SU981360A1 - Способ выделени комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов - Google Patents

Description

(5) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КИТОВ

Изобретение относитс  к технологии получени  протеолитических ферментов и может быть использовано в ферментной промышленности, а получаемый препарат - в медицине, пищевой промышленности.

Известен способ получени  комплекса протеолитических ферментов из морепродуктов - гепатопанкреаса промысловых видов крабов, включающий гомогенизйцию сырь  в воде, отстаивание гомогената, очистку полученной жидкой фазы от примесей путем введени  сульфата аммони  до насыщени  0,3 отде- jj ление осадка, фильтрацию, осаждение ферментов в фильтрате сульфатом аммони  до насыщени  0,8, растворение осадка с комплексом ферментов в дистиллированной воде, диализ и лиофили-20 зацию целевого препарата. Способ обеспечивает получение комплекса ферментов , содержащего трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы А и Б, лейцинаминопептидазу , щелочные и нейтральные протеазы .

Однако указанный способ обладает тем недостатком, что использование в качестве сырь  дл  получени  ферментов промысловых видов крабов нерентабельно из-за дефицитности этих видов. Способ включает много стадий выделени , что обуславливает длительность очистки целевого продукта и сказь1ваетс  на его себестоимости.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому  вл етс  способ выделени  комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов, предусматривающий гомогенизацию поджелудочной железы, дробную экстракцию 2 объемами и 1объемомО,25 N, раствора серной кислоты, доведение рН экстракта до 3,0, двухстадийное осаждение ферментов сульфатом аммони  до 20 и 0% насыщени . Фракцию, осажденную между 20 и 0 насыщени , раствор ют в 10 объемах 0,1 М боратного 3, 98 буфера, добавл ют 0,1 М раствор хлористого кальци  и активируют трипсином при +5С, Ферментный препарат диализируют против 0,001 N. раствора сол ной, кислоты на холоду, центрифугируют и сушат лиофилизацией. Выход протерлитического комплекса из 1 кг поджелудочной железы кита составл ет 1,8 г (по белку) 2. Известный способ характеризуетс  недостаточно высоким выходом и активностью ферментов, а также многостадий ностью процесса, за счет чего снижает с  выход ферментов и их активность. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода и активности ферментного комплекса при упрощении технологии, устранении кислотной экстракции, кото ра   вл етс  основной причиной снижени  активности. Поставленна  цель достигаетс  тем что согласно способу выделени  комплекса протео итических ферментов из поджелудочной железы китов, включающему гомогенизацию сырь , экстракцию осаждение ферментов, активацию комплекса трипсином и сушку, экстракцию и активацию комплекса ферментов осуществл ют одновременно в буфере рН 7,6-8,0, а трипсин используют в количестве 4-6 мг на 100 г гомогената, осаждение ферментов осуществл ют ацетоном с отделением полученного осадка центрифугированием. Обычно отделение осадка центрифугирован1 м осуществл ют при 6- тыс. об/мин, а сушку целевого продукта осу ществл ют при 20-2S C. За счет предлагаемой совокупности условий обработки поджелудочной железы китов способ обеспечивает получение комплексного ферментного препарата с высоким выходом - 10-11 г белка из 1 кг сырь , а казеинолитической активностью пор дка 50 и эстеразной 70-80% от исходной. П р и м е р 1. 1 кг замороженной поджелудочной железы китов оттаивают в течение 1,5 ч, измельчают резекционным ножом и дважды гомогенизируют при пропускании через м сорубку с диаметром отверстий 2-3 мм. К полученному гомогенату добавл ют 3 л экстрагента: 0,05 М трис-НС1-буфера рН8,0 содержащего 0,025 М хлористый кальций и 60 мг активатора - кристаллического трипсина из поджелудочной железы крупного рогатогоскота. Смесь оставл ют дл  активации на 2k ч при +2+k С, центрифугируют при 7 тыс. об/мин в течение kQ мин при и нерастворившуюс  часть отбрасывают. К 3 л прозрачного раствора добавл ют 6 л ацетона , предварительно охлажденного до , при быстром перемешивании. Через 30 мин осадок отдел ют от раствора декантацией и центрифугированием при 6 тыс. об/мин при +2°С в течение 15 мин. Осадок целевого продукта сушат при , удал   следы ацетрна. Из 1 кг поджелудочной железы кита получают 11,2 г белка. Удельна  активность ферментного препарата, выраженна  в ед./мг белка, составл ет: 2б22 (субстрат-N-бeнзoил-Z-тирозин-метиловый эфир), 410 (субстрат-М-бензоил-Z-аргинин-этиловый эфир), 4,8 (субстрат казеина). Выход по казеинолитической активности составл ет 50°, по эстеразнойПример2 . 10 кг замороженной поджелудочной железы китов оттаивают в течение 2 ч, измельчают и гомогенизируют . К гомогенату добавл ют 30л экстрагента до рН 7,6 и 500 мг активатора - кристаллического бычьего три псина. Смесь оставл ют дл  активации на 24 ч при +2 С и перемешивании. Смесь центрифугируют при 6,5 тыс. об/мин, к надосадочной жидкости добавл ют 50 л ацетона охлажденного до -20°С. Через 60 мин осадок ферметов отдел ют от раствора декантацией и центрифугированием при 7 тыс. об/мин при +4°С в течение 20 мин. Осадок целевого продукта сушат при . Из 10 кг поджелудочной железы китов получают 108 г ферментного препарата . Выход по казеинолитической активности составл ет 55, по эстеразной - 75%Комплекс протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов содержит кроме трипсин- и химотрипсинподобных протеиназ (субстраты - казеин - рН 7,8/4,8 ед/мг белка); БАЭЭ-N-бензоил-2-аргинин-этиловый эфир (410 ед/мг белка); БTMЭ-N-бeнзoил-Z-тирозин-метиловый эфир (2622 ед/мг белка нейтральные протеиназы ( рНб,0), в составе которых могут про вл тьс  трипсин и химотрипсин (субстрат гемоглобин - ед/мг белка); кислые протеиназы - субстрат гемоглобин (рН ) - 1,76 ед/мг белка; пепсиноподобные

