JPH04264100A - ペプチド混合物、カルシウム吸収促進剤及び血清カルシトニン濃度向上剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カルシウムの吸収促進
作用及びカルシトニンの濃度向上作用等を有する新規な
ペプチド混合物及び該ペプチド混合物を利用したカルシ
ウム吸収促進剤並びに血清カルシトニン濃度向上剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術】カルシウムの吸収促進作用を有するペプ
チドとしては、従来よりカゼインホスホペプチド（以下
ＣＰＰと略す）が知られている。該ＣＰＰの製造方法と
しては、例えば、カゼインをトリプシンで処理した後、
カルシウムイオンと親水性有機溶媒を添加して回収する
方法（特開昭５８−１７０４４０号公報）又は第２鉄イ
オンを添加して回収する方法（特開昭５９−１５９７９
３号公報）等が提案されている。

【０００３】しかしながら、前記ＣＰＰにおいても、β
型の構造は明らかにされているものの、α型については
未だ不明な点があり、しかも更に分解が進んだペプチド
が、どのような作用を有するかについても明らかにされ
ていない。即ち、前述のとおりカルシウムの吸収促進作
用を呈するＣＰＰ等のペプチドについては知られている
が、同時にカルシウム代謝をも活性化する食品タンパク
質由来のペプチドについては全く知られていないのが現
状である。従って、カルシウムの生体利用を高めること
が可能な食品素材等に有用であるＣＰＰ及びその分解物
のさらなる解明が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、優れ
たカルシウムの吸収促進作用及び骨へのカルシウム蓄積
に関与するホルモンとして知られるカルシトニンの濃度
向上作用等を同時に備える新規なペプチド混合物を提供
することにある。

【０００５】また本発明の別の目的は、食品等に添加可
能であり、且つ優れたカルシウムの吸収促進作用を有す
るカルシウム吸収促進剤を提供することにある。

【０００６】更に本発明の他の目的は、食品等に添加可
能であり、且つ骨へのカルシウム蓄積に関与するホルモ
ンとして知られるカルシトニンの濃度向上作用を有する
血清カルシトニン濃度向上剤を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、カゼイ
ンをタンパク質分解酵素により分解した後、カルシウム
塩を添加し、次いで８を超えるｐＨ下において沈殿回収
されるペプチドを含むペプチド混合物が提供される。

【０００８】また本発明によれば、前記ペプチド混合物
を含むカルシウム吸収促進剤が提供される。

【０００９】更に本発明によれば、前記ペプチド混合物
を含む血清カルシトニン濃度向上剤が提供される。

【００１０】以下本発明を更に詳細に説明する。

【００１１】本発明のペプチド混合物は、カゼインを出
発原料として、タンパク質分解酵素により分解し、更に
カルシウム塩を用いて特定方法により生成処理すること
によって得られるものであって、好ましくはジペプチド
から分子量１００００程度のポリペプチドまでの広い範
囲を含み、且つペプチド１ｍｇあたり０．１ｍｇ以上の
カルシウムが結合しており、ゲル濾過解析における結合
したカルシウムの分布がペプチドの分子量分布に対応し
たペプチド混合物である。該出発原料として用いるカゼ
インとしては、酸カゼイン、カゼインナトリウム等を最
も好ましく挙げることができるが、牛乳、脱脂粉乳等を
使用することもできる。

【００１２】また本発明に用いる前記タンパク質分解酵
素は、カゼインを分解することができれば、例えば公知
の膵臓由来のタンパク質分解酵素又は微生物由来のタン
パク質分解酵素等を使用することができ、具体的には、
ペプシン等の酸性下で最適に作用するプロテアーゼ；ト
リプシン、キモトリプシン、ズブチリシン等のアルカリ
性下で最適に作用するプロテアーゼ；商品名「プロテア
ーゼＰ」（天野製薬株式会社製）、商品名「アルカラー
ゼ」（ノボ社製）等の微生物起源のプロテアーゼ等を挙
げることをでき、使用に際しては単独若しくは混合物と
して用いることができる。

【００１３】更に本発明に用いる前記カルシウム塩とし
ては、例えば塩化カルシウム、乳酸カルシウム、炭酸カ
ルシウム等を挙げることができ、その使用量はペプチド
混合物１ｇに対してカルシウム量が０．２〜１．０ｇの
範囲となるようにするのが好ましい。

