RU2499039C1 - Штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности - Google Patents
Штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности Download PDFInfo
- Publication number
- RU2499039C1 RU2499039C1 RU2012144545/10A RU2012144545A RU2499039C1 RU 2499039 C1 RU2499039 C1 RU 2499039C1 RU 2012144545/10 A RU2012144545/10 A RU 2012144545/10A RU 2012144545 A RU2012144545 A RU 2012144545A RU 2499039 C1 RU2499039 C1 RU 2499039C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- aspergillus oryzae
- rcam01135
- proteolytic
- amylolytic
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов - обладает способностью продуцировать протеолитические и амилолитические ферменты. Депонирован в ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM01135. Может быть использован при получении различных пищевых продуктов (ферментированных приправ, добавок, напитков). Изобретение позволяет повысить скорость роста и интенсивность спорообразования. 4 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению штамма - продуцента протеолитических и амилолитических ферментов, и может быть применено для гидролиза растительных и животных субстратов в пищевой промышленности, бродильных производствах, сельском хозяйстве.
Известно, что мицелиальный гриб Aspergillus oryzae имеет широкое применение в пищевой промышленности, так как не обладает патогенными свойствами. Биосинтез протеаз и амилаз, характерный для представителей Aspergillus oryzae, используется, например, при изготовлении некоторых пищевых продуктов (ферментированных приправ, ферментированных напитков), когда требуется гидролиз белков и углеводов (RU 2361914, 2009, RU 2187947, 2002).
Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-369, обладающий способностью продуцировать комплекс протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне pH, α-амилазу. Однако основным недостатком этого штамма является отсутствие синтеза сопутствующих гидролаз, а также длительный период роста и развития микромицета; штамм интенсивно продуцирует α-амилазу и протеазу на жидких средах лишь на четвертые - пятые сутки (SU 1440922, 1988).
Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-683, продуцирующий комплекс кислых и слабокислых протеаз, α-амилазы и сопутствующих ксиланаз, глюканаз и цитаз. Известно, что при глубинном культивировании данный штамм продуцирует целый комплекс высокоактивных ферментов. Получаемые ферментные комплексы применяются в пищевой промышленности.
Однако применение штамма является ограниченным из-за недостаточно высокой скорости роста и особых требований к питательным средам, так как он растет на средах с содержанием сухих веществ не более 18% (RU 2070921, 1996).
Задача изобретения состоит в получении штамма Aspergillus oryzae, продуцирующего протеазы и α-амилазу, обладающего высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании.
В качестве изобретения предлагается новый штамм микромицета Aspergillus oryzae 37-53, полученный методом многоступенчатой селекции и мутагенеза, депонированный в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под регистрационным номером RCAM01135. Штамм является продуцентом протеаз и α-амилазы, обладает высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании, и интенсивным спорообразованием.
Техническим результатом изобретения является более высокая скорость роста предлагаемого штамма Aspergillus oryzae RCAM01135.
В частности, на средах с соевым шротом максимумы протелитической и амилолитической активностей проявляются на третьи сутки культивирования, и интенсивность спорообразования была самой высокой также на третьи сутки. Это позволяет рассматривать заявленный штамм как перспективное средство для использования в пищевой промышленности для переработки сельскохозяйственного сырья, например сои, с целью получения различных пищевых вкусоароматических добавок, в бродильном производстве, хлебопекарной промышленности.
Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические признаки:
а) характер роста (опушение, край колонии). Колонии пушистые, округлой формы, края ровные, мицелий белый, спорообразующий, цвет колонии от оливкового до темно-зеленого. Вегетативный мицелий септированный, хорошо разветвленный с крупными вздутиями, толщина гиф 6-12 мкм; конидии формируются экзогенно, поверхность конидии гладкая, форма округлая, диаметр спор 5-6 мкм; образует конидиальные головки с одноярусными стеригмами;
б) размер колонии (при определенном времени инкубации). На 3 сутки роста на сусло-агаре диаметр колонии 50×51 мм;
в) воздушный мицелий (наличие, цвет, особенности спороношения). С обильным спороношением темно-зеленого цвета. По краю колонии белый пушистый мицелий 3 мм;
г) цвет субстратного мицелия. Белый;
д) цвет обратной стороны колонии. Светло-коричневый;
е) другие признаки (пигмент, экссудат и т.д.). Пигменты не выделяются, экссудат отсутствует;
ж) изменения культуры по мере старения. Цвет колонии с возрастом темнеет, становится буро-зеленым;
з) поведение на других средах. На среде Чапека с глюкозой: на 3 сутки роста цвет колонии - зеленый, поверхность гладкая; диаметр колонии 32×34 мм.
