KR930009336B1

KR930009336B1 - 유전공학적 미생물로부터 정제된 성장호르몬 회수방법

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Publication number: KR930009336B1
Application number: KR1019850005918A
Authority: KR
Inventors: 바트필드 다니엘; 블룸버그 슈마르야휴; 고렉키 마리안; 하다리 단; 지비 메나케임
Original assignee: 바이오-테크놀러지 제네랄 포코레이숀; 심 화스
Priority date: 1984-08-27
Filing date: 1985-08-16
Publication date: 1993-09-27
Also published as: ES8606496A1; CA1267615A; DE3587391T2; IE58860B1; EP0173215B1; NZ213153A; DK377985A; PT81012B; EP0173215A2; EP0173215A3; GR852031B; HUT38398A; KR870002258A; ATE90389T1; JPH0655154B2; DK377985D0; IE852092L; IL76191A; DE3587391D1; AU4626885A

Abstract

내용 없음.

Description

유전공학적 미생물로부터 정제된 성장호르몬 회수방법

본 발명은 유전공학적 미생물로부터 정제된 성장호르몬을 회수하는 방법에 관한 것이다. 유전공학 연구에 있어서 한가지 목표는 고등생물에서만 자연적으로 생성되는 단백질을 미생물에서도 제조할 수 있는 방법을 개발하는 것이다. 이러한 목표는 어떤 진핵 세포 성장호르몬이나 이들의 유사체에 대해서는 성공을 보고 있다. 성장 및 유도시에 여러가지 성장호르몬 또는 이들의 유사체를 생성할 수 있는 대장균 같은 유전학적으로 변경시킨 세균의 균주를 미국 메릴랜드 주의 록빌(Rockville)에 있는 ATCC에다 기탁해두고 있다. 이러한 호르몬은 가축에 있어서 우유와 육류증산을 도모하는 농업적인 분야의 응용과 왜소증이 있는 인간을 치료하는 의학적인 응용등에 있어서 큰 중요성을 가지고 있다.

미생물에 의한 성장호르몬 제조는 다음과 같은 몇가지 일반적인 단계를 거친다. 즉 (1) 필요로 하는 호르몬을 제조하기 위한 유전명령이 인코우드된 외부 DNA를 대장균같은 적절한 미생물속에 삽입해 주고, (2) 적당한 조건하에서 이 미생물을 배양시켜 호르몬을 다량으로 생성시켜 축적하도록 한 다음, (3) 이 호르몬을 미생물로부터 회수하여 정제하는 것이다.

이 호르몬을 회수하고 정제할 때는 일반적으로 세포를 파열시켜 기타 세포성분으로부터 성장호르몬을 분리한 후 회수된 호르몬을 다시 더 정제하게 된다. 불필요한 세포성분을 효소로 소화시켜 계면활성제로 용해시킨후 원심분리하여 호르몬으로부터 분리제거한다. 마지막으로 성장호르몬을 일반적으로 단백질 정제용으로 개발된 여러가지 방법에 따라 여러가지 등극으로 정제한다. 이러한 정제방법중에는 다음과 같은 한가지 이상의 방법을 이용하고 있다. 즉, 투석, 대역 원심분리, 분자제거 크로마토그래피, 등전침전, 염용-염석, 용매분별, 전기영동법, 이온교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피등의 방법이 그것이다.

미국특허출원 제 514,188 호(1083년 7월 15일 출원)에서는 소의 성장호르몬을 회수하여 정제하는 방법이 나와있다. 이 방법에서는 혼합된 세포현탁물을 기계적으로 파열시켜 리소자임을 사용해서 침전물을 배양한 후 데옥시리보뉴클레아제로 배양하므로서 호르몬을 회수하고 있다. 이렇게 해서 회수된 호르몬을 용해시켜 음파파쇄 처리하고 원심분리하여 용액을 정화시킨후 호르몬을 함유한 용액을 겔 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 투석 및 동결건조 처리하므로서 정제한다.

앞에 나온 이 방법에서는 다량의 리소자임을 필요로 하고 있고 몇번이고 반복해서 장시간 세척을 해야만 정제된 호르몬을 비교적 작은 수득을(발효가 끝났을 때의 세포중에 있는 호르몬의 중량에 대해 약 10-15%)로 얻을 수 있을 뿐이다. 이 방법은 데옥시리보뉴클레아제 소화법에 의존하고 있기 때문에 또 다른 결점을 가지고 있다. 데옥시리보뉴클레아제는 호르몬 회수공정도중 세포상태 DNA를 소화시키고자 사용되고 있는 고가의 효소이다. 데옥시리보뉴클레아제 조물은 회수공정중 소요의 생성물을 분해시키는 단백분해효소로 오염되어 있음이 확인된 바 있다. 따라서 앞에 나온 이런 방법에서 데옥시리보뉴클레아제를 사용하므로서 추가로 미리 주의를 하여 여하한 단백분해효소가 존재하지 않도록 하지 않는한 호르몬의 회수율이 감소된다.

더우기 단백분해효소를 완전히 제거하기가 불가능한 것이다. 생성물의 수득율을 감소시키는 것외에도 데옥시리보뉴클라아제를 사용하면 단백분해효소 오염으로 인해 필요로 하는 안정성을 가지지 못한 생성물을 얻게 된다.

정제된 진핵세로 성장호르몬 또는 이들의 유사체를 회수할 수 있는 방법이 개발되어 있어서 이전에 나온 여러 방법보다 저렴한 경비와 양호한 공정으로 보다 용이하게 실시할 수 있게 되어 있다. 본 발명의 방법에 의하면 이전에 얻을 수 있었던 것보다 훨씬 안정화 형태로 고수득율로 소요의 생성물을 회수할 수 있다. 본 발명의 방법에서는 이전의 방법에서 사용된 리소자임의 량의 불과 2.5-5% 정도만 사용하므로서 정제를 용이하게 할 수 있고 또한 회수경비도 절감할 수 있다.

더우기 본 발명의 방법에서는 어떠한 데옥시리보뉴클레아제도 사용할 필요가 없게 되어 있다. 회수경비를 절가말 수 있는 것외에도 데옥시리보뉴클레아제를 사용할 필요가 없기 때문에 생성물의 수득율을 두배이상으로 할 수 있고 상당히 안정한 형태의 생성물을 얻을 수 있다. 또한 세척회수를 줄일 수 있기 때문에 정제된 성장호르몬이나 이들의 유사체를 보다 편리하고도 시간 효율성이 있게 회수할 수 있는 방법이어서 이전의 방법에서 소요되는 시간의 불과 10-20%만 소용될 뿐이다. 한외여과법을 사용하므로서 본 발명의 방법에서는 제조경비를 상당히 절감할 수 있으며 제품의 순도도 높다.

본 발명은 호르몬이나 이것은 유사체를 인코우드 하는 DNA 순차법으로 동물의 성장호르몬이나 그 유사체를 제조하게 되는 세균세포로부터 정제된 동물의 성장호르몬이나 그 유사체를 회수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 다음과 같은 단계들로 되어 있다.

