KR101549152B1 - 대맥장 유래의 리조푸스 오리제 dm07 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대맥장 유래 리조푸스 오리제 (RHIZOPUS ORYZAE) DM07 (KACC 93187P) 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법에 관한 것이다.

Description

대맥장 유래의 리조푸스 오리제 DM07 균주{Novel RHIZOPUS ORYZAE sp. DM07 from Daemaekjang}

본 발명은 대맥장 유래 리조푸스 오리제 (Rhizopus oryzae) DM07 균주에 관한 것이다.

예전부터 우리 민족들의 주요 단백질 공급식품이었던 된장은 항암효과 등이 우수한 우리나라의 대표 발효식품으로서 이제 세계에서도 그 우수성을 인정받고 있다. 된장은 옛부터 콩으로부터 유래되는 단백질 등의 영양 공급원으로써 또한 각종 유익균들의 효소분해에 의한 각종 향미성분이 어우러진 조미식품으로서 이용되어 왔다. 특히 콩은 본초강목 등에 약용 목적의 하나로도 기록되어 있으며 세계적으로도 일본의 낫토 등에서 보는 바와 같이 콩을 이용하거나 발효를 시키는 과정을 통해 먹거리가 부족했던 그 당시의 영양의 섭취 및 생활 영위에 중요한 수단으로 사용되어져 왔으며, 최근에는 다양한 발효방법을 통하여 새로운 장류의 개발을 시도하고 있다.

예를 들어, 한국공개특허 10-2012-0072919에 나타난 검정콩 속성장(이하, 대맥장)의 경우, 검정콩과 보리가루를 이용하여 속성 발효시킨 것인데, 짧은 시간 내에 생성됨에도 높은 영양을 갖는다는 점에서 그 의미가 크다고 할 수 있다.

하지만, 된장은 제조과정에 있어서, 많은 곰팡이가 생성될 수 있는 문제점이 있다. 예를 들어, 곰팡이 독소 중에서도 가장 치명적인 것으로 알려진 아플라톡신 B1의 경우, 아스퍼질러스 플레이버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 파라사이티커스(Aspergillus parasiticus), 페니실리움 푸버루럼(Penicillium puberulum) 등이 생성하는 2차 대사산물로서 가축에 있어서 사망 또는 출산율의 감소와 연관되어 있고, 인간의 경우 발암 유기성, 기형 유발성 및 돌연변이 유발성이 보고되어 있다. 아플라톡신은 전 세계적으로 곡류, 땅콩, 옥수수 등에서 주로 발견되고 있는데 인간은 오염된 농산물을 통한 직접 섭취뿐 아니라, 우유 중의 아플라톡신 M과 같이 오염된 사료를 급여한 가축의 2차 생산물을 통해서 간접 섭취에까지 노출되어있는 실정이다.

이러한 아플라톡신 B1 등의 발생을 막기 위하여, 종래에는 항곰팡이성 물질들을 첨가하는 방안을 검토하였으나, 식품에 사용하기에는 적당하지 않다는 문제가 있었다.

하지만, 최근 생물학적 과학기술의 발전에 따라서, 상기 된장으로부터 얻을 수 있는, 각종 효능을 나타내는 균주에 대한 연구를 통하여, 이러한 문제점을 해결하려는 노력이 시도되어 왔다.

한국공개특허 10-2012-0072919

본 발명의 목적은 대맥장으로부터 유래된 발효와 관련된 효소를 생산하고 아플라톡신 B1을 생성하지 않는 발효 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 위하여,

