SU1654335A1

SU1654335A1 - Способ выделени ферментных препаратов аминоацилазы, амилазы и протеаз из ASpeRGILLUS oRYZae

Info

Publication number: SU1654335A1
Application number: SU874315701A
Authority: SU
Inventors: Маркар Мкртычевич Амирханян; Валентин Михайлович Степанов; Оганес Мкртычевич Амирханян; Михаил Фрунзевич Еланян; Артур Оганесович Степанян; Константин Александрович Субботин; Ася Мироновна Миневич
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1987-10-12
Filing date: 1987-10-12
Publication date: 1991-06-07

Abstract

Изобретение относитс к технической микробиологии, касаетс получени ферментных препаратов из амило- ризина ПХ и может быть использовано в медицинской, химической, пищевой отрасл х промышленности, сельском хоз йстве. Целью изобретени вл етс упрощение процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов . В качестве исходного сырь испопьэуют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а фракционирование водных экстрактов осуществл ют спиртами или сульфатом аммони . Интервалы процентного содержани спиртов, при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35- 45% дл выделени протеазы, 45-50% дл выделени аминоацилазы и 72-75% дл выделени амилазы. Дл осаждени этих ферментных препаратов сульфатом аммони требуетс соответственно 50, 60 и 80% насыщени . (Л аъ ел -U оо со ел

Description

Изобретение относитс к технической микробиологии, касаетс получени ферментных препаратов из Амилоризина ПХ и может быть использовано в медицинской , химической, пищевой промыш- ленност х, в сельском хоз йстве, в медицине.

Целью изобретени вл етс упрощение процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов .

Изобретение заключаетс в том, что в качестве исходного сырь используют Амилоризин ИХ или поверхностную культуру его продуцента, а фракционирование водных экстрактов осуществл ют спиртами или сульфатом аммони . Интервалы процентного содержани спиртов , при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35-40% дл выделени протеазы, 45-50% дл выделет ни аминоацилаэы и 72-75% дл выделе10

ни амилазы. Дл осаждени этих фер- ментных препаратов сульфатом аммони требуютс соответственно 50%, 60% и 80% насыщени .

Пример 1. Ферментные препараты выдел ют из высушенной культураль- ной массы A.oryzae, наделенной следующими активност ми, ед./г: амилоли- тическа 160; протеолитическа 2,3; аминоацилазна 40 ед/г. Этот препарат выпускаетс под названием Амилори- зин ИХ.

В литровую трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термомет- J5 ром и капельной воронкой, помещают 30 г Амилориэина ПХ, добавл ют 200 мл дистиллированной воды и при 25 С, рН 7,0 и перемешивании осуществл ют экстракцию в течение 2 ч. Значение рН 20 поддерживают добавлением 2 н, водного раствора гидроокиси натри . Затем фильтруют на воронке Бюхнера. Осадок выбрасывают, а фильтрат, содержащий ферменты, центрифугируют на центрифу- 25 ге при 2°С и 4000 об/мин в течение 20 мин.

Супернатант перенос т в колбу, охлаждают до 0-1°С и при перемешива10

J5 20 25

4335

вакууме при 50-60°С досуха. Этанол используют повторно дл той же цели. Осадок, содержащий 53% аминокислот, в том числе незаменимые аминокислоты, валин, триптофан, лейцин, фенилала- нин, используют дл получени балансированных кормов.

П р и м е р 2. Процесс провод т аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве осадител используют изопропиловый спирт, конечные концентрации которого соответственно равны: 35% при выделении протеазы, 45% аминоацилазы и /5% - амилазы.

Активности ферментных препаратов протеазы, аминоацилазы н амилазы составл ют 20, 220, 1650 ед/r, а выход 26, 53 и 59% соответственно,

П р и м е р 3. Процесс провод т аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве осадителей ферментных препаратов используют сульфат аммони . Препараты перед лиофильной сушкой подвергают диализу против холодной дистиллированной воды.