протеиназы - субстрат-М-карбобензокси-о1-7-глутамин-1-тирозин 337 ед/мг белка); аминопептидазы - субстрат лейцил-глицил-глицин (k2 ед/мг белка); карбоксипептидазы - субстрат-N-карбо- s бензокси-глицил-2-лейцин (53 ед/мг белка).

Результаты испытаний активности ферментного препарата, полученного предлагаемым и известным способами, 10 приведены в таблице,

Технико-экономическа  эффектив ность изобретени  заключаетс  в том, что за

счет предлагаемой совокупности условий выход комплексного протеолитического препарата из поджелудочной железы китов увеличиваетс  в 3 раза.

Ферментный препарат при сушке практически не тер ет казеинолитическую активность.

Предлагаемый способ отличаетс  простотой , он позвол ет при использовании небольшого количества этапов получить протеолитический комплекс, обладающий ценным набором ферментов, что особенно эффективно при использовании их в практике.

15

Предлагае

Claims (3)

1. Формула изобретения ³⁰

   1. Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов путем гомогенизации сырья, экстракции ферментов и их оса- 35 ждения с последующими активацией полученного комплекса трипсином и сушкой, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода продукта, а также упрощения процес-⁴⁰ са, экстракцию и активацию.комплекса ферментов осуществляют одновременно в буфере pH 7,6-8,0, причем трипсин используют в количестве 4-6 мг на 100 г гомогената, осаждение фермен- ⁴⁵ тов осуществляют ацетоном с отделени ем полученного осадка центрифугированием.
2. 2. Способ поп. ^отличающийся тем, что отделение осадка центрифугированием осуществляют при. 6-7 тыс. об/мин.
3. 3. Способ попп. 1 и2, отли- чающийся тем, что сушку целевого продукта осуществляют при 20-2^С.· I . .