 분류학적 위치를 조사하여 아스퍼질러스 섹션 플라비(Aspergillus section Flavi) 균주임을 확인하였고, 2차로 아플라톡신 생산 여부를 norB-cypA 영역 증폭을 통해 확인하여 아플라톡신 비생성 균주인 아스퍼질러스 오리재 및 아플라톡신 생성균주인 아스퍼질러스 플라부스로 동정하였으며, 3차로 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 활성을 조사하여 당화능을 평가한 결과, TNA15 균주 및 TNA24가 현저히 뛰어난 점을 확인하였으며, 이를 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24로 각각 동정함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 곡물에 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주를 접종하여 누룩을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 누룩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 누룩을 사용하여 곡물을 당화시킨 후, 효모로 발효시켜 제조된 발효주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주 또는 상기 균주들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 누룩 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명은 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15 및 TNA24 균주에 관한 것으로, 본 발명의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15 및 TNA24 균주는 고분자인 전분을 저분자인 이당류나 단당류로 분해하는 데에 관여하는 알파-아밀라아제 고활성능을 가짐과 동시에 글루코아밀라아제 고활성능을 가지고 또한 프로테아제 활성능을 가지므로, 누룩 발효의 최적 조건 성립에 기여할 것이며, 더불어 양조, 유기산 발효, 녹말분해효소와 같은 효소제품제조 등 발효공업 분야에서 다양하게 활용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 전통 밀-기반 누룩에서 분리된 아스퍼질러스 섹션 플라비 균주들의 ITS 서열을 근거로 한 분류학적 위치를 보여주는 최대 유사 계통수를 나타낸다. 대조균 균주 아스퍼질러스 오리재 KACC40247, 아스퍼질러스 플라부스 KACC41403, 및 아스퍼질러스 플라부스 KACC45441가 비교용으로 포함하였다. 관련 분류군이 부트스트랩 테스트에서 함께 무리를 이루는 복제수(1000개의 복제개체수)의 백분율을 분지들 다음에 제시했다. 진화 분석을 MEGA7에서 수행했다. 부위마다 치환된 것의 갯수에서 측정된 분지 길이를 이용해 복제수를 일정한 비율로 나타냈다.
도 2는 전통 밀-기반 누룩에서 분리된 아스퍼질러스 섹션 플라비 균주들의 칼모듈린 서열을 기준으로 분류학적 위치를 나타내는 최대 유사 계통수를 나타낸다. 대조균 균주 아스퍼질러스 오리재 KACC40247, 아스퍼질러스 플라부스 KACC41403, 및 아스퍼질러스 플라부스 KACC45441를 비교용으로 포함하였다. 관련 분류군이 부트스트랩 테스트에서 함께 무리를 이루는 복제수(1000개의 복제개체수)의 백분율을 분지들 다음에 제시했다. 진화 분석을 MEGA7에서 수행했다. 부위마다 치환된 것의 갯수에서 측정된 분지 길이를 이용해 복제수를 일정한 비율로 그렸다.
도 3은 전통 밀-기반 누룩에서 분리된 아스퍼질러스 섹션 플라비 균주들의 norB-cypA 영역의 PCR 증폭 결과이다. 블랭크 레인에는 PCR 앰플리콘이 제공되지 않았다.
도 4는 아플라톡신의 검출을 위한 아스퍼질러스 섹션 플라비 균주들의 배양 브로쓰 추출물의 TLC 분석을 나타낸다. 아스퍼질러스 오리재 KACC40247를 아플라톡신 대조군으로서 포함했으며, 아스퍼질러스 플라부스 KACC41403 및 아스퍼질러스 플라부스 KACC45442를 아플라톡신생성 양성 대조군으로 포함했다. 아스퍼질러스 플라부스로부터 분리된 아플라톡신 B1(미국 뉴욕의 파밍데일 소재의 Enzo Life Sciences 사 제품)을 양성 대조군으로 이용했다.
도 5는 아스퍼질러스 섹션 플라비 분리 균주들의 배양 상등액의 α-아밀라아제 활성을 나타낸다. 균주 TNA15, TNA24 및 TNA59은 대조군보다 현저히 더 높은 α-아밀라아제 활성을 나타냈다. ANOVA로 산출된 데이터 셋트에서의 유의차는 * (p < 0.01)로 나타낸다.
