SU1265216A1 - Способ выделени ферментных препаратов из технического ферментного препарата -амилоризин П10Х - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТЕХНИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА АМИЛОРИЗИН ПЮХ, предусматривак ций приготовление водного раствора исходного ферментного препарата , экстракцию и спиртовое осаждение целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью расширени  возможного спектра получени  ферментных препаратов, повышени  их выхода и активности, водный экстракт готов т при соотношешт ферментного препарата и воды, равном 1:32-33, а осаждение осуществл ют последовательно спиртовым фракционированием, .причем конечные концентрации спирта при фракционировании соответственАо равны 25-30% дл  выделени  протеазы, 4550% - аминоацилазы, 70-75% - амилазы , при этом полученные ферментные препараты подвергают сушке. 149 Од сд to Ф

Description

1 Изобретение относитс  к микробио логии, а именно касаетс  способа по лучени  ферментных препаратов ацилазы, амилаз ипротеаз из микроби ологического сырь  - амилоризина П10Х. Цель изобретени  - расширение во можного спектра получени  ферментны препаратов, повышение их выхода и активности. Способ заключаетс  в последовательном вьщелении из технического ферментного препарата амилоризина ПЮХ ферментных препаратов протеазы аминоацилазы и амилазы путем постепенного повышени  концентрации этан ла или изопропилового спирта при фракционировании. Способ осуществл етс  следую;йчим образом, : Пример 1, В двадцатилитро: вьтй стекл нный аппарат, снабженный змеевиком дл  охл.аждени , рассолом, мешалкой, капельной воронкой.и термометром помещают 3,5 л дистиллированной воды, 120 г амилоризина П10Х суспендированного в 0,5 л дастиллирвванной воды. Экстракцию ферментов осуществл ют при перемешивании при -22 С и рН 7,0 в течение двух часов .рН поддерживают добавлением 2 н. .раствора едкого натра). Затэм открывают рассол,, снижают температуру содержимого аппарата до -IC и тонкой струей при и рН 7,0 прибавл ют заранее охлажденный (-8°С) этанол до 25%-ного содержани . Выпавший ос док, представл ющий собой препарат протеаз, отдел ют центрифугирование на центрифуге К-70 при 3000 об/мин и температуре (-1)°С в течение 30 мин, раствор ют в минимальном: рбъеме воды и суыат лиофильно. Протеазна  активность ферментног препарата равна 29 ед/г, выход препарата по активности составл ет 47% Супернатант перенос т в аппарат и при перемешивании, температуре рН 7,0 тонкой струей прибавл  Ът охлажденный () этанол до 50%-ного содержани  последнего, Выпавший осадок, представл ющий собой ферментный препарат аминоацилазы, отдел ют центрифугированием, сушат лиофильно, Аминоацилазна  активность препар та равна 390 ед/г. Выход продукта п активности составл ет 95%. 6 Супернатант после выделени  ферментных препаратов протеазы и аминоацилазы перенос т в аппарат и в вышеуказанных услови х прибавл ют охлажденный этанол до 70%-ного содержани , Выпавший осадок амилолитического препарата отдел ют центрифугированием и сушат лиофильно, Амилолитическа  активность препарата равна 5300-ед/г. Выход препарата по активности составл ет 96%. Супернатант, представл ющий собой 70%-ный раствор этанола, содержащий низкомолекул рные белки, пептиды и аминокислоты подвергают перегонке в вакууме при 60°С, Этанол используют повторно дл  этой не цели, а водный раствор, содержащий вышеуказанные продукты3 концентрируют до получени  удельного веса, равного 1,1. Получают 120 мл продукта с ,l, содержащего 36,5 г сухих веществ, из которых 50% составл ют аминокисло ты , среди 1Л)торых имеютс  такие незаменимые аминокислоты, какими  вл ютс  метионин,, валик, лейцин, триптофан , фенилаланин. Пример 2, Процесс провод т аналогично примеру 1,с той разницей, что в. качестве спирта используют изопропиловый спирт, а конечные концентрации сгшрта соответственно равlibi: 30% при выделении протеаз, 45%аминоацилазы и 75% - амилаз. Получают ферментньш препарат с протеолитической активностью 25 ед/г, выход по активности составл ет 56%; BNMHOацилазы с активностью 293 ед/г выход по активности 92%; амилазы с активностью 6500 ед/г выход по активности 87%. Количество сухого аминокислотного препарата составл ет 23 г. Пример 3. Процесс провод т аналогично примеру 1, с той разницей , что высушивание препаратов осуществл ют этанолом. Дл  этого мокрые ферментные препараты из центрифужных стаканов перенос т в гомогенизатор, добавл ют охлажденный (-8°С) этанол из расчета 30 мл на 10 г препарата и гомогенизируют в течение 5 мин, фильтруют на jBOpOHKe Бюхнера и сушат на воздухе в течение 12 ч. Активности ферментных препаратов составл ют 26 а 410:, 6000 ед/г а выход 52, 97, 94%. ных препаратов на опытных установках в производственных услови х. Экстрак цию провод т водопроводной водой, осаждение осуществл ют непрерывно пр 7 С, препараты выдел ют на сепараторе-кларификаторе при 4170 об/мин и после лиофильной сушки подвергают дроблению, В экстрактор емкостью 700 л, снаб женный механической мешалкой помещают 200 л водопроводной воды с температурой 25°С, Суспендируют 11 кг ами лбризина П10Х в 163 л воды и перенос т в экстрактор. Соотношение ферментного препарата и воды составл ет 1:33. Экстракцию.