По исследованиям морфологических признаков культуры проведена идентификация штамма в соответствии с определителем мицелиальных грибов (Билай В.И., Коваль Э.С. Аспергиллы. Определитель. - Киев: Наук. Думка, 1988, - 204 с.).
Физиолого-биохимические признаки
Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста - 28-30°C. Максимальная температура - 50°C. Минимальная температура - 18°C. Оптимальное значение pH для роста гриба - 5,5. Рост гриба отмечается в диапазоне pH от 2,5 до 10,0.
В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин и лактозу. Ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки. Штамм не патогенный. В режиме глубинного и твердофазного культивирования была установлена способность к синтезу ферментов амилолитического и протеолитического действия.
Штамм хранится на агаризованном солодовом сусле 8% CB; pH среды - естественный; температура хранения +20-25°C.
Пример 1
Глубинное и твердофазное культивировстие штамма Aspergillus oryzae RCAM01135
Глубинное культивирование штамма Aspergillus oryzae 37-53 осуществляли на различных комплексных естественных средах, составленных с учетом физиологических потребностей продуцента. При конструировании питательных сред принимали во внимание то обстоятельство, что для синтеза протеаз и α-амилазы благоприятны крахмал, белки, поэтому основными компонентами среды являлось зерновое сырье. В качестве источника фосфорного питания для микромицета применяли фосфорнокислый калий. Таким образом, для глубинного культивирования штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 были использованы питательные среды следующего состава, %:
1. Ячменная мука - 3,0, пшеничные отруби - 3,0, крахмал - 2,0, KH2PO4 - 1,5;
2. Пшеничная мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH2PO4 - 1,5%;
3. Соевая мука - 6,0, ячменная мука - 5,0, KH2PO4 - 1,5;
4. Соевая мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH2PO4 - 1,5;
Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 50 см3 стерильной питательной среды, на круговой качалке с числом оборотов 220 об/мин при температуре 30°C. Полученные результаты представлены в табл.1.
Таблица 1 | ||||||
Глубинное культивирование гриба Asp.oryzae RCAM01135 на натуральных питательных средах | ||||||
№ среды | Сутки | Рост (густота, цвет КЖ) | pH | РСВ, % | Ферм, акт-сть, ед./см3 | |
ПС | АС | |||||
1 | 1 | ++бежевая каша | 4,74 | 4,0 | - | - |
2 | +хаки (желтоватая) каша | 4,8 | 2,8 | 1,5 | 0,64 | |
3 | +хаки (желтоватая) жижа | 5,36 | 2,2 | 1,8 | 0,82 | |
2 | 1 | ++++бежевая каша | 5,09 | 3,0 | - | - |
2 | ++хаки (желтоватая) каша | 5,42 | 2,0 | 1,3 | 0,93 | |
3 | ++хаки светлая жижа | 5,6 | 2,2 | 1,5 | 1,10 | |
3 | 1 | +++++очень густая бежевая каша | 5,69 | 5,0 | - | - |
2 | темная бежевая каша | 7,6 | 5,0 | 0,05 | 0,35 | |
3 | ++++хаки темная каша | 8,46 | 5,4 | 0,03 | 0,56 | |
4 | 1 | +++++густая бежевая каша | 7,10 | 5,0 | - | - |
2 | темная бежевая каша | 8,33 | 4,9 | 0,06 | 0,35 | |
3 | +++хаки темная каша | 8,73 | 5,4 | 0,02 | 0,12 |
Как видно из таблицы 1, селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 на питательных средах, содержащих ячменную или пшеничную муку, а также пшеничные отруби (среды №1 и 2), проявлял способность к синтезу протеаз и α-амилазы: общая протеолитическая активность на 3-и сутки культивирования составила 1,5-1,8 ед. ПС/см3, амилолитическая 0,82-1,10 ед. АС/см3. На средах, в состав которых входила соеваая мука (среды №3 и 4), уровень активности синтезируемых ферментов снижался в 2-3 раза.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на пшеничных отрубях с влажностью 52,4% и на соевом шроте с влажностью 51,8% при температуре 30°C в стационарных условиях. Полученные результаты представлены в табл.2.