В 20-литровый стекл нный аппарат марки Simax, снабженный линией дл охлаждени рассолом, мешалкой и тер

нии добавл ют этанол до получени 40% -$0 мометром, помещают 10 л водного экстсодержани последнего. Выпавший осадок , представл ющий собой препарат протеазы, отдел ют центрифугированием в вышеуказанных услови х, раствор ют

ракта, полученного из 1,5 кг Амило- ризина ПХ. Пускают в ход мешалку и при рН 7,0 и температуре 2°С небольшими порци ми добавл ют сульфат аммов минимальном объеме воды и сугаат лио-,, ни до получени 50% насыщени послед- фильно. Выход препарата по активности 33%, активность 26 ед/г.

Супернатант перенос т в колбу и в описанных услови х добавл ют этанол до получени 50% содержани спирта. 4Q

Выпавший осадок, представл ющий собой препарат аминоацилазы, отдел ют и сушат, как описано выше. Выход продукта по активности составл ет 78%. Аминоацилазна активность равна д5 720 ед/г.

Супернатант после выделени ферментных препаратов протеаэы и амино- ацилаэы перенос т в колбу и в описанных услови х добавл ют этанол до 75% 5Q содержани последнего. Выпавший осадок -амилолитический препарат отдел ют и сушат, как описано выше. Выход препарата по активности 76%. Амило- литическа активность равна 4000 ед/г.

Супернатант, представл ющий собой 75%-ный раствор этанола, содержащий низкомолекул рные белки, пептиды и аминокислоты, подвергают перегонке в

Ь5

него и оставл ют при 2-5°С в течение 16 ч. Выпавший осадок отдел ют центрифугированием при 3000 об/мин, раствор ют в минимальном объеме воды и перенос т в целлофановую пленку (сосисочную ) и осуществл ют диализ против холодной воды до полного удалени сульфат-иона. Отсутствие сульфат-иона провер ют 20% хлористого бари . Содержимое диализного мешка сушат лио- фильно.

Протеолитическа активность ферментного препарата 29,0 ед/г. Выход по активности 23,0%.

Супернатант перенос т в аппарат и в описанных услови х добавл ют сульфат аммони до получени 60% насыщени последнего.

Отключают мешалку и оставл ют при 2-5°С в течение 16 ч.

Выпавший осадок, представл ющий собой ферментный препарат аминоацила зы, подвергают диализу и сушат лист фильно, как описано выше.

мометром, помещают 10 л водного экстракта , полученного из 1,5 кг Амило- ризина ПХ. Пускают в ход мешалку и при рН 7,0 и температуре 2°С небольшими порци ми добавл ют сульфат аммони до получени 50% насыщени послед-

516

Аминоацилаэна активность препарата 850 ед/г. Выход продукта по активности 85%.; Супернатант после выделени амино- ацилазы перенос т в аппарат и при описанных услови х продолжают добавление до получени 80% насыщени сульфатом аммони . Отключают мешалку и содержимое аппарата оставл ют при 2-5°С в течение 16 ч.

Выпавший осадок, представл ющий собой ферментный препарат амилазы, отдел ют, подвергают диализу и лио- фильно сушат, как описано выше.

Амилолитическа активность препарата 12000 ед/г. Выход продукта по активности 21%.

П р и м е р А. Процесс провод т аналогично примеру 3 с той разницей, что высушивание ферментных препаратов осуществл ют этанолом непосредственно после осаждени , мину стадию диализа

Дл этого мокрые ферментные препараты из центрифужных стаканов перенос т в гомогенизатор, добавл ют охлажденный до минус 8-10°С этанол из расчета 25-30 мл на Ю г препарата и гомогенизируют в течение 3-5 мин. Фильтруют на воронке Бюхнера и сушат на воздухе в течение 10-12 ч.

Активность ферментных препаратов протеазы, аминоацилазы и амилазы составл ет 19,0, 587; 1100) ед/г, а выход 29, 71, 25% соответственно.

П р и м е р 5. Процесс осуществл ют аналогично примеру 1 с той разницей , что ферментные препараты получают в промышленных услови х из водного экстракта биомассы A.oryzae, выращенной поверхностным способом. Экстракцию провод т водопроводной водой, осаждение осуществл ют непрерывно при 7-12°С, препараты выдел ют на се- параторе-кларификаторе при 41/0 об/мин и после лиофильной сушки подвергают дроблению.