가. 세균세포의 세포벽이나 그 단편들을 파열시켜 세포용해물을 만들고

나. 입상의 불용품을 함유한 침전물을 세포용해물로부터 분리하고

다. 적당한 완충용액에 위에서 분리한 침전물을 가하여 현탁물을 만들어

라. 현탁액내에 불용물과 완충액이 잘 섞일 수 있도록 이 현탁액을 처리하고

마. 일부 또는 전부가 침전된 물질을 현탁액에서 분리해 내어

바. 충분한 량의 물속에다 분리한 침전물을 넣어 용해시키고 pH를 적당한 알칼리성으로 조절한 용액으로 만들고

사. 적당한 조건하에서 용해된 호르몬이나 그 유사체를 기타 세포성분으로부터 한외여과법으로 분리하여 호르몬이나 그 유사체를 함유한 한외여과액을 얻은 다음

아. 용해된 호르몬이나 그 유사체를 다시 처리하여 정제한 후, 농축하므로서 정제된 호르몬 또는 그 유사체를 회수한다.

(라) 단계에서 리소자임을 사용하여 세포용해물로부터 분리된 침전물의 현탁액을 처리한 다음 침전물을 분리한다. 마지막의 두가지 단계화 이온교환 크로마토그래피법을 사용하여 호르몬이나 그 유사체를 다시 더 정제한 수 농축해도 된다. 더우기 위에 나온 대부분의 공정 단계를 연속적으로 할 수도 있고 자동식의 공정으로도 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 적당한 호르몬생성용 세균세포로는 ATCC No. 39806, 39785, 39386, 39384, 39804 및 39792에 속하는 대장균 균주가 있다. 본 발명을 이용하여 회수하여 정제할 수 있는 성장호르몬으로는 소, 돼지, 닭 및 인간의 성장 호르몬과 그 유사체가 있다.

호르몬 또는 그 유사체를 인토우드하는 DNA 순차법으로 성장호르몬이나 그 유사체를 제조하게 되는 세균세포로부터 동물이나 인간의 성장호르몬이나 그 유사체 같은 정제된 진핵세포 성장호르몬 또는 그 유사체를 회수하는 새로운 방법이 개발되었다.

이러한 본 발명의 방법에 사용되는 유전학적으로 변경된 세균세포는 공지로 되어 있다. 예를들자면 소의 성장호르몬(bGH : bovine growth hormone)의 유사체를 제조하기 위해 유전학적으로 변경시킨 대장균 균주는 매랄랜드주의 록빌에 있는 기탁기관(ATCC)에 기탁되어 있는데 이것은 ATCC No. 39806으로 지정되어 있다. bGH 유사체는 천연 bGH의 페닐알라닌 형태의 N말단에 부가된 아미노산 서열 Met-Asp-Gln을 가지고 있다. 기탁된 다른 유전학적으로 변경된 대장균 세포계통(ATCC No. 39785)는 천연 bGH의 페닐알라닌 형태의 N 말단에 부가된 메티오닌 잔기를 가진 bGH 유사체를 생성한다. 기탁된 또 다른 대균균 균주(ATCC No. 39386)는 Met14로 시작되지만 아미노산 1-13이 부족한 아미노산 서열의 인간성장 호르몬(bGH : human growth hormone)을 가진 bGH 유사체를 생성하는 한편, ATCC No. 39804인 대장균 세포계통은 N말단에 메티오닌이 먼저 있는 천연 bGH의 서열을 가진 bGH유사체를 생성한다. 마찬가지로 대장균 세포계통(ATCC No. 39804 및 39792)은 각각 돼지 성장 호르몬(PGH) 유사체와 닭성장호르몬(cGH) 유사체를 생성하는데, 이들 각각은 해당 천연 호르몬의 페닐알라닌 형태의 N 말단에 부가된 메티오닌 잔기를 가지고 있다. 위에 나온 호르몬 각각은 본 발명의 방법에 따라 적당한 조건하에서 적당한 세포가 성장되어 생성시킨 후 정제된 형태로 회수한다.

본 발명의 방법은 이전에 나온 방법들 보다 공정단계를 훨씬 양호하게 조절하여 저렴한 비용으로 용이하게 실시할 수 있기 때문에 필요로 하는 제품을 안정한 형태로 고수득율로 회수할 수 있다. 본 발명에 의하면 발효가 끝났을 때 세균속에 존재하고 있는 호르몬이나 그 유사체의 중량에 대해 25% 또는 심지어는 30%의 과잉량으로 이러한 제품을 회수할 수 있다. 이전에 나온 방법에서 필요로한 량보다 훨씬 작은량의 효소로서 리소자임을 사용한다. 또한 본 발명의 방법에서는 어떠한 데옥시리보뉴클레아제를 사용할 필요가 없고 연속적으로 실시할 수 있으며 편리하게 자동식으로도 할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 적당한 세균세포를 성장시켜 유발시킨 후 수거하여 경사분리한 세균세포, 이들의 단편 또는 케이크를 중성 pH, 즉 약 pH=7.4 정도의 적당한 완충용액속에 넣고 현탁시킨다. 이런 목적에 적합한 현탁매체는 50mM(Tris)(pH 7.4) : 50mM NaCl, 50mM 트리스(pH 7.4) : 50mM EDTA, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) : 50mM NaCl 또는 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) : 50mM EDTA로 된 수용액이다. 또한 발효담금액 세포 현탁물을 중성으로 조절한 후 직접 사용해도 된다.

현탁된 세균세포의 세포벽이나 이들의 단편들을 파열시켜 세포용해물을 만든다. 보다 바람직한 예로서는 약 35℃ 이하의 온도, 약 -10°-약 +8℃의 온도에서 기계적으로 파열시키는 것이다. 보울 밀(ball mill)이나 파쇄기(homogenizer)[Dynomill KD-5 장치(willy A. Bachofen, Basel)]가 이런 목적에 적당한 파쇄기 인데 시판되고 있다. 파쇄기속으로 적당한 유속, 즉 약 80L/hr의 유속으로 현탁물을 계속해서 통과시켜주어 파쇄하는 것이 좋다.

입상의 불용성물질을 함유한 침전물과 호르몬이나 그 유사체와 기타물에 불용성인 단백질을 가진 세포막과 세포벽 단편들을, 수용성 단백질, DNA 및 RNA 또는 이들의 단편들을 가진 세포용해물로부터 분리한다. 분리가 잘 되게하자면 세포용해물을 약 동일량의 탈염수로 묽게 한 다음 고체 보울 연속흐름식 원심분리기에서(예 : Cepa 101) 소요의 분리가 될 수 있는 충분한 유속, 즉 약 60-80L/hr의 유속으로 하여 원심분리한다. pH가 약 7.4정도인 적당한 량의 완충액속에 분리된 침전물을 넣어 현탁물을 만든다. 이때 용액중에 50mM의 또는 인산나트륨(pH 7.4) : EDTA 50mM를 첨가하는 것이 좋다. 현탁용액에 적당한 완충액의 량은 최초 세균세포 1kg당 약 0.5-2.5ℓ 로 하는데 약 1.2ℓ/세포 kg으로 하는 것이 좋다.