【００１４】次に本発明のペプチド混合物を製造方法に
より説明する。

【００１５】本発明のペプチド混合物を製造するには、
まずカゼインに適当なタンパク質分解酵素を添加してカ
ゼインを分解する。この際出発原料であるカゼインは、
反応性及び取扱い性を向上させるために例えば蒸留水等
に懸濁させて、含有量１〜５重量％となるように希釈し
て用いるのが好ましい。またタンパク質分解酵素による
分解反応は、１種類の酵素により行うこともできるが、
収率を向上させるために複数のタンパク質分解酵素を用
いて、多段階反応、特に２段階反応させるのが望ましい
。その際の反応条件は、使用するタンパク質分解酵素に
最適の反応温度、反応時間及びｐＨを採択して行うこと
ができる。更に具体的には、例えば酸性下で最適に作用
するプロテアーゼ等を用いる場合には、ｐＨを１〜３に
調整し、３０〜５０℃にて６〜２４時間反応させるのが
好ましく、またアルカリ性下で最適に作用するプロテア
ーゼ等を用いる場合には、ｐＨを７〜９に調整し、３０
〜５０℃にて６〜２４時間反応させるのが好ましい。 更にまた特に２段階で反応させる場合には、例えば酸性
下で最適に作用するプロテアーゼ等を、ｐＨを２〜３に
調整した反応液に添加し、３０〜５０℃にて８〜２４時
間反応させ、引き続きアルカリ性下で最適に作用するプ
ロテアーゼ等を、ｐＨを７〜９に調整した反応液に添加
し、３０〜５０℃にて２〜１０時間反応させるのが好ま
しい。

【００１６】次に分解反応終了後、カルシウム塩を添加
するのであるが、好ましくは前記分解反応終了後、使用
した酵素を失活させて、未分解物等を除去するのが好ま
しく、例えば反応溶液のｐＨを３〜５に調整した後、８
０〜９０℃にて５〜１５分間処理して該酵素を失活させ
、直ちに室温以下に冷却し、分画分子量１００００〜３
００００の膜等を用いて限外濾過等を行って、該酵素及
び高分子量ペプチド等を除去するのが好ましい。前記カ
ルシウム塩は、例えば反応液を３０〜４０℃にして添加
するのが好ましく、カルシウム塩添加後、例えば水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム等を添加して、ｐＨを８を
超えるｐＨに、好ましくはｐＨ９〜１３に調整し、ペプ
チドを沈殿させる。該ｐＨが８以下の場合には、目的と
するペプチドが得られないか、若しくは極端に収率が低
下するので、８を超えるｐＨとする必要がある。また前
記ペプチドを沈殿させる際に、特に好ましくはまずｐＨ
を１２以上、更に好ましくはｐＨ１２〜１３に調整し、
１０〜２０分間保持した後、ｐＨを９程度に下げ、更に
１０〜２０分間保持するのが好ましい。次いで得られる
沈殿物を回収することにより、目的のペプチド混合物を
得ることができるが、必要に応じて、更に公知の精製法
等により精製することもできる。該精製法としては、例
えば、得られる沈殿物を回収した後、蒸留水に懸濁させ
、中性付近で該沈殿物を撹拌溶解し、遠心分離法等によ
り不純物を除去する方法等を挙げることができ、更に必
要に応じてペプチド混合物溶液を電気透析にかけて脱塩
することもできる他、乾燥させて粉末化することもでき
る。

【００１７】また本発明のカルシウム吸収促進剤及び血
清カルシトニン濃度向上剤は、共に前記ペプチド混合物
を含有しておれば良く、例えば前記ペプチド混合物を前
記方法に従って液状又は粉末化処理等を行うことによっ
て得ることができ、必要に応じて、賦形剤、着色剤、着
香料等を添加することもできる。またこれらを使用する
際には、そのまま常用することも可能あるが、例えば錠
菓、ビスケット、乳酸飲料、清涼飲料等の食品又は飲料
物に添加して用いることもできる。この際１日の摂取量
は、摂取する対照によってことなるが、例えば人の場合
、通常１日当りのカルシウム量が１００ｍｇ程度不足し
ていると言われているので、ペプチド混合物を０．８ｇ
以上摂取するのが好ましく、特に毎日常用することによ
り優れた効果を得ることができる。

【００１８】

【発明の効果】本発明のペプチド混合物は、優れたカル
シウムの吸収促進作用及び骨にカルシウムを蓄積させる
働きを有するカルシトニンの血中濃度を高める作用等を
有するので、カルシウム吸収促進剤及び血清カルシトニ
ン濃度向上剤として有用であり、しかも毒性が全く無い
ので、骨を強化することが期待される食品添加用素材と
して極めて有用である。

【００１９】

【実施例】以下本発明を実施例、比較例及び試験例によ
り更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。

【００２０】

【実施例１】カゼイン（乳酸カゼイン、アラシッド社製
）３重量％を蒸留水４ｌに懸濁し、塩酸を加えてｐＨを
２．５に調整し、８０℃に加熱してカゼインを溶解させ
、更に３７℃に冷却後、ペプシン（商品名「Ｐ−７０１
２」シグマ社製）２４０ｍｇを添加し、同温度で１７時
間反応させた。続いてｐＨを１０Ｎ水酸化ナトリウムで
８．０に調整した後、タンパク質分解酵素（商品名「プ
ロテアーゼ−Ｐ」天野製薬株式会社製）０．６ｇを加え
、４５℃で３．５時間反応させた。反応終了後、塩酸で
ｐＨを４．６に調整し、８０℃で５分間加熱して酵素反
応を停止させた。次いで室温に冷却し、５０００ｒｐｍ
、１５分間遠心分離を行って、沈殿物を除去した後、そ
の上清液を限外濾過（商品名「ＵＨＰ−１５０」アドバ
ンテック東洋株式会社製；濾過膜、分画分子量１０００
０、フジフィルター工業株式会社製）し、その濾液２ｌ
に塩化カルシウム濃度が０．２Ｍとなるように塩化カル
シウムを加えて溶解し、温度を３７℃に調整した。次に
１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１２．５に調整した後
、３７℃で１０分間保持し、更に塩酸でｐＨを９．０に
調整し、更に３７℃１０分間保持した。形成された沈殿
物を遠心分離により分離してた後、蒸留水に懸濁し、塩
酸でｐＨを６．８に調整して撹拌を行った。その後更に
４０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行い不溶物を除去
した。得られた溶液の上清液を商品名「ミクロアシライ
ザーＧ３」（旭化成株式会社製）を用いて電気透析処理
して脱塩した後、凍結乾燥して白色粉末４．０８ｇを得
た。得られたペプチド混合物のアミノ酸分析を行ったと
ころ、Ａｓｘ　８．３，Ｇｌｘ２８．３，Ｔｈｒ　４．
７，Ｓｅｒ　８．３，Ｐｒｏ　７．９，Ｇｌｙ　３．５
，Ａｌａ　４．６，Ｃｙｓ　０．２，Ｖａｌ　６．３，
Ｍｅｔ　２．２，Ｉｌｅ　５．４，Ｌｅｕ　７．０，Ｔ
ｙｒ　２．６，Ｐｈｅ　２．７，Ｌｙｓ　４．０，Ｈｉ
ｓ　１．８，Ａｒｇ　２．２（単位は％である）であっ
た。 また、このペプチド混合物１ｇ中に含まれるカルシウム
の量を、商品名「Ｃ−テストワコー」、和光純薬株式会
社製で測定し、更にペプチド混合物の回収率及び可溶化
活性を測定した。該可溶化活性は、６．７ｍＭリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７．５）及び塩化カルシウム２．２ｍＭ存
在下、３７℃に１時間放置した際のペプチド混合物１ｍ
ｇ中に溶解することができたカルシウム量を測定して求
めた。これらの測定結果を表１に示す。尚、この実施例
において、塩化カルシウムを加えて、更に１０Ｎ水酸化
ナトリウムでｐＨを１２．５に調整した後、塩酸でｐＨ
を９．０に調整したのを、塩酸でｐＨを１０．０にし、
同様にペプチド混合物を得、前記各測定を行った。その
結果も併せて表１に示す。