도 6은 아스퍼질러스 섹션 플라비 분리 균주들의 배양 상등액의 글루코아밀라아제 활성을 나타낸다. 균주 TNA24, TNA15 및 TNA59은 대조군보다 현저히 더 높은 글루코아밀라아제 활성을 나타냈다. ANOVA로 산출된 데이터 셋트에서의 유의차는 * (p < 0.01)로 나타낸다.
도 7은 아스퍼질러스 섹션 플라비 분리 균주들의 배양 상등액의 산 프로테아제 활성을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 프로테아제 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재 TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주를 제공한다.
본 발명에서 전통적 밀-기반 누룩 시료들로부터 균주를 분리하였고, 그 중 1차로 ITS(internal transcribed spacer) 및 CF(calmodulin gene) 유전자 서열을 근거로 유전자적 유연관계 및 분류학적 위치를 조사하여 아스퍼질러스 섹션 플라비(Aspergillus section Flavi) 균주임을 확인하였고, 2차로 아플라톡신 생산 여부를 norB-cypA 영역 증폭을 통해 확인하여 아플라톡신 비생성 균주인 아스퍼질러스 오리재 및 아플라톡신 생성균주인 아스퍼질러스 플라부스로 동정하였으며, 3차로 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 활성을 조사하여 당화능을 평가한 결과, TNA15 균주 및 TNA24가 현저히 뛰어난 점을 확인하였으며, 이를 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24로 각각 동정하여 한국생명공학연구원(KCTC)에 아스퍼질러스 오리재 TNA15 균주는 기탁번호가 KCTC18510P로, 아스퍼질러스 오리재 TNA24 균주는 기탁번호가 KCTC18511P로 2016년 11월 15일에 기탁하였다.
또한, 본 발명은 곡물에 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주 또는 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주를 접종하여 누룩을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 곡물은 밀, 수수, 메밀, 쌀보리, 율무, 팥, 차조, 기장, 보리, 찹쌀, 쌀보리, 현미, 흑미, 녹두, 찹쌀흑미, 현미찹쌀 또는 멥쌀일 수 있고, 바람직하게는 밀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 곡물에 상기 균주를 접종하여 누룩을 제조하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 제조할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 누룩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 누룩을 사용하여 곡물을 당화시킨 후, 효모로 발효시켜 제조된 발효주를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 발효주는 막걸리, 약주 또는 청주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 누룩을 사용하여 곡물을 당화시킨 후, 효모로 발효시켜 제조하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 제조할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주 또는 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주 또는 상기 균주들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 누룩 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 누룩 제조용 스타터(starter)란 누룩 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 누룩 제조 시에 첨가함으로써 발효된 누룩에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 누룩 제조용 스타터를 사용하여 누룩을 제조하는 경우, 상기 누룩 제조용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 누룩의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 누룩에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 등을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주, 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주 또는 상기 균주들의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 누룩의 최적 발효에 기여할 것이다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
균주의 분리 및 배양 조건
네 가지 유형의 전통 밀-기반 누룩 유래의 아스퍼질러스 속 균주의 분리는 콜로니 형상을 기준으로 Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol 아가(DRBC 아가, 미국 마이애미주 디트로이트 소재의 Difco Laboratories 사 제품) 상의 희석 플레이팅에 의해 수득했다. 상기 분리균을 감자 덱스트로오스 아가(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재의 BD Bioscience 사 제품) 플레이트 상에서 유지했고, 25℃에서 3시간 동안 배양했다. 이후, 균주 포자들을 0.05%(w/v) Tween 20을 함유하는 5mL 멸균 0.85%(w/v) NaCl 상에 재현탁시키고, 계수하여, 아플라독신 및 생화학적 검정을 위한 상이한 배지에 동등한 수로 접종했다. KACC40247(아스퍼질러스 오리재), KACC41403(아스퍼질러스 플라부스) 및 KACC45442(아스퍼질러스 플라부스)를 대조군 균주로 이용했다.
분리한 균주의 분자적 특징 분석
분리한 균주의 분자적 특징 분석을 위해, Bal 등의 문헌(Bal et al., 2014 J Microbiol;52:1025-9)에 기재된 프로토콜에 따라 모든 분리 균주들로부터 DNA를 추출했다. rRNA 유전자 및 부분적 칼모듈린 유전자의 ITS 영역을 분자적 동정을 위해 각 분리균주로부터 서열분석했다. ITS 영역(18S rRNA 유전자의 스패닝 파트, ITS1, 5.8S rRNA 유전자, ITS2, 및 28S rRNA 유전자의 일부분)을 하기의 프라이머쌍을 이용하는 프라이머쌍(ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 영역)을 이용해 증폭했다: 정방향 ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'(서열번호 1) 및 역방향 ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'(서열번호 2)). 칼모듈린(CF)을 하기의 프라이머쌍을 이용해 증폭했다: 정방향 CF1M(5'-AGG CCG AYT CTY TGA CYG A-3'(서열번호 3)) 및 역방향 CF4(5'-TTT YTG CAT CAT RAG YTG GAC-3'(서열번호 4)). 분리 균주들의 독소생성 특성을 확인하기 위해, norB 및 cypA의 유전자간 부위 및 5' 코딩 서열 부분을 프라이머 AP1729(5'-GTG CCC AGC ATC TTG GTC CAC C-3'(서열번호 5) 및 AP3551(5'-AAG GAC TTG ATG ATT CCT C-3'(서열번호 6))를 이용해 PCR로 증폭했다. PCR 수행 후, 생성물을 정제하고, 서열분석하여 BLASTn 검색(www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 확인했다.
분리된 균주들의 분류학상의 위치를 결정하기 위해, 서열분석 데이터를 Kimura 2-파라미터 모델(Kimura et al., 1980 J Mol Evol 16:111-120)을 기반으로 한 최우추정법을 이용해 분석했다. 이어서, 이들 데이터를 MEGA7(Kumar et al., 2016 Mol Biol Evol 33:1870-1874)를 이용하여 계통수를 구축했다. 각 계통군에 대한 근거를 결정하기 위해, 1000회 복제를 이용해 부트스트랩 분석을 실시했다.
효소 활성의 정량
① α- 아밀라아제 활성
α-아밀라아제 활성을 측정하기 위해, 성숙 배양 플레이트로부터 수집한 포자 106개/mL를 0.5% KH2PO4, 0.1% NaNO3, 0.5% 가용성 전분, 1% 펩톤 및 0.1% MgSO4·7H2O을 함유하는 배지에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 배양했다. 조효소 추출물로서 배양 여과액을 13000rpm에서의 원심분리로 수합했다. 이어서, 1% 전분 용액을 소듐 포타슘 타르트레이트 용액 및 96mM 3,5-디니트로살리실산 용액으로 이루어진 발색 시약과 혼합하고, 15분간 끓인 후, 540nm에서의 비색계 관찰에 의해 α-아밀라아제 활성을 평가했다. 말토오스를 표준으로 이용해 표준 곡선을 그리고, 방출된 말토오스의 양을 근거로 효소 활성을 산출했다.
② 글루코아밀라아제 활성
글루코아밀라아제 활성을 다음과 같은 과정에 따라 측정했다. 간략하게, 균 효소들에 의해 생산된 글루코오스의 양을 퍼옥시다아제/글루코오스-옥시다아제 효소법을 이용해 시료 및 블랭크 모두에서 측정하고, 블랭크 용액의 것에서 반응 혼합물 중의 글루코오스 농도를 차감하여 전체 글루코오스 생산을 산출했다. 글루코아밀라아제 활성(units/mL)을 전체 글루코오스 생산으로부터 산출했다. 글루코아밀라아제 활성의 1 unit은 일반적인 검정 조건 하에 시간당 1 mg 글루코오스의 방출을 촉매하기 위해 필요한 효소의 양으로서 정의된다.
③ 산 프로테아제( acid protease ) 활성
산 프로테아제 활성을 다음과 같이 평가했다. 간략하게, 37℃에서 평형화된(equilibrated) 5mL 0.65% 카제인 용액을 효소 용액(0.5mL)과 혼합하여, 37℃에서 10분 동안 배양한 후, 5mL 110 mM 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가해 반응을 중단했다. 1mL 여과액 중의 TCA-가용성 펩티드의 양을 5mL 0.4M 소듐 카보네이트 용액 및 1mL Folin-Ciocalteu's 페놀 시약(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma 사 제품)과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하여 측정했다. 660nm에서의 흡광도를 증류수와 대비하여 측정했다. 보정 곡선을 L-타이로신 표준 용액(0.05 내지 0.5몰)을 이용해 구축했다. 산 프로테아제 활성의 1 unit은 1 마이크로몰의 방출을 촉매하기 위해 필요한 효소의 양으로 정의했다.
아플라톡신 검정
YES 배지(수크로오스 60g/L, 효모 추출물 20g/L)에 포자 106개/mL를 접종하고, 180rpm로 30℃에서 5일 동안 배양했다. 이어서, 0.1mL 클로로포름을 1mL 배양 현탁액에 첨가하고, 강하게 진탕했다. 유도된 아플라독신을 TLC 플레이트(Silica gel 60 F254; 미국 뉴저지주 화이트하우스 스테이션 소재의 Merck 사 제품)에 스팟팅하여, 디에틸 에테르-메탄올-물(96:3:1)에서 전개시켰다. 진행된 플레이트를 건조시키고, 스팟들을 UV 광(365nm) 하에 가시화했다.
통계적 분석
데이터의 통계적 분석을 Windows용 SPSS 버젼 18(미국 일리노이주 시카고 소재의 SPSS Inc. 사 제품)를 이용해 실행했다. 변량분석(ANOVA)을 실시해 유의차를 결정하고, 평균 효소 활성들 사이에서 구별하여 실행했다. α-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 산 프로테아제 활성들 사이의 관계를 조사하기 위해, 피어슨 상관계수(Pearson's correlation coefficients)를 산출해, Mac 용 GraphPad Prism 버젼 6.00을 이용해 분석했다.
실시예 1. 분리균의 분자적 특징 분석
본 발명에서는 온도 및 습도의 다변화를 포함한 상이한 조건 하에서 발효된 전통 밀-기반 누룩으로부터 아스퍼질러스 균주들을 분리하여, 그들의 독소 생성능 및 효율을 평가했다. DRBC(dichloran rose-bengal chloramphenicol)는 박테리아 오염 없이 진균 및 효모의 성장을 조절할 수 있는 최적의 배지이므로, 본 발명자의 선행 연구(Bal et al., 2014 J Microbiol 52:1025-1029) 유래의 전통 밀-기반 누룩의 일련의 희석된 현탁액을 DRBC 플레이트에 적용하고, 모상(floccose)의 회색빛이 도는 황색 내지 올리브색 콜로니들인 총 69가지로 추정되는 아스퍼질러스 균주를 분리했다. ITS 및 CF 유전자 서열과 관련하여 분자적 근거로 추가의 분류학적 동정을 실시했다.
정렬 및 BLASTn 검색(www.ncbi.nlm.nih.gov) 상에서 모든 분리 균주들의 ITS 및 CF 서열들이 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 플라부스에 대해 99% 서열 유사성을 나타냈다. 그러나, ITS 및 CF의 두 가지 서열의 분석이 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 플라부스를 명확하게 구별해 주지는 못했다. 따라서, 수득한 모든 분리 균주들이 아스퍼질러스 섹션(section) 플라비에 속하는 것으로 추정했다.
대조군 균주와 비교해 분리된 균주들의 유전자적 유연관계 및 분류학적 위치를 추가로 조사하기 위해, 최대 유사 계통수를 MEGA7를 이용해 분석했다(도 1 및 도 2). ITS 서열로부터 추론된 계통수는 메주로부터 분리된 대조군 균주 아스퍼질러스 오리재 KACC40247와 함께 밀접하게 무리를 이루는 11개의 분리 균주를 보여줬으며, 4개의 분리 균주는 대조군 균주 아스퍼질러스 플라부스 KACC45441와 구분이 불가했다. CF 서열로부터 추론된 계통수는 오직 3개의 분리 균주가 대조군 균주 아스퍼질러스 플라부스(KACC41403, KACC45441)와 밀접하게 무리를 이루는 것을 밝혀냈다. 그러나, 이들 중 어느 것도 ITS 서열을 기준으로 임의의 아스퍼질러스 플라부스 기준 균주들과 무리를 이루는 것은 없었다. 이러한 결과는, 분리된 아스퍼질러스 및 아스퍼질러스 오리재 분리 균주들에서 상당한 정도의 유전자 다변성이 있긴 하지만, 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 플라부스는 그들의 ITS 및 CF 유전자 서열을 기준으로 구별하기 어렵다는 점을 시사한다. 추가로, 그러한 결과는 β-튜불린 및 칼모듈린 유전자 서열 및 표현형 특징이 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 플라부스를 구분하기에는 충분치 않다는 선행기술의 연구와 잘 들어맞는다(Hong et al., 2015 Mycobiology 43:218-24).
실시예 2. 분리균주들의 독소생성능의 평가를 통한 특징분석
선행기술에서 보고된 바와 같이, 형태적으로 그리고 분류학적으로 아스퍼질러스 오리재와 아스퍼질러스 플라부스 사이의 가까운 유연관계 때문에, 아플라톡신 생산능력 분석은 그들을 구분하는 유일한 수단이다. 아스퍼질러스 오리재는 아플라톡신을 생산하지 않아서, 아스퍼질러스 플라부스의 길들여진 형태로 간주된다. 아플라톡신 생산능 평가를 위해, norB 및 cypA의 유전자간 부위 및 5' 코딩 서열의 부분들을 증폭하여 분석했다. norB-cypA 영역의 증폭 분석은 3개의 밴드 패턴을 나타냈다: 0.8kb, 0.3kb 및 밴드 없음(도 3). 대조구 균주 KACC40247(아스퍼질러스 오리재)는 0.3kb의 밴드를 보인 반면, KACC41403(아스퍼질러스 플라부스)는 norB-cypA 영역의 PCR 증폭 상에서 0.8kb 밴드를 나타냈는데, 이는 아플라톡신 생산을 담당하는 norB - cypA 영역에서의 결실 패턴과 비슷했다. 69개의 분리 균주들 중에서, 32개는 0.3kb 밴드를 나타낸 반면, 나머지 37개는 norB-cypA 영역의 PCR 증폭 상에서 밴드를 나타내지 않았다. 32개 분리 균주의 0.3kb 밴드는 대조군 아스퍼질러스 오리재 균주의 것과 비슷했다. 따라서, 그러한 32개 분리 균주들은 아플라톡신을 생산할 수 없을 것이기에 안전한 것으로 간주되었다.
norB-cypA 영역이 증폭되지 않는 나머지 37개 분리 균주들은 TLC를 이용해 배양 배지에서의 통상적인 아플라톡신 생산 시험을 통해 아플라톡신 생산능에 대해 추가로 시험했다(도 4). 클로로포름-추출 배양 여과액을 TLC 플레이트 상에 스팟팅하고, 아스퍼질러스 플라부스로부터 분리된 아플라톡신 B1과 전개했다. 아플라톡신은 UV 광 하에서 37개의 추출물에서 전혀 검출되지 않아, 본 발명에서 누룩곰팡이 분리 균주들의 무독소 생성능을 확인케 했다. 나아가, 아플라톡신 생산능의 부재로, 분리 균주들은 전부 아스퍼질러스 오리재로 분류될 수 있었다. 선행기술에서, 아플라톡신을 생성하지 않는 메주 균주들은 아스퍼질러스 오리재로 정했으며, 아플라독신 생성 균주들은 아스퍼질러스 플라부스로 정했다(Hong et al., 2013 Mycobiology 51:766-72).
실시예 3. 분리 균주의 당화능 평가
누룩곰팡이 균주를 동정하여 특징분석하기 위한 본 발명자의 다상적 접근법(polyphasic approach)에서의 최종 단계는 세포외 효소 활성 스크리닝이다. 대조구 균주와 함께 모든 69개의 분리 균주들을 배양 배지에서 α-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 산 프로테아제 활성에 대해 분석했다. 10개의 분리 균주들은 대조군 균주 KACC40247에 비해 비교적 높은 α-아밀라아제 활성을 갖고 있으며; 분리 균주 TNA24 및 TNA15은 각각 2.13±0.12 units/mL 및 2.08±0.15 units/mL로, 최고 α-아밀라아제 활성을 보여줬다(도 5). 대조군 아스퍼질러스 오리재 KACC40247의 활성은 1.12±0.12 units/mL였다.
글루코아밀라아제의 경우, 45개의 분리 균주들이 대조군 균주(KACC40247, KACC41403)보다 더 높은 활성을 가졌고; TNA15 및 TNA24인 분리 균주들이 0.43±0.04 units/mL 및 0.25±0.01 units/mL의 최고 활성을 나타낸 반면(도 6), 대조군 아스퍼질러스 오리재 균주의 활성은 0.12±0.03 units/mL였다. 더 높은 α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제 활성을 나타낸 10개의 분리 균주들을 통계적으로 더 분석하여, 대조군 균주와 비교한 유의차를 체크했다. 시험한 10개의 분리 균주들 중에서, 세가지 분리 균주 TNA24, TNA15 및 TNA59의 효소 활성은 대조군 아스퍼질러스 오리재 균주의 것보다 현저히 더 높았다. 그러한 결과는 누룩 발효에 더 나은 균주를 수득할 가능성을 시사한다.
α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제와 비교하여, 산 프로테아제 활성은 모든 분리 균주들에 있어서 덜 가변적이었다. 약 14개의 분리 균주들이 대조군 균주보다 약간 더 높은 활성을 가졌는데, 분리 균주 TNA28 및 TNA36들이 각각 0.76±0.002 units/mL 및 0.73±0.09 units/mL의 활성을 나타냈다(도 7).
상이한 효소 활성(α-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 산 프로테아제) 사이의 관계를 피어슨 상관관계 분석(Pearson's correlation analysis)으로 평가했다(p < 0.001). α-아밀라아제/글루코아밀라아제, α-아밀라아제/산 프로테아제 및 글루코아밀라아제/산 프로테아제의 상관 계수는 각각 0.663, 0.178 및 0.325였다. 그러한 결과는 누룩 유래의 아스퍼질러스 섹션 플라비 분리 균주에서의 α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제 활성 사이의 유의한(p < 0.001) 보통의 양의 상관관계성을 확인해 준다. α-아밀라아제/글루코아밀라아제 활성은 산 프로테아제 활성과는 낮은 상관성을 나타냈다.
결론적으로, 전통 밀 누룩에서 분리된 아스퍼질러스 섹션 플라비 균주들의 분자적 특징분석을 실행하여, 독소생성능 및 당화능을 분석했다. 균주 전부는 무독성이었으며, 몇몇은 대조군 균주에 비해 훨씬 더 높은 당화능력을 나타냈다. 그러한 데이터는 더욱 효율적이며 더욱 안전한 누룩 제조를 위한 매우 효율적인 아스퍼질러스 속 균주의 선발을 촉진할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18510P 20161115 한국생명공학연구원 KCTC18511P 20161115
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Aspergillus oryzae TNA15 and TNA24 strains having excellent alpha-amylase, glucoamylase and protease secretion activity and uses thereof <130> PN16391 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aggccgaytc tytgacyga 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tttytgcatc atragytgga c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtgcccagca tcttggtcca cc 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aaggacttga tgattcctc 19

Claims (7)

  1. 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주.
  2. 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주.
  3. 곡물에 제1항의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주 또는 제2항의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주를 접종하여 누룩을 제조하는 방법.
  4. 제3항의 방법에 의해 제조된 누룩.
  5. 제4항의 누룩을 사용하여 곡물을 당화시킨 후, 효모로 발효시켜 제조된 발효주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 발효주는 막걸리, 약주 또는 청주인 것을 특징으로 하는 발효주.
  7. 제1항의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA15(기탁번호: KCTC18510P) 균주 또는 제2항의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TNA24(기탁번호: KCTC18511P) 균주 또는 상기 균주들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 누룩 제조용 스타터(starter) 조성물.
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