Таблица 2 | |||||
Поверхностное культивирование гриба A.oryzae RCAM01135 на различных средах | |||||
Среда для культивирова ния |
Характеристика роста гриба, сутки | Ферментативная активность, ед./г | |||
2 | 4 | 7 | ПС | АС | |
Отруби | Белый мицелий, начало спорообразования, цвет спор зеленый | Обильное спорообразование, споры пылят, цвет зеленый с оливковым оттенком | Без изменений | 43,5 | 9,0 |
Соевый шрот | 1 | 2 | 3 | 41,0 | 12,0 |
Белый мицелий | Обильное спорообразование, цвет спор зеленый с оливковым оттенком | Обильное спорообразование, споры оливкового цвета |
Результаты глубинного и твердофазного культивирования подтверждают биосинтетическую способность селекционированного штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 по отношению к протеолитическим и амилолитическим ферментам, что характерно грибам рода Aspergillus вида oryzae.
Таким образом, полученный штамм хорошо развивается на жидких и твердых питательных средах, синтезирует ферменты протеолитического и амилолитического действия и идентифицирован как мицелиальный гриб Aspergillus oryzae.
Пример 2
Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 на средах с соевым шротом
Наработку экспериментальных образцов селекционированной культуры Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на среде с соевым шротом и на соевом шроте с добавлением 10% перловки с разной влажностью в течение 3-х суток при 30°C (табл.3).
Таблица 3 | ||||
Биохимическая характеристика экспериментальных образцов гриба A.oryzae RCAM01135 | ||||
Среда для культивирова ния |
Влажность поверхн. культуры, % | Биохимические показатели гриба | ||
Белок по Кьельдалю, % а.с.в. | Белок по Лоури, мг/г а.с.в. | мг%/г а.с.в. |
||
Соевый шрот | 58,7 | 43,0 | 35,0 | 317,0 |
Соевый шрот +10% перловки | 51,3 | 41,0 | 52,8 | 309,7 |
62,4 | 44,3 | 58,3 | 322,5 |
Экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были получены в результате ускоренного роста микромицета при поверхностном культивировании на соевом шроте, обогащены белком, аминным азотом и могут быть использованы для дальнейшей переработки в производстве продуктов ферментации сои.
Селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 и наработанные экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были исследованы в Испытательной лаборатории технохимического контроля и арбитражных методов анализа ГНУ ВНИИПБТ Россельхоакадемии.
Результаты испытаний по идентификации ГМИ показали, что в чистой культуре микромицета Aspergillus oryzae RCAM01135 трансгенные последовательности отсутствуют (протокол испытаний от 23 марта 2012 г.).
При анализе тяжелых металлов в экспериментальных образцах гриба A. oryzae RCAM01135 было установлено, что их содержание не превышает предельно допустимых концентраций (протокол от 18 апреля 2012 г.). В таблице 4 приведены результаты анализа по содержанию тяжелых металлов в субстрате - соевом шроте и в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135. Аналогичные результаты получены во всех исследуемых экспериментальных образцах.
Таблица 4 | ||||
Содержание тяжелых металлов в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135 | ||||
Анализируемый объект | Содержание тяжелых металлов, мг/кг | |||
Свинец Pb | Мышьяк As | Кадмий Cd | Ртуть Hg | |
Соевый шрот | 0,0052 | 0,0034 | 0,0027 | 0,0009 |
(ПДК для сои)1 (1СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов») | 0,5 | 0,3 | 0,1 | 0,02 |
Поверхностная культура гриба A.oryzae 37-53 | 0,0065 | 0,0047 | 0,0029 | 0,0014 |
Claims (1)
- Штамм микромицета Aspergillus oryzae, депонированный в ГНУ ВНИИСХМ (Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения - RCAM) под регистрационным номером RCAM01135, - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012144545/10A RU2499039C1 (ru) | 2012-10-19 | 2012-10-19 | Штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012144545/10A RU2499039C1 (ru) | 2012-10-19 | 2012-10-19 | Штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2499039C1 true RU2499039C1 (ru) | 2013-11-20 |
Family
ID=49710125
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012144545/10A RU2499039C1 (ru) | 2012-10-19 | 2012-10-19 | Штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2499039C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2557300C1 (ru) * | 2014-04-11 | 2015-07-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИПБТ) | ШТАММ ГРИБА Aspergillus oryzae - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ И ПЕПТИДАЗ, НУКЛЕАЗ, ХИТИНАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, МАННАНАЗЫ И АЛЬФА-АМИЛАЗЫ |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1654335A1 (ru) * | 1987-10-12 | 1991-06-07 | Армянский Филиал Всесоюзного Научно-Исследовательского Института Химических Реактивов, Особо Чистых Химических Веществ И Реактивов Для Хроматографии | Способ выделени ферментных препаратов аминоацилазы, амилазы и протеаз из ASpeRGILLUS oRYZae |