【００２１】

【比較例１】実施例１において、塩化カルシウムを加え
て、更に１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１２．５に調
整した後、塩酸でｐＨを９．０に調整するのを、塩酸で
ｐＨを６．０、７．０又は８．０にそれぞれ調整した以
外は実施例１と同様にペプチド混合物を得、各測定を行
った。その結果を表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【実施例２】２日間水だけを与えて絶食させたＳＤ系雌
ラット（５週令、１群６匹）を断頭により屠殺し、直ち
に胃の幽門部から約１５ｃｍの十二指腸と空腸とを含む
腸管を切断した後、ガラス棒を用いて腸管を反転させた
。次いで反転させた腸管を直ちに、たえず酸素ガスを送
り込んでいるインキュベーションバッファー（塩化ナト
リウム　１２５ｍＭ，フルクトース　１０ｍＭ，トリス
−塩酸（ｐＨ７．４）３０ｍＭ）中に浸した。該反転腸
管を約５ｃｍごとに切断して３個の部位を得、それぞれ
の部位について片端を縫合糸で縛り注射器でインキュベ
ーションバッファーを０．２５ｍｌ注入すると同時に、
縫合糸でもう片側を完全に縛った。得られた腸管サック
１個ごとに、実施例１で得られたペプチド混合物１ｍｇ
／ｍｌ及びカルシウムを５ｍｇ／ｄｌ（商品名「Ｃ−テ
ストワコー」、和光純薬株式会社製で定量）含有のイン
キュベーションバッファー３０ｍｌ中に吊るし、３７℃
で９０分間、酸素ガスを通気しながらインキュベーショ
ンした。次に腸管内液及び外液のカルシウム濃度を測定
し、その内外比を求め、これを吸収効率比とした。その
結果を表２に示す。

【００２４】

【比較例２】実施例１で得られたペプチド混合物の代わ
りに、カゼインホスホペプチド（商品名「ＣＰＰ−ＩＩ
Ｉ」、明治製菓株式会社製）を用いるか、または対照区
として何も用いない以外は実施例２と同様に行い、吸収
効率比を測定した。その結果を表２に示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】

【実施例３】ＳＤ系雌のラット（７週令、１群５匹）に
、カルシウム含量を０．１重量％とした１８重量％カゼ
イン含有飼料を１日、１匹当り、１５ｇ、２週間摂食さ
せ、続いてカルシウム含量０．０１重量％とした１８重
量％卵白アルブミン含有飼料を１日、１匹当り、１５ｇ
、２日間摂食させた後、１昼夜水だけを与えて絶食させ
た。次いでカルシウム２２５ｍｇと実施例１で得られた
ペプチド混合物２ｇとを蒸留水１２．５ｍｌに溶解した
飼料を１匹当り２．５ｍｌで強制的に経口投与した。 投与前、投与１時間後、２時間後、４時間後及び６時間
後に尾静脈より採血して、血清中のカルシトニン量を測
定した。カルシトニンの定量にはイムノカルシトニン（
バクスター社製）を使用した。尚、対照試験として、前
記カルシウム２２５ｍｇ及び実施例１で得られたペプチ
ド２ｇの代わりに、カルシウム２２５ｍｇのみを蒸留水
に溶解した飼料を投与した場合にも同様な測定を行った
。それらの結果を表３に示す。

【００２７】

【表３】

【００２８】

【実施例４】５週令のＳＤ系雌ラット６匹の卵巣を手術
により摘出した後、低カルシウム飼料（０．１重量％カ
ルシウム、１８重量％カゼイン）を１日当り１５ｇで６
か月間飼育し、更にカルシウム含有を０．０１重量％と
した１８重量％卵白アルブミン含有飼料を１日当り１５
ｇで３日間飼育した。次いで１昼夜水だけを与えて絶食
させた後、カルシウム２２５ｍｇと実施例１で得られた
ペプチド２ｇとを蒸留水１２．５ｍｌに溶解した飼料を
１匹当り２．５ｍｌで強制的に経口投与した。投与前、
投与１時間後及び投与４時間後に尾静脈より採血して、
血清中のカルシトニン量を測定した。カルシトニンの定
量にはイムノカルシトニン（バクスター社製）を使用し
た。尚、対照試験として、前記カルシウム２２５ｍｇ及
び実施例１で得られたペプチド２ｇの代わりに、カルシ
ウム２２５ｍｇのみを蒸留水に溶解した飼料を投与した
場合にも同様な測定を行った。それらの結果を表４に示
す。

【００２９】

【表４】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　カゼインをタンパク質分解酵素により
   分解した後、カルシウム塩を添加し、次いで８を超える
   ｐＨ下において沈殿回収されるペプチドを含むペプチド
   混合物。
2. 【請求項２】　　請求項１記載のペプチド混合物を含む
   カルシウム吸収促進剤。
3. 【請求項３】　　請求項１記載のペプチド混合物を含む
   血清カルシトニン濃度向上剤。