(Sigma L-6876 미국 미조리주 St. Louis)을 현탁물중에 존재하는 다당류를 소화시킬 수 있는 적당한 효소, 즉 리소자임 같은 것을 사용하여 현탁물로 만들어 적당한 조건하에서 적당한 시간동안 배양하므로서 세포벽 단편 같은 불필요한 세포물질을 소화시킨다. 바람직한 리소자임 농도는 약 50-100㎍/용액 ml인데 이전에 나온 방법들에서 사용된 량인 2mg/ml 보다는 훨씬 작은 량이다. 리소자임 배량에 필요한 적당한 시간은 약 1-20시간이다. 배양시의 배양 온도는 약 37℃로 유지하는 것이다. 현탁물에다 적당한 계면활성제[예 : Triton

X-100(Rohm ＆ Haas Co., 미국 필라델피아)]를 적당량 첨가하여 최종농도가 약 1%(v/v) 되게 하므로서 세포 지질(lipid) 같은 물질을 용해 시킨다음 이 현탁물을 다시 약 30분 동안 배양시킨다.

현탁물속에 함유된 액체와 고체를 최대출력의 65%로 고정시켜 약 18L/hr-25L/hr의 유속에서 작동시키는 370W 연속흐름식 음파파쇄기(Heat Systems Ultrasonices, 미국 뉴욕주 Plainview)같은 것을 사용하여 적당한 조건하에서 음파파쇄 처리하여 불용물과 완충액이 잘 섞이도록 한다. 침전물을 고체 보울 연속흐름식 원심분리기(예 : Cepa 101)중에서 약 30L/hr의 유속으로 현탁액을 원심분리 처리하여 현탁액으로부터 한탁된 물질을 분리한 다음 원심분리 대신에 적당한 막(예 : Millipore Durapore 0.45 마이크론 막)을 사용하여 미량여과를 실시한다. 분리가 끝나면 음파파쇄된 현탁액으로부터, 분리되어 침전된 물질을 50mM 트리스 또는 인산염(pH 7.4) : 100mM NaCl로 세척한후 적당량의 적절한 매체, 즉 완충 수용액 또는 비완충 수용액중에 다시 현탁시킨다. 이렇게해서 만든 현탁액을 적당한 조건하에서 음파파쇄법 같은 방법을 이용해서 현탁물과 수용액이 잘 섞이도록 하고 이때 생긴 침전물을 위해 나온 바 있는 한외여과법이나 원심분리법으로 음파파쇄된 현탁물로부터 일부 또는 완전히 분리된다.

재현탁시킨 현탁된 물질의 접촉처리(예 : 음파파쇄)와 분리처리를 최소한 추가로 실시하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 예로서는 이들 단계를 다음과 같이 4회 실시하는 것이다. 우선 생성된 침전물을 20mM 트리스(pH 7.4) 또는 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4)중에 다시 현탁시켜 위에 나온 바와같이 현탁액을 처리(예 : 음파파쇄)한 다음 위에 나온 방법으로 현탁액을 원심분리하고 회수된 침전물을 50mM 트리스(pH 7.4) : 100mM NaCl 또는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) : 10mM EDTA : 100mM NaCl 중에 다시 현탁시킨다. 이 현탁액을 음파파쇄법 같은 방법에 따라 현탁물과 액체가 잘 섞이도록 처리하고 위의 방법에 따라 원심분리하여 회수한 침전물을 탈염수에 다시 현탁시킨다. 현탁액을 음파파쇄시켜 원심분리하여 회수한 침전물을 다시 탈염수에 현탁시킨다. 이 두번째 물 현탁물을 위에 나온 방법으로 음파파쇄처리하여 현탁물과 액체가 잘 섞이도록 한 다음 원심분리하여 필요로 하는 호르몬 또는 그 유사체가 많이 함유된 침전물을 얻는다.

분리한 침전물을 약 25배량(체적)의 충분한 물속에 적당한 온도(4-40℃)에서 다시 현탁시켜 용해시킨후 약 9.0-12.0정도의 적당한 알칼리성 pH로 조절하여 호르몬 또는 이것의 유사체가 함유된 용액을 만든다. 고속전단교반기(예 : Polytron[Kinematica] blender)를 사용하여 용해가 잘되게 해도 된다. 현탁물에다 1-10N NaOH를 첨가하여 최초 현탁물의 pH가 약 9.0-12.0이 될 때까지, 바람직하게는 약 11.8-12.0이 될때까지 pH를 적당히 조절해 주는데, 이때 격렬히 교반하면서 용액에다 NaOH를 동시에 첨가해 주는 것이 좋다. pH조절이 끝나면 용액을 약 1시간정도 교반하면서 배양시킨후 pH를 낮춰 약 10.5로 한다.

적당한 농축시킨 약 1M 붕산나트륨 수용액(적당한 pH는 11.5-12.0)적당량을 용액에다 첨가하여 약 10mM정도의 최종 붕산염 농도가 되게 한다. 이렇게 한 다음 단백질 용액을 10mM 붕산나트륨 완충액(pH10.2) 2-10배량(체적)으로 묽게하거나 진한 HCl 또는 1N HCl로 적정하여 pH 10.5가 되게 한다. 이 용액을 교반하면서 다시 1-12시간 배양한 후 필요에 따라서는 연속흐름식 음파파쇄기(예 : Heat System Sonicator Model 370)에서 약 10L/hr의 유속으로 용액을 음파파쇄처리하여 주어 정화한 다음 고체 보울 연속흐름식 원심분리기(예 : Cepa 101)에서 약 30L/hr의 유속으로 음파파쇄된 용액을 원심분리하고, 상청액을 분리하여 부크너식(Buchner)진공 여과기에 설치한 여과지(Whatman No. 2 paper)속으로 이 액체를 통과시켜 진공여과하므로서 용해된 호르몬이나 그 유사체를 함유한 정화된 용액을 얻는다. 또 다른 방법으로 원심분리만을 사용할 수도 있다.

용해된 호르몬이나 그 유사체를 단백질, 지질 및 기타 입자같은 여러가지 세포성분과 분리하고 적당한 조건하에서 한외여과법을 사용하여 여과한다. 바람직하게는 여과에서 얻은 잔류물을 최소한 한번정도 한외여과처리하는 것이 좋다. 이 공정도중 잔류물의 체적을 약 95% 정도 줄여야 하는데, 즉 약 10ℓ - 약 0.5ℓ 정도로 만든 다음 여액을 수거한다.

한외여과법에서는 100K M. W. 차단장치가 있는 펠리컨 카세트(Pellicon

Cassette)나 PUF-100 스피럴(Spiral : Millipore Corp, Bedford, MA)를 사용하는 것이 적당하다. 잔류물을 적당한 완충액을 사용하여 약 9-12정도의 알칼리성 pH로 한후 다시 한외여과처리하는 것이 좋다. 현재로서 바람직한 예로는 10mM 붕산염 완충액(pH 10.5-12.0)을 이용하는 것이다. 한외여과처리법에 의해 재희석 및 재농축 과정을 최소한 한번정도 더 반복하는 것이 좋다. 또다른 방법으로는 거의 일정한 잔류물을 체적에서 한외여과를 1회 이상 해야한다. 특히 바람직한 것으로는 잔류물의 28nm에서의 흡광도가 약 0.1흡광도 단위이하가 될 때까지 한외여과를 반복하는 것이다. 따라서 겔크로마토그래피법에서 이전에 얻었던 것보다 우수한 생물학적인 활성과 순도를 가진 호르몬을 한외여과액으로부터 편리하게 얻게 된다. 한외여과액에서 얻는 정제된 호르몬이나 그 유사체를 디메틸아미노에틸 같은 아민을 함유한 이온교환수지를 이용한 이온교환 크로마토그래피법 같은 것으로 처리하여 호르몬 또는 그 유사체를 정제하고 농축시킨 후 회수한다. 10K M. W. 막을 이용하여 한외여과물을 농축해서 물을 제거한 다음 이온교환 크로마토그래피 처리해도 된다.

이온교환 크로마토그래피 처리단계도중 존재하고 있는 잔존 DNA, 리소자임 및 고분자물을 호르몬 또는 그 유사체로부터 분리한다. 이 공정단계에서 염산으로 적정하여 한외여과액의 pH를 적당한 pH, 즉 9.0이 되게 우선 조절한 후 적당한 이온교환 칼럼[예 : DEAE-Sepharose CL-6B(신속유동식) KS-370 분할컬럼(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, 미국 뉴우저어지주)]에다 넣는다. 이 장치를 10mM 붕산염 완충액 같은 것으로 세척한 후 100mM NaCl을 함유한 10mM 붕산염 완충액(pH 9.0) 같은 적당한 용리액을 사용하여 적당한 속도로 시료를 용리시킨다. 호르몬이나 그 유사체를 함유한 부분을 적당한 장치(예 : 10K M. W. 절단장치가 있는 Pellicon Cassette 또는 PUF-100 스피럴)를 사용하여 한외여과법으로 농축한 다음 3mM 수산화 암모늄 또는 탄산수소암모늄 같은 적당한 용도의 염을 함유한 용액에 대해 투석시킨후 10K M. W. 절단장치가 있는 펠리컨 카세트로 다시 한외여과법으로 농축한다. 투석처리된 물질을 적당한 조건하에서 동결건조시키던지 분무건조시킨다. 이 경우에 있어서 분무건조법이 보다 경제적인 방법인데 유입구 온도를 약 200℃로 하고 유출구 온도를 약 50℃로 하여 약 2.5L/hrml 유속으로 소형 분무건조기(예 : Niro Atomyzer)에서 편리하게 분무건조처리할 수 있다. 이렇게해서 처리된 동물성장 호르몬이나 그 유사체를 백색미분말 형태로 얻게된다.

정제된 동물 성장호르몬이나 그 유사체를 이런 방법에 따라 발효가 끝났을 때 세균속에 존재하는 호르몬이나 그 유사체가 중량에 대해 약 30%정도 이상으로 큰 수득율로 회수할 수 있다. 이렇게해서 얻은 호르몬이나 그 유사체를 기준물질로서 저분자량의 표지물(marker : Pharmacia제)에 대해 15% 폴리아크릴아미드-SDS 겔 상에서 전개시켰을 때 하나의 반점으로 나타난다.

본 발명에 따라 한외여과법 및 이온교환 크로마토그래피법으로 처리하여 얻은 펩티드는 한외여과법 대신에 겔 크로마토그래피법을 사용한 경우나 이온교환 크로마토그래피법 대신에 10K M. W. 한외여과법으로 펩티드를 농축시켰을 경우보다 훨씬 순수한 것이었고 안정성이 훨씬 큰 것이었다.

회수된 호르몬과 그 유사체의 생물학적 활성에 있어서 방사면역분석시험법을 시험한 결과를 보면 천연호르몬에 대한 항체가 본 발명에 따라 회수되고 적당한 미생물에 의해 생성된 호르몬이나 그 유사체에 대한 친화성이 거의 같았다. 마찬가지로 방사능 수용체 결합분석시험결과를 보면 본 발명에 따라 정제한 호르몬이나 그 유사체에 대한 적당한 막물질의 결합력은 천연호르몬의 진짜 시료에 대한 것과 동등한 것이었다. 더우기 펩티드를 적당한 동물에 1차 또는 보강접종하는 방법을 따라 시험을 해보아도 호르몬이나 그 유사체에 대한 항체가 전혀 검출되지 않았고, 또한 젖을 분비하고 있는 암소에다 소의 성장호르몬 유사체를 투여했을 때 젖분비가 증가하였다.

다음에 나오는 실시예는 본 발명의 이해를 돕기위한 것이지 본 발명을 어떠한 방법으로도 한정하기 위한 것은 아니다. 이 실시예에서는 이 분야에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지로 되어 있는 종래의 방법에 대해 구체적인 사항을 제외시켰다.

[실시예 1]

대장균 성장과 bGH 유사체 제조

1. 원 배양물

대장균 균주(ATCC NO. 39806)의 원 배양물을 생장시키고 감응시키면 bGH 유사체를 생성하게 되는데, 이 대장균 균주 원배양물인 Met-Asp-Gln-bGH 를 카제인 매체(예 : 종균)생장시킨후 냉동제를 사용해서 2배로 묽게한 다음 -80℃에서 저장했다. 냉동제의 500ml당 성분은 다음과 같다.

K2HPO4 6.3g

KH2PO4 1.8g

시트르산 나트륨 0.45g

MgSO4.7H2O 0.09g

(NH4)2SO4 0.9g

글리세롤 44.0g

2. 종균

종균을 20g/ℓ 카세인 가수분해물, 10g/ℓ 효모즙, 및 2g/ℓ NaCl에 번식시켰다. 진탕기에 설치된 플라스크중에 넣어 둔 멸균매체를 한 배양물로부터 접종시키고 약 200r.p.m 에서 30℃에서 진탕기에서 15시간 배양시켰다. 필요에 따라서는 폭기시킨 교반 발효조에서 번식단계를 실시했다. 멸균매체를 2-10%의 종균배양물로 접종시키고 용존 산소함량이 약 20% 공기포화도를 유지할 수 있게 끔 교반과 폭기를 하면서 30℃에서 pH7±0.5의 조건에서 15시간 배양했다.

3. 생성

생성 매체중의 성분함량은 다음과 같다.

카세인 가수분해물 20g/ℓ

효모즙 10g/ℓ

K2HPO4 2.5g/ℓ

MgSO4.7H2O 1g/ℓ

NaCl 5g/ℓ

바이오틴(biotin) 0.1g/ℓ

티아민 1g/ℓ

미량원소용액 3g/ℓ

이 매체중에는 암피실린을 100mg/ℓ 함유하고 있기도 하다. 암피실린은 생성목적으로 임의로 사용할 수 있지만 종균 생장용 매체로 항상 이용되고 있다.

농축액속의 바이오린, 티아민 및 암피실린을 별도로 여과멸균시켜 멸균생성매체에다 첨가한 후 접종시켰다. 멸균 글루코오스용액을 처음에는 10g/ℓ 첨가하고 감응단계가 끝나서는 다시 10g/ℓ 첨가했다.

미량원소 용액중의 성분함량은 다음과 같다.

FeCl3 16g/ℓ

ZnCl2.4H2O 2g/ℓ

CoCl2.6H2O 2g/ℓ

Na2MoO4.2H2O 2g/ℓ

CaCl2.2H2O 1g/ℓ

CuCl 1g/ℓ

H3BO3 0.5g/ℓ

진한 HCl 100ml/ℓ

0.5-10%의 종균배양물로 매체를 접종하고 30℃에서 배양한다. 용존 산소함량이 약 20% 공기 포화도를 유지하도록 교반-폭기속도를 조절한다. NH3를 사용하여 pH를 7.0-7.5 0.2로 유지한다. 일단 세포농도에 약 3.5g/ℓ(0D660=10)에 도달하면 온도를 42℃로 올려 감응단계를 시작한다. 이어서 온도를 42℃에서 1-5시간 유지한 후 세포현탁물로서 세포를 수확한다.

[실시예 2]

세포 수확

실시예 1에서 얻은 세포현탁물(CDW/L6.15g과 bGH/L 490mg 함유)500ℓ를 실온까지 냉각시키고 보관탱크로 옮겼다. CEPA 101관상 보울(bowl) 원심분리기에서 14,000RPM(16,000xg)에서 250L/hr의 공급속도로 세포 현탁물을 원심분리했다. CEPA 101 원심분리기의 관(tube)의 길이는 73.7cm이었고 배출댐(dam)의 반지름은 3.25cm이었으며 보울(bowl)벽에 대한 반지름은 7.35cm이었ㄷ. 여기에는 가속핀(fin)이 장치되어 있었고 외부재킷에서 냉각을 하도록 되어 있는 것이었다.

검출 가능한 량의 bGH가 전혀 없고 밀도가 1.0g/ml인 투명한 상청액을 버렸다. 중량이 11.4kg(75% 습중량)인 케이크중에는 응집된 bGH가 합유되어 있었는데 이것을 수거했다. 이 케이크는 밀도가 1.1g/ml 이었고 두께가 약 2cm 이었다. 또 다른 방법을 사용하여 세포를 하루밤 방치한 후 투명한 상청액을 사이폰으로 제거했다.

분석법 : 세포현탁물, 상청액 및 케이크에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율¹: 100%

전체수득율 : 100%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 2.3%

분석치 : 21.5g bGH/케이크 kg

농축계수 : 44(bGH 생성농도/bGH 공급농도)

¹수득율은 OD 단위(흡광도단위)를 측정해서 결정한 것임.

여기서 흡광노란 280nm에서의 용액의 흡광도(1-cn 용기)×용액체적(mL)이다. 예를들자면 OD값이 9.1이고 용액체적이 32,600mL이면 OD 단위 값은 297,000이다.

만일 흡광도 값을 pH9에서 읽게(reading)될 경우에는 전환변수 0.00157을 곱해주어 OD 값을 bGH gr수로 전환시켜 주면 14.3g bGH/L 가 된다.

[실시예 3]

세포 파열

세포 수확단계(실시예 2)에서 얻은 습한세포(11.4kg)를 각 1kg당 pH 7.4의 50mM 트리스 : 50mM NaCl 완충액 4ℓ 속에 현탁시켰다(전체 45.6ℓ). 고속 전단혼합기(Polytron Kinematica)를 사용해서 케이크를 분산시켰다. 현탁된 세포를 파쇄기[Dynomill KD-5 비이드 밀(bead mill) 파쇄기(Willy A. Bachofen, Basel)]속으로 80L/hr로 공급하고 비이드 밀을 내동시키면서 -10^o-+80℃로 유지했다. 파쇄시킨 세포를 동일량(채적)의 탈염수로 묽게한 후 원심분리기(CEPA 101 tubular bowl)에서 원심분리했다. 이때의 공급속도는 30-60L/hr였다. 공급속도를 제외한 모든 원심분리조건들을 세포수확시의 조건과 같이 했다. 약 10%정도의 공급된 bGH를 함유한 상청액을 버리고 중량이 5.28kg(75% 습중량)인 케이크를 얻었는데 이 케이크중에서 응집된 bGH를 함유하고 있었다.

파열용 완충액(50mM 트리스 : 50mM NaCl, pH 7.4)

탈염수 750mL 속에 트리스 6.06g과 NaCl 2.97g을 가하고 진한 HCl로 pH 7.4까지 조절하고 탈염수를 가해 1L로 만든 다음 필요에 따라 pH 7.4로 다시 조절했다.

분석법 : 세포, 상청액 및 케이크에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율 : 90%

전체수득율 : 90%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 1.05

분석치 : 37.1g bGH/케이크 kg

농축계수 : 1.7

[실시예 4]

리소자임 처리

세포파쇄단계(실시예 2)에서 얻은 습한 케이크(5.28kg)을 최초에 수확한 습한세포 각 1L당 50mM 트리스 : 50mM EDTA 완충액(pH 7.4) 1.2ℓ 씩 속에 현탁시켰다 (전체 13.7ℓ).

고속전단혼합기(Polytron)을 이용해서 케이크를 분산시켰다. 리소자임(Sigma Grade II)을 0.05g/ℓ 첨가하여 슬러리를 만들고 37℃에서 1시간 혼합했다. 트리톤(Triton)X-100(Rohm ＆ Haas Co., 필라델피아)를 첨가하고(1ℓ 당 10% v/v pH 7.4 완충용액 100ml : 최종농도가 Triton X-100 1% 되게 함)이 혼합물을 다시 30분간 배양시켰다. 슬러리를 유동셀이 장치된 65% 출력의 음파파쇄기(Heat System 370 Watt sonicator)에서 음파파쇄했다. 음파파쇄기의 유속으로 18L/hr로 했다. 음파파쇄된 슬러러를 CEPA 101에서 30L/hr유속으로 원심분리처리했는데 공급속도를 제외한 모든 원심분리조건들을 세포수확시의 조건과 같게 하였다. 공급된 bGH 약 3%를 함유한 상청액을 버리고 응집된 bGH를 함유한 중량이 3.07kg(75% 습중량)인 케이크를 얻었다.

리소자임 완충액(50mM 트리스 : 50mm EDTA, pH 7.4)

탈염수 750mL 중에 트리스6.06g과 EDTA 14.6g을 가하고 진한 염산 또는 50% NaOH 로 pH 7.4되게 조절한 후 탈염수를 가해 1L로 만든 다음 필요에 따라 pH를 다시 7.4로 조절했다.

분석법 : 상청액 및 케이크에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율 : 97%

전체수득율 : 87.3%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 0.61%

분석치 : 61.9g bGH/케이크 kg

농축계수 : 1.7

[실시예 5]

1차 세척

리소자임 단계(실시예 4)에서 얻은 습한 케이크(3.07kg)을 최초 수확한 습한세포 각 1kg 당 pH 7.4의 20mM 트리스 0.6ℓ 속에 현탁시켰다(전체 6.8ℓ). 고속전단혼합기(Polytron)를 사용하여 케이크를 분산시켰다. 65% 출력의 음파파쇄기(Heat System 370 Watt 모델)속으로 슬러리를 18L/hr 유속으로 통과시키면서 음파파쇄시켰다. 음파파쇄시킨 슬러러를 30L/hr 유속으로 원심분리(CEPA 101)시켰다. 공급속도를 제외한 모든 원심분리조건들을 세포수확시의 조건과 같게 하였다. 상청액을 버리고 응집된 bGH를 함유한 중량이 2.4kg(75% 습중량)인 케이크를 얻었다.

1차 세척용 완충액(20mM 트리스, pH 7.4)

탈염수 750mL 속에 트리스 2.42g을 가하고 HCl 로 pH 7.4되게 조절하고 탈염수를 가해 1L로 만든 후 필요에 따라 pH 7.4가 되게 다시 pH를 조절했다.

분석법 : 상청액과 케이크에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율 : 100%

전체수득율 : 87.3%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 0.49

분석치 : 77.3g bGH/습한케이크 kg

농축계수 : 1.2

[실시예 6]

염 세척

1차 세척단계(실시예 5)에서 얻은 습한 케이크(2.46kg)을 최초 수확한 습한세포 각 1kg 당 pH 7.4의 50mM 트리스 : 100mM NaCl 완충액 0.6 속에 현탁시켰다(전체 6.8l). 고속전단혼합기(Polytron)를 사용하여 케이크를 분산시켰다. 65% 출력의 음파파쇄기(Heat System 370 Watt 모델)속으로 18L/hr의 유속으로 슬러리를 통과시키면서 음파파쇄한 다음 30L/hr 유속으로 원심분리(CEPA 101)했다. 공급속도를 제외한 모든 원심분리조건들을 세포수확시의 조건과 같게 하였다. 상청액을 버리고 응집된 bGH를 함유한 중량이 2.15kg(75% 습중량)인 케이크를 얻었다.

염 세척용 완충액(50mM 트리스 : 100mM NaCl, pH 7.4)

탈염수 750mL 속에 트리스 6.06g과 NaCl 5.85g를 가하고 HCl 로 pH 7.4까지 조절하고 탈염수를 가해 1L로 만든 다음 필요에 따라 pH 7.4가 되게 다시 pH를 조절했다.

분석법 : 상청액과 케이크에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율 : 100%

전체수득율 : 87.3%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 0.43

분석치 : 88.4g bGH/케이크 kg

농축계수 : 1.14

[실시예 7]

1차 물 세척

염 세척단계(실시예 6)에서 얻은 습한 케이크(2.15kg)을 최초로 수확한 습한세포 각 1kg 당 발열성 물질이 없는 1.2속에 현탁시키고(전체 13.7) 고속전단혼합기(Polytron)를 사용하여 케이크를 분산시켰다. 65% 출력의 음파파쇄기(Heat System 370 Watt 모델)속으로 18L/hr 유속으로 슬러리를 통과시키면서 음파파쇄시켰다. 이 슬러리의 pH는 조작 최초의 물의 pH 6.2 정도에서 pH 7.8-8.0 정도로 증가시켜야한다. 음파파쇄된 슬러리를 30L/hr의 유속으로 원심분리(CEPA 101)시켰다. 공급속도를 제외한 모든 원심분리조건들을 세포수확시의 조건과 같게 하였다. 상청액을 버리고 응집된 bGH를 함유한 중량이 1.90kg(75% 습중량)인 케이크를 얻었다.

분석법 : 상청액과 케이크에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율 : 99%

전체수득율 : 86.4%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 0.38%

분석치 : 99.0g bGH/케이크 kg

농축계수 : 1.12

[실시예 8]

2차 물 세척

1차 물세척 단계(실시예 7)에서 얻은 습한 케이크(1.90kg)을 최초 수확한 습한세포 각 1kg 당 발열성 물질이 없는 탈염수 1.2에 현탁시키고(전체 13.7) 고속전단혼합기(Polytron)를 사용하여 케이크를 분산시켰다. 65% 출력의 음파파쇄기(Heat System 370 Watt 모델)속으로 18L/hr 유속으로 슬러리를 통과시키면서 음파파쇄시켰다. 음파파쇄시킨 슬러리를 30L/hr 유속으로 원심분리(CEPA 101)시켰다. 공급속도를 제외한 모든 원심분리조건들을 세포수확시의 조건과 같게 하였다. 상청액을 버리고 응집된 bGH를 함유한 중량이 1.31kg(75% 습중량)인 케이크를 얻었다.

분석법 : 상청액과 케이크에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율 : 99%

전체수득율 : 85.6%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 0.26%

분석치 : 160g bGH/케이크 kg

농축계수 : 1.62

[실시예 9]

용해 단계

2차 물 세척단계(실시예 8)에서 얻은 습한 케이크(1.31kg)를 세척된 케이크 각 1kg 당 발열성 물질이 없는 탈염수 25속에 현탁시키고(전체 32.6) 고속전단혼합기(Polytron)를 사용하여 케이크를 분산시켰다. 10N NaOH를 첨가하여 pH를 11.8이 되게 서서히 조절했다. 응집된 bGH를 1시간 동안 배양시킨후 pH11.8의 1M 붕산 나트륨을 용액에 첨가하여 붕산 나트륨중에서 용액의 농도가 10mM 되게 했다. 이 용액을 30분간 보관한후 65% 출력의 음파파쇄기(Heat System 370 Watt 모델)속으로 18L/hr의 공급속도로 통과시키면서 음파파쇄시켰다. 용액이 극히 혼탁한 경우에는 원심분리기(CEPA 101) 속으로 30L/hr 유속으로 통과시키면서 원심분리했다. 그렇지않을 경우에는 단일 부크너 여과기에 설치한 직경이 24cm인 여과지(Whatman No. 22 paper) 속으로 용액을 51씩 통과시켜 여과했다. 여과도중 진공을 조절하여 기포가 생기지 않도록 했다. 극미량의 불용성 물질만 있었고 여액(32.6ℓ)중에는 용액상태의 bGH가 함유되었다.

정화된 용액의 흡광도는 280nm에서 9,1 0.D.였다(11-cm 용기). 모든 흡광성은 bGH로 인한 것인 경우에는 이것은 14.3g bGH/L에 상당하는 것이다. bGH의 함량은 이 값의 절반이하이다. UV 흡수성 불순물이 이러한 차이의 원인이 되고 있다. 280nm에서의 흡광도가 1.0인 것은 pH 9에서 순수한 bGH의 용액 1ℓ당 1.57g일 때이다.(bGH의 흡광도는 pH에 따라 달라진다)

용해된 완충액(pH 11.8인 1M 붕산 나트륨)

탈염수 750mL 속에 붕산 61.8g을 용해시키고 5% NaOH를 사용해서 pH 11.8로 조절했다. 탈염수를 사용해서 최종체적이 1되게 묽게 했다.

분석법 : 세척된 케이크와 용해된 bGH에 대해 정량 겔 스캔 적용

단계수득율 : 100%

전체수득율 : 85.6%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 6.8%

분석치 : 6.2g bGH/L

농축계수 : 0.039

[실시예 10]

100K 한외여과

정화된 단백질 용액(32.6ℓ, 297,000 OD)(실시예 9)을 흡광도가 50,000-60,000 OD인 각각의 부분으로 나누고(6×5.41) 각 부분을 한외여과기([Pellicon CCAssetle System ultrafilter(Millipose, Bedford MA)각각의 면적인 5 ft2 인 100,000 분자량 절단 카세트(Type PTHK)가 3개 장치된 것임]속으로 통과시켜 한외여과했다. 첫번째 부분을 농축시켜 1L 잔류물로 만들고 한외여과액을 수거하여 UV로 분석한후 수집했다. 잔류물을 pH 11.8의 10mM 붕산 나트륨 완충액으로 최초 체적이 되게 묽게 했다. 한외여과액을 수거하고 1차 한외여과액과 합쳤다. 한외여과액중의 전체 OD 흡광도가 한외여과기에 최초로 공급된 물질의 OD 흡광도의 20%가 될때 그 다음 농축단계에서의 잔류물 체적을 1L로 하는 대신 0.5L 되게 했다. 농축단계와 10mM 붕산 나트륨 완충액에 의한 희석처리단계의 처리 사이클을 계속하여 결국에는 0.5L의 잔류를 체적에서 얻은 한외여과액의 280nm에서의 흡광도(1-cm 용기)가 0.1 이하가 되게했다. 이것은 한외여과와 희석을 9-12 사이클로 한 것에 해당된다. 최종 잔류물을 버렸다. 한외여과 유속은 표 1에 있는 것과 같다.

한외여과액을 모두 합쳐 6N HCl로 pH 9.0으로 조절했다. 나머지 5.4L 부분을 마찬가지 방식으로 위에 나온 한외여과기속을 통과시켜 처리한후 한외여과액의 pH를 조절한 것을 모두 합쳤다. 대표적인 조작에 의해 모두 380ℓ 의 한외여과액을 얻었는데, 이것의 흡광도는 0.26 OD/ml 로서 이것은 총 100,000(pH 12)의 OD값과 동일한 것이고 24-40시간에 걸쳐 완성된 것이다.

[표 1] 100K M.W. 한외여과시 ℓ의 유속

ℓ 유입구압력이 50psig이고 배압이 5psig임.

분석법 : 공급물에 대해 정량 스캔 및 280nm(1-cm cell)에서의 생성물의 흡광도 적용 ; 정략 겔 크로마토그래피

단계수득율 : 75.5%

전체수득율 : 64.6%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 76%

분석치 : 0.4g bGH/ℓ

농축계수 : 0.065

겔 크로마토그래프(Sepharose CL-6B, Pharamacia Fine Chemicals, Piscataway, 미국 뉴우저어지주)를 사용하여 공급물, 잔류물 및 한외여과액에 대해 각각 분석을 하여 분리물의 함량과 품질을 조사했다. 겔칼럼의 조건을 다음과 같이 하였다.

직경 2.6cm×길이 100cm

총체적 : 500mL, 공극체적 : 150mL

유속 : 40-60 mL/hr

충전량 : 5mL에서 50 OD

용리액 : pH 12의 붕산 나트륨 10mM

정상조작시간 : 5시간

검출 : 280nm UV

겔 크로마토그래피용 완충액(pG 12의 10mM 붕산 나트륨) 실시예 9의 방법에 따라 제조

[실시예 11]

이온 교환 크로마토그래피

실시예 10의 100K 한외여과에서 얻어 합친 한외여과액(380ℓ, 흡광도 100,000 OD)을 93 cm/hr(100L/hr)의 선형유속으로 이온교환 칼럼[Sepharose CL-6B DEAE 이온교환칼럼(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, 뉴우저어지주)]속에다 주입하였다. pH 9.0인 10mM 붕산 나트륨 완충액으로 된 충전량(32L)을 사용하여 칼럼(직경 38cm, 높이 15cm)을 세척하고 주입시와 세척시에 나온 용출액을 버렸다. pH 9인 10mM 붕산 나트륨 : 100mM NaCl에 대한 용리액의 단계변화를 이용해서 칼럼으로부터 bGH를 배출시켰다. 용리시의 유속을 93cm/hr로 했다. 280nm에서 용출액의 흡광도를 추적 조사하여 용리과정을 모니터했다. 4-5단 충전량으로 bGH 최대 유출량을 수거하여(총 흡광도 43,000 OD인 것 84ℓ)얻었다. bGH 부분의 평균농도는 0.8g bGH/L 였다.

다음과 같이 이온교환수지층을 93cm/hr의 유속으로 세척하여 칼럼을 재생시켰다. 즉 HCl로 pH 3.0까지 조절한 1M 아세트산 나트륨 1단 충전량을 칼럼에다 가한다음 0.5N NaOH1

단 충전량을 가했다. 칼럼을 NaOH로 처리한후 칼럼을 2시간 방치한다음 HCl로 pH 3.0으로 조절한 1M 아세트산 나트륨

단 충전량으로 세척했다. 이런다음 이온교환층속으로 최소한 3단 충전량 완충액을 통과시켜 10mM 붕산 나트륨(pH 9)을 사용해서 칼럼층을 평형화하였다.

분석법 : 280nm(1-cm cell)에서의 흡광도 측정

단계수득율 : 43%

전체수득율 : 27.7%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 16.8%

분석치 : 0.8g bGH/L

농축계수 : 2

칼럼 세척용 완충액(pH 9인 10mM 붕산 나트륨)

탈염수 750mL 속에 붕산 0.62g을 가한후 진한 HCl로 pH 10으로 조절하고 탈염수를 가해 1L되게 묽게 한다음 필요에 따라 pH 9.0으로 다시 조절했다.

용리용 완충액(10mM 붕산 나트륨, 100mM NaCl, pH 9)

탈염수 750mL에 붕산 나트륨 10 수화물 3.81g과 NaCl 5.85g을 가하고 진한 HCl로 pH 9.0으로 조절한 후 탈염수를 가해 1L되게 묽게 한다음 필요에 따라 pH 9.0으로 다시 조절했다.

재생용 완충액(pH 3.0의 1M 아세트산 나트륨)

탈염수 750mL에 아세트산 나트륨 3 수화물 136.0g을 가하고 진한 HCl로 pH 3.0이 되게 조절한후 탈염수를 가해 1L되게 묽게 한다음 필요에 따라 pH 3.0으로 다시 조절했다.

[실시예 12]

농축 및 투석

이온교환단계(실시예 11)에서 얻은 bGH(84ℓ, 43,000 OD)를 1N NaOH로 pH 10.5으로 조절한 용액을 한외여과기[Millipore Pellicon ultrafilter, 각각의 면적이 5 ft2인 분자량 10,000인 절단 카세트(type PTGC) 3개가 장치된 것]속으로 통과시켜 280nm(1-cm cell)에서의 잔류물의 흡광도가 10이 될때까지 한외여과시켜 농축하였다. 한외여과액중에는 bGH가 전혀 없어야 하며 이런 한외여과액을 버렸다. 잔류물을 보통 농축계수가 약 20되게 농축(잔류물 4.2)시켰다. 표 2에는 유속이 나와있다.

bGH을 농축시킨뒤 10K M.W. 절단 카세트가 있는 페리컨 장치를 사용하여 NH4OH에 대해 투석시켜 루부로서 탈염시켰다(투석여과법). 투석 3mM NH4OH 용액(잔류물 ℓ 체적당 25체적, 즉 이 경우에 있어서 3mM NH4)H 105ℓ)을 잔류물에 계속 첨가하여 투석여과시에 생긴 체적손실을 보충해 주었다. 투석여과액은 버렸다. 흡광도로 측정했을때 이 용액중에는 염과 공급된 bGH가 10% 함유되어 있었다. 탈염된 bGH를 함유한 잔류물을 투석장치로부터 배출시키고 잔류물이 혼합된 3mM NH4OH 소량으로 한외여과기를 세척했다. 세척물을 첨가하기 전의 잔류물 체적은 4.2ℓ (39,000 OD)로서 14.6g bGH/L의 농도였다. 표 3에는 유속이 나와있다.

[표 2] 10K M.W. 한외여과시 ℓ 의 유속

ℓ 유입구 압력이 20psig이고 배압이 10psig임.

[표 3] 3mM NH4OH에 대한 투석여과시 ℓ의 유속

ℓ 유입구압력이 15psig이고 배압이 5psig임.

분석법 : 280nm(1-cm cell)에서의 흡광도의 측정

단계수득율 : 90%

전체수득율 : 25%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 0.84%

분석치 : 14.6g bGH/L

농축계수 : 18.3

[실시예 13]

동결 건조

투석단계에서 얻은 잔류물과 세척물(4.2ℓ, 14.6g bGH/L 농도에서 39,000 OD)을 커다란 유리용기(jar)중에서 의피 동결시켰다. 이 용기를 실험실용 동결건조기에 24-48시간 연결하여 내용물을 동결건조시켰다. 용기의 외면을 건조공정을 통해 주위온도에 노출시켰다. bGH가 전혀 성립되지 않았는데 bGH(61.3g)를 보플이 있는 백색분말 상태로 얻었다.

분석법 : 공급물에 대한 흡광도 측정, 건조 bGH에 대해 방출 분석시험

단계수득율 : 100%

전체수득율 : 25%

생성체적 : 최초 세포현탁물 체적의 0.012%

분석치 : 100% 담금액 체적

농축계수 : 68

Claims

동물 또는 사람의 성장호르몬 또는 이의 폴리펩티드 유사체를 박테리아 세포에서 생산하는 방법에 있어서, 박테리아 세포내에 있는 성장호르몬을 인코드하는 DNA 염기서열을 발현시키고, 발현된 진핵세포 성장호르몬 또는 그 유사체를 회수하는 방법의 단계가, 가) 박테리아 세포벽이나 그 일부를 파열시켜 세포용해물을 만들고, 나) 세포용해물로부터 입상의 불용물을 함유한 침전물을 분리해내고, 다) 분리된 침전물에 트리스 포스페이트 또는 포스페이트 완충액을 첨가하여 현탁액을 만들고, 라) 현탁액내에 폴리사카라이드와 같은 세포잔유물을 절단하기 위해 DNAse 없는 라이소자임 100㎍/L으로 1-20시간 배양하고 그리고 현탁된 물질과 완충액이 잘 섞이도록 현탁액을 처리하고, 마) 현탁액내에 침전된 물질을 분리해내고, 바)분리된 침전물에 수용액 또는 물을 25배 용적으로 첨가하여 용해시키고, NaOH를 이용하여 pH를 9.0 내지 12.0으로 조절하고, 사) 용해된 상태의 호르몬이나 그 유사체를 세포성분으로부터 분리시키기 위해 100K M.W. 분자 여과막을 이용한 한외여과법을 사용하여 호르몬이나 그 유사체를 함유한 한외여과액을 수득하고, 아) 용해된 호르몬이나 그 유사체를 정제한 후 농축시킴으로써 정제된 호르몬 또는 그 유사체를 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 박테리아세포로부터 정제된 진핵세포 성장호르몬이나 그 유사체를 회수하는 방법.
제 1 항에 있어서, 호르몬이나 그 유사체가 동물의 성장호르몬이나 그 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 호르몬이나 그 유사체가 소의 성장호르몬이나 그 유사체 인것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 호르몬이나 그 유사체가 인간의 성장호르몬 또는 그 유사체인 방법.
제 2 항에 있어서, 호르몬이 돼지의 성장호르몬 또는 그것의 유사체인것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 호르몬이나 그 유사체가 닭의 성장호르몬이나 그 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (가) 단계에 앞서 세균세포나 이들의 단편들을 발효즙 상태의 현탁물속에 유지시키거나 중성 pH의 완충용액중에 현탁시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 중성 pH가 약 7.4인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (가) 단계에서 세포를 파쇄기를 이용하여 기계적으로 파열시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 탈이온수로 세포 용해물을 희석시킨후 입상의 물질을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (나) 단계 또는 (마) 단계에서의 분리는 원심분리법으로 실행하는 것을 특징으로하는 방법.
제 1 항에 있어서, (나) 단계 또는 (마) 단계에서의 분리는 한외여과법으로 실행하는 것을 특징으로하는 방법.
제 1 항에 있어서, 현탁된 물질과 완충액이 잘 섞이도록 하기 위해 (라) 단계에서의 처리를 음파파쇄법으로 실행하는 것을 특징으로하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세포지질과 같은 물질을 용해시키기 위해 현탁액에다 트리콘 X-100과 같은 계면활성제를 첨가하여 30분 동안 현탁물을 배양시켜 (라) 단계에서 현탁물의 액체-고체접촉이 잘되게 하여서 현탁된 물질과 완충액이 잘 섞이도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (마) 단계에서 현탁액으로부터 분리된 침전물을 적절한 매체에 다시 현탁시키고 현탁된 물질과 매체가 잘 섞이도록 한다음 현탁액으로부터 침전물을 분리한다음 (바) 단계에서 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 적절한 매체로서 완충수용액 또는 비완충수용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 생성된 침전물을 다시 현탁시키고 현탁된 물질과 수용액이 잘 섞이게한 후 1회이상 침전물을 분리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약 9.0-12.0의 pH에서 침전물을 용해시킨후 pH가 약 10.5정도로 낮추어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 농축된 붕산 나트륨 수용액 2-10배 용적을 (바) 단계에서 얻은 용액에다 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (바) 단계에서 얻은 용액을 정제하고 원심분리하여 상층액을 분리한후 액체를 진공여과하여 호르몬 또는 그 유사체를 함유한 정제된 용액을 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (사) 단계에서 얻은 잔류물을 최소한 한번 더 한외여과처리한 다음 (아) 단계의 처리를 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 잔류물을 알칼리성 pH의 완충용액으로 희석한다음 다시 한외여과처리를 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 알칼리성 pH가 약 9.0-12.0인 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 희석과 한외여과를 최소한 한번 더 반복시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 한외여과 처리도중 잔류물을 일정한 체적으로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 일정한 잔류를 체적에서 한외여과를 최소한 한번 더 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (아) 단계에서의 용해된 호르몬의 처리를 이온교환 크로마토그래피로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 27 항에 있어서, 아민을 함유한 이온교환수지를 이용하여 이온교환 크로마토그래피 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 아민을 함유한 이온교환수지가 디에틸아미노에틸-멕스트란 혹은 세파로즈인 경우인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 정제된 호르몬 또는 그 유사체를 투석하여 정제한 후 건조시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 정제된 호르몬 또는 그 유사체를 투석하여 정제한후 건조시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 적정 염을 함유한 용액에 대해 투석처리를 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 적당한 염으로는 수산화 암모늄 또는 탄산수소 암모늄을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 동결건조법으로 건조시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 건조는 분무건조법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.