RU2070921C1 (ru) * | 1993-10-19 | 1996-12-27 | Любовь Вячеславовна Римарева | Штамм гриба aspergillus oryzal - продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов |
RU2315095C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ α-АМИЛАЗЫ |
RU2315096C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ, ПЕПТИДАЗ, β-ГЛЮКАНАЗЫ, α-АМИЛАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ |
RU2354697C2 (ru) * | 2007-03-19 | 2009-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae - продуцент кислой альфа-амилазы |
-
2012
- 2012-10-19 RU RU2012144545/10A patent/RU2499039C1/ru active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1654335A1 (ru) * | 1987-10-12 | 1991-06-07 | Армянский Филиал Всесоюзного Научно-Исследовательского Института Химических Реактивов, Особо Чистых Химических Веществ И Реактивов Для Хроматографии | Способ выделени ферментных препаратов аминоацилазы, амилазы и протеаз из ASpeRGILLUS oRYZae |
RU2070921C1 (ru) * | 1993-10-19 | 1996-12-27 | Любовь Вячеславовна Римарева | Штамм гриба aspergillus oryzal - продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов |
RU2315095C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ α-АМИЛАЗЫ |
RU2315096C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ, ПЕПТИДАЗ, β-ГЛЮКАНАЗЫ, α-АМИЛАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ |
RU2354697C2 (ru) * | 2007-03-19 | 2009-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae - продуцент кислой альфа-амилазы |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2557300C1 (ru) * | 2014-04-11 | 2015-07-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИПБТ) | ШТАММ ГРИБА Aspergillus oryzae - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ И ПЕПТИДАЗ, НУКЛЕАЗ, ХИТИНАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, МАННАНАЗЫ И АЛЬФА-АМИЛАЗЫ |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lin et al. | Cultivating conditions influence lipase production by the edible Basidiomycete Antrodia cinnamomea in submerged culture | |
Abu-Tahon et al. | Anticancer and antifungal efficiencies of purified chitinase produced from Trichoderma viride under submerged fermentation | |
Rani et al. | Isolation and screening of L-asparaginase producing fungi from soil samples | |
Kamath et al. | Optimization of cultural conditions for protease production by a fungal species | |
Niyonzima et al. | Screening and optimization of cultural parameters for an alkaline protease production by Aspergillus terreus gr. under submerged fermentation | |
Ravikumar et al. | A protease from the medicinal mushroom Pleurotus sajor-caju; production, purification and partial characterization | |
Thakaew et al. | Inhibitory activity of Bacillus subtilis BCC 6327 metabolites against growth of aflatoxigenic fungi isolated from bird chili powder | |
RU2315097C1 (ru) | Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы | |
Tremacoldi et al. | Production of extracellular acid proteases by Aspergillus clavatus | |
KR101605069B1 (ko) | 전통 장류식품 미생물을 이용한 소금의 나트륨 제거방법 및 이에 의해 생산된 소금 | |
RU2499039C1 (ru) | Штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности | |
Ahmad et al. | Isolation and identification fibrinolytic protease endophytic fungi from Hibiscus leaves in Shah Alam | |
RU2315096C1 (ru) | ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ, ПЕПТИДАЗ, β-ГЛЮКАНАЗЫ, α-АМИЛАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ | |
Yu et al. | Optimization for rice koji preparation using aspergillus oryzae CJCM-4 isolated from a korean traditional meju | |
Upadhyay et al. | Screening and production of tumour inhibitory L-asparaginase by bacteria isolated from soil | |
KR101926183B1 (ko) | 안전성이 검증된 장류 발효 균주 및 이를 이용하여 제조된 장 | |
Kuz’min et al. | Xylotrophic fungus Trichoderma atroviride: cultivation, extracellular hydrolytic and antimicrobial activity | |
CN109938322A (zh) | 一株米曲霉za122及其应用 | |
Alhussaini | Mycobiota of wheat flour and detection of α-amylase and L-asparaginase enzymes | |
RU2315095C1 (ru) | ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ α-АМИЛАЗЫ | |
RU2557300C1 (ru) | ШТАММ ГРИБА Aspergillus oryzae - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ И ПЕПТИДАЗ, НУКЛЕАЗ, ХИТИНАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, МАННАНАЗЫ И АЛЬФА-АМИЛАЗЫ | |
RU2315098C1 (ru) | Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых и слабокислых протеаз | |
KR101549152B1 (ko) | 대맥장 유래의 리조푸스 오리제 dm07 균주 | |
Bano et al. | Optimization of culture conditions for the production of protease by Pleurotus eryngii | |
RU2070921C1 (ru) | Штамм гриба aspergillus oryzal - продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов |