JP3430176B2 - アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法 - Google Patents
アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法Info
- Publication number
- JP3430176B2 JP3430176B2 JP11415093A JP11415093A JP3430176B2 JP 3430176 B2 JP3430176 B2 JP 3430176B2 JP 11415093 A JP11415093 A JP 11415093A JP 11415093 A JP11415093 A JP 11415093A JP 3430176 B2 JP3430176 B2 JP 3430176B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- converting enzyme
- angiotensin converting
- peptide
- enzyme inhibitory
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、天然物から調整でき、
殊に血圧降下剤または血圧降下食品として有用であるア
ンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法に関す
る。
殊に血圧降下剤または血圧降下食品として有用であるア
ンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】アンギオテンシン変換酵素は、主として
肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテ
ンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用し
て、アンギオテンシンIのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉ
ｓ9−Ｌｅｕ10）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有
するアンギオテンシンＩＩを生成させる酵素である。
肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテ
ンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用し
て、アンギオテンシンIのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉ
ｓ9−Ｌｅｕ10）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有
するアンギオテンシンＩＩを生成させる酵素である。
【０００３】また、この酵素は生体内降圧物質であるブ
ラジキニンを分解し不活化する作用も併有し、昇圧系に
強力に関与している。従来より、アンギオテンシン変換
酵素の活性を阻害すれば、降圧に働き、臨床的には高血
圧症の予防、治療に有効であると考えられている。
ラジキニンを分解し不活化する作用も併有し、昇圧系に
強力に関与している。従来より、アンギオテンシン変換
酵素の活性を阻害すれば、降圧に働き、臨床的には高血
圧症の予防、治療に有効であると考えられている。
【０００４】最近ではプロリン誘導体であるカプトプリ
ルが合成され、降圧活性が確認されて以来、種々のアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであ
り、又天然物からの取得も試みられているところであ
る。天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は食
品あるいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の
高い降圧剤となることが期待されるからである。
ルが合成され、降圧活性が確認されて以来、種々のアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであ
り、又天然物からの取得も試みられているところであ
る。天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は食
品あるいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の
高い降圧剤となることが期待されるからである。
【０００５】そこで本発明者も天然物由来のアンギオテ
ンシン変換酵素阻害剤を開発すべく研究を重ね、蛋白質
をサーモライシンで加水分解してアンギオテンシン変換
酵素阻害ペプチドを得る方法（特開平４−１４４６９６
号公報）、アルブミンをペプシンで加水分解してアンギ
オテンシン変換酵素阻害ペプチドを得る方法（特開平４
−１５２８９２号公報）、蛋白質をバチルス サブチリ
スの生産する中性プロテアーゼ、アスペルギルスニガー
の生産する酸性プロテアーゼ、リゾプス デレマーの生
産する酸性プロテアーゼから選ばれる少なくとも１種の
酵素で加水分解してアンギオテンシン変換酵素阻害ペプ
チドを得る方法（特開平４−３０４８９６号公報）、蛋
白質をバチルス サブチリスの生産するアルカリ性プロ
テアーゼ、アスペルギルス メレウスの生産する中性か
らアルカリ性のプロテアーゼ、アスペルギルス オリゼ
ーの生産する中性プロテアーゼ、パパイヤ起源の中性プ
ロテアーゼから選ばれる少なくとも１種の酵素で加水分
解してアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを得る方
法（特願平３−２９８０６０）、肉類を５０℃以上の水
中で加熱処理し、水溶性蛋白質を抽出除去して得られる
水不溶性の蛋白質を主体とする残渣をプロテアーゼで加
水分解してアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを得
る方法（特願平３−２９８０６１）など種々の特許出願
を行った。
ンシン変換酵素阻害剤を開発すべく研究を重ね、蛋白質
をサーモライシンで加水分解してアンギオテンシン変換
酵素阻害ペプチドを得る方法（特開平４−１４４６９６
号公報）、アルブミンをペプシンで加水分解してアンギ
オテンシン変換酵素阻害ペプチドを得る方法（特開平４
−１５２８９２号公報）、蛋白質をバチルス サブチリ
スの生産する中性プロテアーゼ、アスペルギルスニガー
の生産する酸性プロテアーゼ、リゾプス デレマーの生
産する酸性プロテアーゼから選ばれる少なくとも１種の
酵素で加水分解してアンギオテンシン変換酵素阻害ペプ
チドを得る方法（特開平４−３０４８９６号公報）、蛋
白質をバチルス サブチリスの生産するアルカリ性プロ
テアーゼ、アスペルギルス メレウスの生産する中性か
らアルカリ性のプロテアーゼ、アスペルギルス オリゼ
ーの生産する中性プロテアーゼ、パパイヤ起源の中性プ
ロテアーゼから選ばれる少なくとも１種の酵素で加水分
解してアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを得る方
法（特願平３−２９８０６０）、肉類を５０℃以上の水
中で加熱処理し、水溶性蛋白質を抽出除去して得られる
水不溶性の蛋白質を主体とする残渣をプロテアーゼで加
水分解してアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを得
る方法（特願平３−２９８０６１）など種々の特許出願
を行った。
【０００６】しかしながら、天然物由来の蛋白質を酵素
により加水分解して得られるペプチド中には苦味ペプチ
ドが多量に含有されており、かかるアンギオテンシン変
換酵素阻害剤としての利用に制限を与えている。かかる
対策として、ペプチドにロイシンアミノペプチターゼ
やカルボキシペプチターゼを作用させる方法（佐藤泰，
関口義彰，千葉善根，猪飼勝弘，農化，43,286,(1969)・
S.Arai,M.Yamashita,H.Kato,M.Fujimaki,ibad.,34,729,
(1970))、ペプチドにα−キモトリプシンを作用させて
プラスティンとする方法（M.Fujimaki,M.Yamashita,S.A
rai,H.Kato,Agr.Biol.Chem.,34,483,1325(1970)）、合
成吸着剤にアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを吸
着させ、有機溶媒により溶出する方法（特開平４−３４
１１９３号公報）、疎水性吸着剤に苦味ペプチドを吸
着させ除去する方法（特開平４−１９０７９７号公報）
などが挙げられる。
により加水分解して得られるペプチド中には苦味ペプチ
ドが多量に含有されており、かかるアンギオテンシン変
換酵素阻害剤としての利用に制限を与えている。かかる
対策として、ペプチドにロイシンアミノペプチターゼ
やカルボキシペプチターゼを作用させる方法（佐藤泰，
関口義彰，千葉善根，猪飼勝弘，農化，43,286,(1969)・
S.Arai,M.Yamashita,H.Kato,M.Fujimaki,ibad.,34,729,
(1970))、ペプチドにα−キモトリプシンを作用させて
プラスティンとする方法（M.Fujimaki,M.Yamashita,S.A
rai,H.Kato,Agr.Biol.Chem.,34,483,1325(1970)）、合
成吸着剤にアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを吸
着させ、有機溶媒により溶出する方法（特開平４−３４
１１９３号公報）、疎水性吸着剤に苦味ペプチドを吸
着させ除去する方法（特開平４−１９０７９７号公報）
などが挙げられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、及び
の方法ではペプチドの一次構造が変わってしまい、
及びでは苦味ペプチドの除去効率が悪く工業的な方法
とは言い難い。故にペプチドの一次構造を変えずに苦味
ペプチドを効率良く除去できる新たな方法が望まれてい
る。
の方法ではペプチドの一次構造が変わってしまい、
及びでは苦味ペプチドの除去効率が悪く工業的な方法
とは言い難い。故にペプチドの一次構造を変えずに苦味
ペプチドを効率良く除去できる新たな方法が望まれてい
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】しかるに本発明者はかか
る課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、蛋白質を水
性媒体中で蛋白分解酵素により加水分解して得られたア
ンギオテンシン変換酵素阻害剤含有ペプチド溶液を精製
するにあたり、加水分解反応溶液から不溶物を除去し
たのち、該ペプチド濃度を１０重量％以上の溶液とし、
該溶液を合成吸着剤と接触させ、非吸着画分を分収
し、該合成吸着剤を水または塩水溶液で洗浄して更に
非吸着画分を回収した場合にかかる目的を達成できるこ
とを見いだし本発明を完成するに至った。本発明におい
てはペプチドを合成吸着剤に接触させる時に該ペプチド
濃度を１０重量％以上とすることに特徴をもち、濃度を
限定することにより苦味ペプチドが非常に効率によく除
去できるのである。以下、本発明について詳述する。
る課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、蛋白質を水
性媒体中で蛋白分解酵素により加水分解して得られたア
ンギオテンシン変換酵素阻害剤含有ペプチド溶液を精製
するにあたり、加水分解反応溶液から不溶物を除去し
たのち、該ペプチド濃度を１０重量％以上の溶液とし、
該溶液を合成吸着剤と接触させ、非吸着画分を分収
し、該合成吸着剤を水または塩水溶液で洗浄して更に
非吸着画分を回収した場合にかかる目的を達成できるこ
とを見いだし本発明を完成するに至った。本発明におい
てはペプチドを合成吸着剤に接触させる時に該ペプチド
濃度を１０重量％以上とすることに特徴をもち、濃度を
限定することにより苦味ペプチドが非常に効率によく除
去できるのである。以下、本発明について詳述する。
【０００９】本発明においては、まず蛋白質を水性媒体
中で蛋白分解酵素により加水分解してアンギオテンシン
変換酵素阻害剤ペプチド含有溶液を得る。本発明で用い
られる蛋白質とは天然物由来のものであれば特に制限は
なく、動物性蛋白質、植物性蛋白質いずれでも良い。具
体的には魚肉、貝肉、豚肉、牛肉、鶏肉類などの肉類が
挙げられ、特に肉類を５０℃以上の水中で加熱処理し、
水溶性蛋白質を抽出除去して得られる水不溶性の蛋白質
が好ましい。本発明における蛋白分解酵素とは、サーモ
ライシン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等公
知の蛋白分解酵素及び微生物が生産する蛋白分解酵素等
いずれも使用可能である。本発明における水性媒体とは
特に限定はなく、水、エタノール、メタノール等のアル
コール、ナトリウム、カリウム、マグムシウム、カルシ
ウム等の塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩の水溶液などが挙げら
れる。
中で蛋白分解酵素により加水分解してアンギオテンシン
変換酵素阻害剤ペプチド含有溶液を得る。本発明で用い
られる蛋白質とは天然物由来のものであれば特に制限は
なく、動物性蛋白質、植物性蛋白質いずれでも良い。具
体的には魚肉、貝肉、豚肉、牛肉、鶏肉類などの肉類が
挙げられ、特に肉類を５０℃以上の水中で加熱処理し、
水溶性蛋白質を抽出除去して得られる水不溶性の蛋白質
が好ましい。本発明における蛋白分解酵素とは、サーモ
ライシン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等公
知の蛋白分解酵素及び微生物が生産する蛋白分解酵素等
いずれも使用可能である。本発明における水性媒体とは
特に限定はなく、水、エタノール、メタノール等のアル
コール、ナトリウム、カリウム、マグムシウム、カルシ
ウム等の塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩の水溶液などが挙げら
れる。
【００１０】蛋白質を酵素で加水分解するには、蛋白質
の性状により処方は異なるが、難溶性の場合には熱水に
蛋白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズした後、酵素
を基質蛋白質量に対して０．００５〜１０重量％、好ま
しくは０．１〜２重量％添加し、温度５〜９０℃、好ま
しくは２０〜７０℃、反応時間１分〜３日間の反応条件
下でアミノ酸のペプチド結合が分解率５％以上になるま
で静置又は撹拌下、反応を続けてアンギオテンシン変換
酵素阻害ペプチドを得る。分解率は全窒素に対するアミ
ノ態窒素の％で表す。測定方法としては、Journal of A
gricultural and Food Chemistry 24 No.6 1090■1093
(1976)に基づく。
の性状により処方は異なるが、難溶性の場合には熱水に
蛋白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズした後、酵素
を基質蛋白質量に対して０．００５〜１０重量％、好ま
しくは０．１〜２重量％添加し、温度５〜９０℃、好ま
しくは２０〜７０℃、反応時間１分〜３日間の反応条件
下でアミノ酸のペプチド結合が分解率５％以上になるま
で静置又は撹拌下、反応を続けてアンギオテンシン変換
酵素阻害ペプチドを得る。分解率は全窒素に対するアミ
ノ態窒素の％で表す。測定方法としては、Journal of A
gricultural and Food Chemistry 24 No.6 1090■1093
(1976)に基づく。
【００１１】かくして得られたアンギオテンシン変換酵
素阻害ペプチド含有溶液は続いて精製される。精製工程
としては、まず上記で生成した加水分解生成物から不溶
物を分離除去して液体分を回収する。不溶物の除去にあ
たっては、遠心分離、濾過、デカンテーションなどの通
常の固液分離方法のいずれかが採用される。不溶物を除
去した後の液体分はペプチド濃度が１０重量％以上、好
ましくは２０〜５０重量％の溶液となるように調製され
る。調製方法としてはフラッシュ式、遠心薄膜式などの
減圧濃縮法、限外濾過膜濃縮法、逆浸透膜濃縮法などが
採用される。かかるペプチド濃度が１０重量％未満の場
合は本発明の優れた効果は発揮されず、苦味ペプチドの
除去が充分に行えない。
素阻害ペプチド含有溶液は続いて精製される。精製工程
としては、まず上記で生成した加水分解生成物から不溶
物を分離除去して液体分を回収する。不溶物の除去にあ
たっては、遠心分離、濾過、デカンテーションなどの通
常の固液分離方法のいずれかが採用される。不溶物を除
去した後の液体分はペプチド濃度が１０重量％以上、好
ましくは２０〜５０重量％の溶液となるように調製され
る。調製方法としてはフラッシュ式、遠心薄膜式などの
減圧濃縮法、限外濾過膜濃縮法、逆浸透膜濃縮法などが
採用される。かかるペプチド濃度が１０重量％未満の場
合は本発明の優れた効果は発揮されず、苦味ペプチドの
除去が充分に行えない。
【００１２】次いで、該アンギオテンシン変換酵素阻害
ペプチド含有溶液を合成吸着剤と接触させ、非吸着画分
を回収する。接触方法としては、バッチ式の処理、連続
カラムによる処理のいずれでもよい。処理温度は特に限
定はないが、使用する樹脂の品質劣化などを考慮して５
〜８０℃程度で処理することが好ましい。バッチ式で処
理する場合には、使用する樹脂量を処理するアンギオテ
ンシン変換酵素阻害ペプチド乾燥重量の５〜２０倍重量
程度とし、３０〜１２０分程度撹拌した後、樹脂を濾過
除去して非吸着画分を回収すればよい。連続カラムによ
り処理する場合には、ＬＶ＝３ｃｍ以上／時間程度、Ｓ
Ｖ＝３以下／時間程度として処理すればよく、通常使用
する樹脂に対して、乾燥物重量として３〜２０倍重量程
度の基質の処理ができる。
ペプチド含有溶液を合成吸着剤と接触させ、非吸着画分
を回収する。接触方法としては、バッチ式の処理、連続
カラムによる処理のいずれでもよい。処理温度は特に限
定はないが、使用する樹脂の品質劣化などを考慮して５
〜８０℃程度で処理することが好ましい。バッチ式で処
理する場合には、使用する樹脂量を処理するアンギオテ
ンシン変換酵素阻害ペプチド乾燥重量の５〜２０倍重量
程度とし、３０〜１２０分程度撹拌した後、樹脂を濾過
除去して非吸着画分を回収すればよい。連続カラムによ
り処理する場合には、ＬＶ＝３ｃｍ以上／時間程度、Ｓ
Ｖ＝３以下／時間程度として処理すればよく、通常使用
する樹脂に対して、乾燥物重量として３〜２０倍重量程
度の基質の処理ができる。
【００１３】上記における合成吸着剤としては、例え
ば、芳香族系、アクリル系などの合成吸着剤を用いるこ
とができ、細孔半径分布が１０〜１０００Å程度のもの
が適当である。合成吸着剤の具体例としては、スチレン
ジビニルベンゼン系の樹脂として、ＨＰ−２０、ＨＰ−
２１、ＳＰ−８２５、ＳＰ−２０７、ＳＰ−８００、Ｓ
Ｐ−８５０（いずれも三菱化成（株）製）、アンバーラ
イトＸＡＤ−１、アンバーライトＸＡＤ−２、アンバー
ライトＸＡＤ−４、アンバーライトＸＡＤ−２０００
（いずれもオルガノ（株）製）など、アクリル系の樹脂
としてＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ（いずれも三菱化成
（株）製）、アンバーライトＸＡＤ−７、アンバーライ
トＸＡＤ−８（いずれもオルガノ（株）製）など、フェ
ノール系樹脂としてＳ７６１（住友化学工業（株）製）
などが挙げられる。
ば、芳香族系、アクリル系などの合成吸着剤を用いるこ
とができ、細孔半径分布が１０〜１０００Å程度のもの
が適当である。合成吸着剤の具体例としては、スチレン
ジビニルベンゼン系の樹脂として、ＨＰ−２０、ＨＰ−
２１、ＳＰ−８２５、ＳＰ−２０７、ＳＰ−８００、Ｓ
Ｐ−８５０（いずれも三菱化成（株）製）、アンバーラ
イトＸＡＤ−１、アンバーライトＸＡＤ−２、アンバー
ライトＸＡＤ−４、アンバーライトＸＡＤ−２０００
（いずれもオルガノ（株）製）など、アクリル系の樹脂
としてＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ（いずれも三菱化成
（株）製）、アンバーライトＸＡＤ−７、アンバーライ
トＸＡＤ−８（いずれもオルガノ（株）製）など、フェ
ノール系樹脂としてＳ７６１（住友化学工業（株）製）
などが挙げられる。
【００１４】そして、アンギオテンシン変換酵素阻害ペ
プチド含有溶液と接触後の該合成吸着剤は水または塩水
溶液で洗浄され、更に非吸着画分が回収される。塩水溶
液の使用は非吸着画分の回収時に水を用いると吸着した
苦味成分の溶離が見られる場合に用いられる。上記にお
ける塩水溶液とは特に制限はなくナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム、カルシウムなどの塩酸塩、炭酸塩、
硫酸塩などが挙げられる。特に、塩化ナトリウムが実用
的である。その使用濃度は１重量％〜飽和濃度、好まし
くは５〜２０重量％であり、使用量は合成吸着剤の充填
容積の１〜３倍量、好ましくは１．５倍量である。
プチド含有溶液と接触後の該合成吸着剤は水または塩水
溶液で洗浄され、更に非吸着画分が回収される。塩水溶
液の使用は非吸着画分の回収時に水を用いると吸着した
苦味成分の溶離が見られる場合に用いられる。上記にお
ける塩水溶液とは特に制限はなくナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム、カルシウムなどの塩酸塩、炭酸塩、
硫酸塩などが挙げられる。特に、塩化ナトリウムが実用
的である。その使用濃度は１重量％〜飽和濃度、好まし
くは５〜２０重量％であり、使用量は合成吸着剤の充填
容積の１〜３倍量、好ましくは１．５倍量である。
【００１５】かくして得られたアンギオテンシン変換酵
素阻害ペプチドは、そのまま使用しても良く、又後処理
加工して用いても良い。 本発明で得られるペプチドの
投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与
のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明のペ
プチドの投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の症
状・年令等により異なるが、通常１回０．００１〜１０
００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり
１〜３回である。本発明のペプチド類は通常、製剤用担
体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担
体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明の
ペプチド類と反応しない物質が用いられる。
素阻害ペプチドは、そのまま使用しても良く、又後処理
加工して用いても良い。 本発明で得られるペプチドの
投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与
のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明のペ
プチドの投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の症
状・年令等により異なるが、通常１回０．００１〜１０
００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり
１〜３回である。本発明のペプチド類は通常、製剤用担
体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担
体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明の
ペプチド類と反応しない物質が用いられる。
【００１６】具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マン
ニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプ
ン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケ
イ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチル
セルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロ
ース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケ
イ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガン
ト、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン
脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリ
ン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセ
ロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、
ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボ
ン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等
が挙げられる。
ニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプ
ン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケ
イ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチル
セルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロ
ース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケ
イ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガン
ト、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン
脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリ
ン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセ
ロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、
ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボ
ン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等
が挙げられる。
【００１７】剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。これらの製
剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、好ましくは
０．５〜７０％の割合で含有することができる。これら
の製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有していて
もよい。
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。これらの製
剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、好ましくは
０．５〜７０％の割合で含有することができる。これら
の製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有していて
もよい。
【００１８】
【作 用】本発明は天然物由来の蛋白質を加水分解し
て得られるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有
溶液から苦味ペプチドを効率よく精製する。
て得られるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有
溶液から苦味ペプチドを効率よく精製する。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて更に詳しく説
明する。 実施例１ カツオ節５．０ｇを９０℃の熱水中で１５分間撹拌下に
混合して水溶性蛋白質を抽出した後、２００メッシュ篩
分機を用いて固液分離を行い水不溶性蛋白質を主体とす
る残渣を得た。かかる残渣に水４０ｍｌを加え充分ホモ
ジナイズし、サーモライシンを作用させた後、１００℃
で１０分間煮沸後放置して上澄液を得た。サーモライシ
ンの作用条件は反応液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．０
とし、反応温度は６０℃で５時間静置反応を行った。酵
素量は基質の蛋白質量に対して１重量％添加した。
明する。 実施例１ カツオ節５．０ｇを９０℃の熱水中で１５分間撹拌下に
混合して水溶性蛋白質を抽出した後、２００メッシュ篩
分機を用いて固液分離を行い水不溶性蛋白質を主体とす
る残渣を得た。かかる残渣に水４０ｍｌを加え充分ホモ
ジナイズし、サーモライシンを作用させた後、１００℃
で１０分間煮沸後放置して上澄液を得た。サーモライシ
ンの作用条件は反応液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．０
とし、反応温度は６０℃で５時間静置反応を行った。酵
素量は基質の蛋白質量に対して１重量％添加した。
【００２０】上記の如く調製したアンギオテンシン変換
酵素阻害ペプチド混合溶液をペプチド濃度２５重量％に
濃縮し、かかる溶液１００ｍｌをスチレンジビニルベン
ゼン共重合体（商品名：ＨＰ−２０、三菱化成（株）
製）９０ｍｌを充填したカラム（φ２５×２００）にＳ
Ｖ０．５で通液して非吸着画分を回収し、更に水をＳＶ
０．５で通液して非吸着画分を回収した。かかる回収液
についてペプチド回収率、アンギオテンシン変換酵素阻
害活性の測定及び苦味の官能テストを行った。結果はま
とめて表１に示す。
酵素阻害ペプチド混合溶液をペプチド濃度２５重量％に
濃縮し、かかる溶液１００ｍｌをスチレンジビニルベン
ゼン共重合体（商品名：ＨＰ−２０、三菱化成（株）
製）９０ｍｌを充填したカラム（φ２５×２００）にＳ
Ｖ０．５で通液して非吸着画分を回収し、更に水をＳＶ
０．５で通液して非吸着画分を回収した。かかる回収液
についてペプチド回収率、アンギオテンシン変換酵素阻
害活性の測定及び苦味の官能テストを行った。結果はま
とめて表１に示す。
【００２１】ペプチド回収率
ケルダール法により測定した。アンギオテンシン変換酵素阻害活性（ＡＣＥ阻害活性）
の測定 アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Ｃｈｅｕ
ｎｇとＣｕｓｈｍａｎの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ ２０，１６３７(１９
７１)〕に準じて以下の方法で行った。 酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
（８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵 素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製） （１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。
の測定 アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Ｃｈｅｕ
ｎｇとＣｕｓｈｍａｎの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ ２０，１６３７(１９
７１)〕に準じて以下の方法で行った。 酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
（８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵 素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製） （１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。
【００２２】反応は１Ｎ−ＨＣｌの２５０μｌを用いて
終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れ
Ｖｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢
酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを
留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、
抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（Ｏ
Ｄ228）を測定した。阻害率は阻害剤なしで反応したと
きのＯＤ228を１００％とし、反応時間０分のときのＯ
Ｄ228を０％として求め阻害率５０％の時の阻害剤（本
発明のペプチド組成物）の濃度ＩＣ50（μｇ／ｍｌ）で
活性を表示した。苦味の官能テスト 苦味除去後のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを
凍結乾燥して得られた粉末を１０名のパネラーで評価し
た。評価方法としてはパネラー１名につき１０点を与
え、苦味のない状態を１０点として苦味の少なさを１０
０点満点で表した。
終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れ
Ｖｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢
酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを
留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、
抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（Ｏ
Ｄ228）を測定した。阻害率は阻害剤なしで反応したと
きのＯＤ228を１００％とし、反応時間０分のときのＯ
Ｄ228を０％として求め阻害率５０％の時の阻害剤（本
発明のペプチド組成物）の濃度ＩＣ50（μｇ／ｍｌ）で
活性を表示した。苦味の官能テスト 苦味除去後のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを
凍結乾燥して得られた粉末を１０名のパネラーで評価し
た。評価方法としてはパネラー１名につき１０点を与
え、苦味のない状態を１０点として苦味の少なさを１０
０点満点で表した。
【００２３】実施例２
アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合溶液の濃度
を１０重量％とし、かかる溶液を２５０ｍｌ用いて合成
吸着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。 実施例３ アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合溶液の濃度
を２０重量％とし、かかる溶液を１２５ｍｌ用いて合成
吸着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。 実施例４ アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合溶液の濃度
を５０重量％とし、かかる溶液を５０ｍｌ用いて合成吸
着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。
を１０重量％とし、かかる溶液を２５０ｍｌ用いて合成
吸着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。 実施例３ アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合溶液の濃度
を２０重量％とし、かかる溶液を１２５ｍｌ用いて合成
吸着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。 実施例４ アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合溶液の濃度
を５０重量％とし、かかる溶液を５０ｍｌ用いて合成吸
着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。
【００２４】実施例５
実施例１においてサーモライシンをペプシンに代えて実
験を行った。ペプシンの作用条件としては塩酸でｐＨ
１．６として、反応温度は３７℃で５時間静置反応し
た。結果はまとめて表１に示す。 比較例１ アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合溶液の濃度
を５重量％とし、かかる溶液を５００ｍｌ用いて合成吸
着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。
験を行った。ペプシンの作用条件としては塩酸でｐＨ
１．６として、反応温度は３７℃で５時間静置反応し
た。結果はまとめて表１に示す。 比較例１ アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合溶液の濃度
を５重量％とし、かかる溶液を５００ｍｌ用いて合成吸
着剤に接触させた以外は実施例１に準じて実験を行っ
た。結果はまとめて表１に示す。
【００２５】
【表１】
ペプチド ＡＣＥ阻害活性 苦味の官能 回収率（％） (μｇPro./ｍｌ) テスト
実施例１ ７３．０ ５５ ９０
実施例２ ７１．５ ５５ ８５
実施例３ ７２．０ ５６ ９０
実施例４ ７３．５ ５５ ９５実施例５ ７２．５ ２７０ ９０ 比較例１ ７０．６ ５６ ３０
【００２６】
【発明の効果】本発明は、天然物から調製でき、殊に血
圧降下剤又は血圧降下食品として有用であるアンギオテ
ンシン変換酵素阻害ペプチド含有溶液を効率良く精製で
きる。
圧降下剤又は血圧降下食品として有用であるアンギオテ