осуществл ют при 25 С и рН 7,0 в течение двух часов (рН поддерживают прибавлением 2н, раствора едкого натра). Экстракт насосом перекачивают в напорный бак (№ 1), емкостью 1 м, снабженный змеевиком, лини ми рассола и воздуха. Подают умеренный ток воздуха и при перемешивании охлаждают содержимое бака до 3°С, Из напорного бака (№ 1) экстракт поступает через ротаметр в смесительную колонну диаметром 70 мм, высотой 1000 мм. В эту же колонну из напорного бака (№ 2), емкостью 50 м, через холо .дильник и второй ротаметр поступает этиловый гидролизный спирт с темпера турой -10°С, В смесительной колонне экстракт непрерывно смешиваетс  с этанолом, при этом часть ферментов, присутствующих в экстракте, выпадает в осадок. Процентное соотношение эта нола в водно-спиртовой смеси составл ет 25-26%. Осаждение происходит при -10°С. Суспензи  ферментов в вод но-спиртовой смеси из смесительной колонны непрерывно поступает на сепаратор-кларификатор , где при 4170 об//мин отдел етс  от водно-спиртовой сме си. Осадок, представл ющий собой ферментный препарат с протеазной активностью , выгружают из сепаратора-кларификатора на раскладочный стол, затем на кюветы. Кюветы с препаратом устанавливают в камере морозильного стола и замораживают до . Замороженный препарат помещают на этажер-55 ку, котора  устанавливаетс  в котле сублимационной сушилки, и сушат в течении 14 ч до температуры продукта 20°С. из сублимационной сушилки подвергают дроблению на дробилке. Протеолитическа  активность ферментного препарата равна 27 ед/г, вьпсод препарата по активности составл ет 60%. Водно-спиртовой раствор зкотрак- та после выделени  протеазы поступает в напорный бак (№ 3), емкостью 2,7 м , снабженный змеевиком, лини ми рассола и воздуха, где при умеренном перемешивании воздухом охлаждаетс  до 3°С, Из напорного бака (W 3) водноспиртова  смесь через ротаметр поступает в смесительную колонну, где непрерывно смешиваетс  с охлажденным (-8С) этанолом. Содержание этанола в смеси составл ет 51%. Осаждение происходит при -9°С, При этом часть ферментов, присутствующих в зодноспиртовом растворе, выпадает в осаДок . Выделение осадка, представл ющего собой ферментный препарат амнноадилазу , его высушивание и дробление осуществл ют как описано вьш1е. Аминоацилазна  активность ферментного препарата равна 430 ед/г, выход по активности составл ет 98%, Водно-спиртовой раствор после выделени  ферментных препаратовпротеазы аминоацилазы поступает в напорный бак (№ 1), охлаждаетс  до -5°С. Далее поступает в сме.сительную колонну, где смешиваетс  с этанолом . Содержание этанопа в смеси составл ет 71%, Осаждение происходит при -9°С, Суспензи  ферментов в водно-спиртовой смеси поступает на сепаратор и сепарируетс  при 41 70 об/мин. Осадок, представл ющий собой амиполитический ферментный препарат, выдел ют , высушивают и дроб т. Амилолитическа  активность ферментного препарата амилоризина (амилаза) равна 4500 ед/г, выход по активности составл ет 98%. Зависимость количества перешедшего в раствор белка от соотношени  амилоризина П10Х и воды представлена табл I. Из табл. видно, что соотношение амилоризина ПЮХ и воды, равное 1 : :(32-33),  вл етс  оптимальным и его выбор ограничен, с одной стороны, неполной экстракцией ферментов, т.е. неполным переходом белка в раствор при уменьшении количества воды (ког512

да соотношение равно 1:10), с другой стороны, тем, что увеличение количества воды (когда соотношение равно 1:40).не приводит к заметным изменени м , т.е. полна  экстракци  белки из водного раствора амилоризина П10Х происходит при за вленном соотношении.

Из табл. 2 видно, что изменение концентрации этанола, как в сторону уменьшени  нижнего предела (25%), так и в сторону увеличени  верхнего предела (50%), приводит к снижению выхода ферментного препарата. в табл. 2 дана зависимость выхода

амииоацилазы от изменени  концентрации этанола.

Таблица 1

Продолжение табл. I

Claims (1)

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТЕХНИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА АМИЛ0РИЗИН П10Х, предусматривающий приготовление водного раствора исходного ферментного препарата, экстракцию и спиртовое осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью расширения возможного спектра получения ферментных препаратов, повышения их выхода и активности, водный экстракт готовят при соотношении ферментного препарата и воды, равном 1:32-33, а осаждение осуществляют последовательно спиртовым фракционированием, при- § чем конечные концентрации спирта при фракционировании соответственйо равны 25-30% для выделения протеазы, 4550% - аминоацилазы, 70-75% - амилазы, при этом полученные ферментные препараты подвергают сушке.

   SU ,,1265216 А