В экстрактор емкостью /00 л, снабженный механической мешалкой, помещают 120 кг биомассы A.oryzae влажностью 40%, выращенной на пшеничных отруб х , добавл ют 450 л водопроводной воды с температурой 30°С, пускают в ход мешалку и осуществл ют экстракцию в течение 1 ч. Затем насосом экстракт подают на фильтр-пресс, где осуществл ют отделение биошрота от выт жки. Выт жка поступает в напорный бак дл загр зненной выт жки, отхлаждаетс

0

335

до 5°С и оттуда поступает на центрифугу , где при 3000 об/мин очищаетс от взвешенных частиц.

Очищенна выт жка поступает в на- порный бак очищенной выт жки и оттуда через ротаметр в смесительную колонну диаметром 70 мм, высотой 11)00 мм. В эту же колонну из другого напорного бака через холодильник и другой ротаметр поступает этиловый спирт с температурой минус 10-12°С.

В смесительной колонне экстракт непрерывно смешиваетс с этанолом, при этом часть ферментов, присутствующих в экстракте, выпадает в осадок . Процентное соотношение этанола в отход щей водно-спиртовой смеси составл ет 40%. Осаждение происходит 0 при 11-12 С. Суспензи ферментов в водно-спиртовой смеси из смесител непрерывно поступает на сепаратор- кларификатор, где при 4170 об/мин отдел етс от последней. 5 Осадок, представл ющий собой ферментный препарат с протеазной активностью , выгружают из сепаратора-кла- рификатора на раскладочный стол, затем на кюветы. Кюветы с препаратом 0 устанавливают в камеру морозильного стола и замораживают до минус 30 С. Затем препарат сушат в течение 10- 14 ч в сублимационной сушилке марки КС-30 до температуры продукта 20°С.

Сухой препарат протеазы выгружают из сублимационной сушилки и подвергают дроблению на дробилке марки ДДК-36.

Протеолитическа активность ферментного препарата, названного Про- торизин, равна 31 ед/г. Выход препарата по активности составл ет 45%.

Водно-спиртовой раствор после выделени ферментного препарата посту- ., пает в другой напорный бак, снабженный змеевиком, лини ми рассола и воздуха , где при перемешивании воздухом охлаждаетс до 3-5°С. Из этого напорного бака водно-спиртова смесь через TQ ротаметр поступает в смесительную колонну , где подвергаетс осаждению.

Осаждение ферментов, их выделение, сушка и дробление осуществл ютс , как описано выше. Температура осаждени составл ет 8-10°С, а содержание этанола в смеси 50%.

Ферментный препарат обладает амино- ацилазной активностью, равной 650 ед/г. Выход по активности 76%.

40

5

Водно-спиртовой раствор после выелени ферментных препаратов протеа- зы и аминоацилаэы поступает в напорный бак и оттуда, охлажденный до 3- 5°С, через ротаметр поступает в смесительную колонну и подвергаетс осаждению . Осаждение ферментов, их выделение , сушка и дробление осуществл ютс , как описано выше. Температура осаждени 7-8вС, а содержание спирта в смеси 72%.

Амилолитическа . активность препарата составл ет 6000 ед/г. Выход по активности 82%. ормула изобретени

Способ выделени ферментных препаратов аминоацилаэы, амилаз и проте

1

543358

аэ из Aspergillus oryzae, включающий водную экстракцию исходного сырь , фракционирование спиртом или сульфатом аммони и сушку препаратов, отличающийс тем, что, с целью упрощени процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов, в качестве исходного сырь используют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а при фракционировании спиртом устанавливают концентрации: 35-40% дл выделени протеазы, 45-50% дл аминоацилазы, 72-75% дл амилазы или 50%, 60% и 80% насыщени соответственно при фракционировании сульфатом аммони .

10

15

Claims

.Формула изобретения

Способ вцделения ферментных препаратов аминоацилазы, амилаз и проте аз из Aspergillus oryzae, включающий водную экстракцию исходного сырья, фракционирование спиртом или сульфатом аммония и сушку препаратов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов, в качестве исходного сырья используют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а при фракционировании спиртом устанавливают концентрации: 35-402 для выделения протеазы, 45-502 для аминоацилазы, 72-752 для амилазы или 502, 602 и 80% насыщения соответственно при фракционировании сульфатом аммония.