본 발명은 대맥장 유래 리조푸스 오리제 (RHIZOPUS ORYZAE) DM07 (KACC 93187P) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 이용한 발효식품의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따라 대맥장으로부터 분리된 신균주인 리조푸스 오리제 DM07는 발효와 관련된 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease) 등의 효소를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 아플라톡신 B1을 생성하지 않으므로, 이를 이용하여 발효효소를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 품질이 월등하게 향상된 발효식품 제조할 수 있어 발효식품 분야에서 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 균주를 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 균주를 실체 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명의 균주의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 균주의 계통수상 위치를 유전자 염기서열에 기초하여 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 대맥장 유래 리조푸스 오리제 (RHIZOPUS ORYZAE) DM07 (KACC 93187P)균주 및 상기 균주를 이용한 발효식품의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 리조푸스 오리제 (RHIZOPUS ORYZAE) DM07 균주 (이하, DM07 균주)이며, 상기 DM07 균주는 한국공개특허 10-2012-0072919호의 방법으로 제조된 대맥장로부터 본 발명의 발명자에 의하여 분리되어 동정되었으며, 이는 농촌진흥청 KACC에 기탁되어 있으며, (KACC 93187P)의 수탁번호를 부여 받았다. 본 발명에서는 상기 기탁균주를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 DM07 균주는 발효 효소의 활성이 우수한 것을 특징으로 한다. 구체적으로는 아밀라아제(amylase)와 같은 전분분해효소 또는 프로테아제(protease)와 같은 단백질분해효소 등의 발효 효소의 활성이 우수하기 때문에, 전분 또는 단백질에 대하여 우수한 활성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 DMD07 균주는 아플라톡신 B1(Aflatoxin B1)을 생성하지 않는 것을 특징으로 한다.

아플라톡신은 Aspergillus속 곰팡이 종류의 2차 대사산물로서 사람이나 가축, 어류 증에 생리적 장애를 일으키는 물질이며 특히 아플라톡신 B1(aflatoxin B1)은 사람에게 디메틸니트로아민(dimethylnitrosamine)보다 약 3,750배나 높은 발암독성 물질로 알려져 있다. 이러한 아플라톡신에는 aflatoxin B1을 비롯하여 16종의 이성체가 현재까지 밝혀져 있고, 그 중에서 아플라톡신 B1이 가장 널리 알려져 있다.

상기 아플라톡신 B1은 가축에 있어서 사망 또는 출산율의 감소와 연관되어 있고, 인간의 경우 발암 유기성, 기형 유발성 및 돌연변이 유발성이 보고되어 있기 때문에 식품 등에 포함될 경우 큰 문제를 일으킬 수 있다.

본 발명은 상기 리조푸스 오리제 DM07 균주를 이용한 발효식품의 제조 방법을 제공한다.

상기 발효식품은 발효를 통하여 제조되는 것이라면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 장류 및 주류 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 대맥장류일 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 상세하게 설명하지만, 하기에 개시되는 본 발명의 실시 형태는 어디까지 예시로써, 본 발명의 범위는 이들의 실시 형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 범위는 특허청구범위에 표시되었고, 더욱이 특허 청구범위 기록과 균등한 의미 및 범위 내에서의 모든 변경을 함유하고 있다.

실시예

대맥장 (검은콩 속성장 ) 메주( BSM )의 제조

한국공개특허 10-2012-0072919에 기재된 방법에 따라, 대맥장의 메주를 제조하였다. 대맥장 메주(Black soybean meju: BSM) 검은콩을 24시간 수침한 뒤, 증자하고 마쇄하였다. 14 kg의 분쇄한 콩과 6 kg의 보리가루, 2 kg의 콩 삶은 물을 넣고 반죽하였다. 이 반죽을 400 g 무게로 지름 12 cm × 높이 3 cm의 disc 모양으로 빚어 그늘에서 1일 건조시켰다. 건조한 메주를 50% 상대 습도, 28℃에서 7일간 발효 시키고, 하루 동안 건조기를 이용하여 건조하였다.

균주의 분리

상기 제조한 대맥장 메주를 고운 가루로 분쇄한 후, 0.85% saline buffer에 단계 희석하고 potato dextrose agar (PDA Difco, Detroit, MI, USA), malt extract agar (MEA Difco), 그리고 yeast peptone dextrose agar (YPD Difco)에 도말하였다. 25℃에서 3 일간 배양한 후, 콜로니를 새 배지에서 5 일간 배양하였다. 순수 배양된 곰팡이 균주는 -80°C에 보관하였다.

상기 방법에 따라서, 대맥장으로부터 100여 균주(fungi) 분리하였으며, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Rhizopus, Absidia, Eurotium, Setomelanomma, Mucor, Pichia, 그리고 Davidiella 등 10가지 속의 곰팡이로 밝혀졌다.

상기 얻어진 곰팡이 균주를 도 1에 나타내었다.

형태학적 특성에 의한 동정

곰팡이 분리 균주를 PDA와 MEA 배지에 1 point inoculation하여 25℃에서 7일간 배양하였다. 배양 후 콜로니의 배양특성과 색소 형성 등을 기재 하였으며, conidia, hyphae, conidial head, conidiophores, spores 등을 현미경(AXIO A2 Imager Upright Microscope Zeiss, Gottingen, Germany)으로 관찰하여 형태학적 동정을 시행하였다.

본 발명의 DM07 균주는 도 2에서와 같이, 형미경 형태학적으로 격벽이 없는 균사가 공기 중으로 길게 신장하고 거미줄의 집락을 만드는 것으로 대표적인 접합균류인 거미줄곰팡이로 동정되었다. 이는 직경 150-300 um 구형의 갈색 포자낭(sporangia)이 있으며, 메주의 향미에 영향을 미치는 것으로 보고되었다.

분자생물학적 동정 및 계통 분류

(1) genomic DNA 추출

분리 균주를 MEB 배지를 이용하여 30℃에서 배양한 후, 균체를 수거하고 동결건조하였다. 건조된 균체를 고운 가루로 분쇄하고 LETS buffer [20 mM EDTA (pH 8.0), 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 M LiCl, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS)]를 첨가하여 잘 섞었다. 이 현탁액을 phenol-chloroform-isoamyl alcohol solution (25:24:1)에 두 번 추출하고 에탄올 침전시킨다. 침전된 DNA를 70% 에탄올에 washing한 후 실온에서 10분간 건조하고, 10 mM Tris buffer (pH 8.0)에 녹인 후 2ug의 RNase (10 mg/ml) 를 첨가하고 65℃에서 10분간 처리하였다.

(2) ITS 및 β-tubuling gene PCR 및 sequencing

ITS gene PCR을 위하여 프라이머ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), Bt2a(5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3') Bt2b(5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3')를 사용하였다. 서열분석은 SolGent Co., Ltd. (Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. 분석된 염기서열을 도 3에 나타내었다.

(3) 계통 분류

Sequence data를 BioEdit v. 7.0 프로그램으로 최적화한 후, CLUSTAL-X v. 1.81을 이용하여 alignment하였고, MEGA v. 4.0 프로그램을 이용하여 neighbor-joining (NJ) tree를 작성하였다. Kimura-2-parameter distance model을 사용하였으며, Confidence values는 1000 replication bootstrap 분석으로 도출하였다. 분리 균주의 종 동정을 위하여 서열 결과를 BLAST 프로그램으로 분석하여, 이를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, RHIZOPUS ORYZAE NRRL 2710과 100%에 가까운 가장 높은 상동성을 보였다. 따라서 본 발명의 DM07 균주은 리조푸스 오리제(RHIZOPUS ORYZAE) MD07로 동정하였다.

Rhizopus oryzae DM07 의 발효관련 효소활성 분석

본 발명의 DM07 균주의 발효관련 효소의 활성도를 알아보기 위하여, Rhizopus oryzae 균주인 Rhizopus oryzae PR03과 아밀라아제 및 프로테아제의 활성을 비교하였다.

프로테아제 활성은 Anson의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 추출액 1 mL에 0.6% casein기질용액(0.2 M phosphate buffer, pH 7.0) 를 넣고 37°C에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 0.44 M trichloroacetic acid(TCA) 5 mL를 넣어 반응을 중지시켰다. 실온에서 30분간 방치한 다음 여과지(No.2, Whatman)에 여과한 여액 2 mL에 0.55 M Na₂CO₃용액 5 mL와 3배 희석된 Folin reagent 용액 1 mL를 넣어 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit은 1분동안 tyrosine 1 ug을 유리시키는 양을 환원하여 나타내었다

알파-아밀라아제 활성은 1% 전분 기질액(pH 7.0) 3 mL에 효소액 1 mL를 넣고 반응(40℃, 10 min)시킨 후, 반응액 1 mL에 0.1 M HCl 10 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 1 mL에 0.005% I2-0.05% KI용액 10 mL를 넣어 발색시킨 후, 흡광도(660 nm)를 측정하였다. 조효소액 1 mL이 1분 동안 전분 0.1 mg을 분해한 양을 1 unit으로 계산하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

	균주	Amylase enzyme (unit/mL)	Protease enzyme (unit/mL)
실시예 1	Rhizopus oryzae DM07	0.81 ± 0.02	15.27 ± 0.90
비교예 1	Rhizopus oryzae PR03	0.04 ± 0.00	9.33 ± 0.52

상기 표 1에서와 같이, 본 발명의 DM07 균주는 PRO03 균주에 비하여 높은 Amylase(전분분해효소) 및 Protease(단백질분해효소)활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다. 이는 장류의 주재료인 콩의 구성성분이 단백질, 탄수화물 및 지방으로 이루어져 있다는 점에서, 본 발명의 DM07균주가 우수한 발효특성을 이용하여 우수한 종균으로 사용될 수 있다 것을 알 수 있었다.

Rhizopus oryzae MD07 의 아플라톡신 ( Aflatoxin B1) 생성량

본 발명의 MD07 균주가 아플라톡신(Aflatoxin B1)을 억제능을 확인하기 위하여, Rhizopus oryzae 균주인 Rhizopus oryzae KACC40256 및 Aspergillus flavus KACC46449와 아플라톡신(Aflatoxin B1)의 검출여부를 비교하였다.

아플라톡신(Aflatoxin B1)의 검출은 곰팡이의 안정성을 측정하기 위하여 aflatoxin B1 ELISA Kit를 이용하여 분석하였다. 샘플 전처리는 MEA broth 배지에 곰팡이는 포자 수를 1×10⁷로 접종하여 5~7일 배양 후, membrane filter를 이용하여 여액을 시료로 사용하였다. 그리고 aflatoxin B1 Kit 방법에 따라 양을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	Sample	aflatoxin B1(ug/L)	Status
실시예 1	Rizopus oryzae DM07	0.018	-
비교예 2	Rizopus oryzae KACC40256	0.027	-
비교예 3	Aspergillus flavus KACC46449	0.802	+

식품위생법상 장류(메주제외)에서의 아플라톡신 (B1+B2+G1+G2)의 검출한계는 15 ug/kg이하이며, 특히 아플라톡신 B1의 경우는 10 ug/kg 인데, 상기 표 2에서와 같이 실시예 1 및 비교예 2는 각각 0.018 ug/L, 0.027 ug/L으로 거의 검출되지 않았으나, 비교예 3의 A. flavus의 경우, 장류에서의 위험수치와 가까운 0.8 ug/L로 분석되었다. 이를 통하여, 본 발명의 DM07 균주가 아플라톡신 B1의 거의 생성하지 않는 것을 알 수 있었다.

한국농업미생물자원센터 KACC93187P 20131029

Claims (7)

1. 아플라톡신 B1(Aflatoxin B1)을 생성하지 않는, 대맥장 유래 리조푸스 오리제 (RHIZOPUS ORYZAE) DM07 (KACC 93187P) 균주.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 균주는 아밀라아제(amylase) 또는 프로테아제(protease)의 활성이 우수한 것을 특징으로 하는 대맥장 유래 리조푸스 오리제 DM07 균주.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 리조푸스 오리제 DM07 균주를 이용한 발효식품의 제조 방법.
   
6. 청구항 5에 있어서,
   발효식품이 장류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 장류는 대맥장인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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