ンシン変換酵素阻害ペプチド含有溶液を効率良く精製で
きる。
Claims (4)
- 【請求項１】 蛋白質を水性媒体中で蛋白分解酵素によ
り加水分解して得られたアンギオテンシン変換酵素阻害
ペプチド含有溶液を精製するにあたり、加水分解反応
液から不溶物を除去したのち、該ペプチド濃度を１０重
量％以上の溶液とし、該溶液を合成吸着剤と接触させ
て非吸着画分を分収し、該合成吸着剤を水または塩水
溶液で洗浄して更に非吸着画分を回収することを特徴と
するアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法 - 【請求項２】 蛋白質が動物性蛋白質であることを特徴
とする請求項１記載のアンギオテンシン変換酵素阻害ペ
プチドの精製方法 - 【請求項３】 蛋白質が肉類であることを特徴とする請
求項１記載のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの
精製方法 - 【請求項４】 肉類を５０℃以上の水中で加熱処理し、
水溶性蛋白質を抽出除去して得られる水不溶性の蛋白質
であることを特徴とする請求項１記載のアンギオテンシ
ン変換酵素阻害ペプチドの精製方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11415093A JP3430176B2 (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11415093A JP3430176B2 (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06298794A JPH06298794A (ja) | 1994-10-25 |
| JP3430176B2 true JP3430176B2 (ja) | 2003-07-28 |
Family
ID=14630406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11415093A Expired - Lifetime JP3430176B2 (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3430176B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3592593B2 (ja) * | 1999-10-15 | 2004-11-24 | 日本合成化学工業株式会社 | アンギオテンシン変換酵素阻害剤 |
| TWI225070B (en) | 1999-12-01 | 2004-12-11 | Food Industry Res & Dev Inst | Novel peptides used as angiotensin converting enzyme inhibitor and preparation process thereof |
| JP2006348050A (ja) * | 2006-09-20 | 2006-12-28 | Shirako:Kk | 血管拡張による血流促進性医薬及び健康食品組成物 |
| US8673862B1 (en) | 2012-09-06 | 2014-03-18 | Food Industry Research And Development Institute | Peptides and use thereof in the inhibition of angiotensin converting enzyme |
| WO2015140467A1 (fr) * | 2014-03-18 | 2015-09-24 | Roquette Freres | Procédé de perméabilisation thermique d'une biomasse de microalgues |
-
1993
- 1993-04-16 JP JP11415093A patent/JP3430176B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06298794A (ja) | 1994-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3093378B2 (ja) | アンギオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法 | |
| JP3430176B2 (ja) | アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの精製方法 | |
| JP3110075B2 (ja) | アンギオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法 | |
| JP3119674B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP3040389B2 (ja) | ペプチドの製造法 | |
| JP3009718B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP3073762B2 (ja) | アンギオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法 | |
| JPH05112465A (ja) | アンギオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法 | |
| JP2873327B2 (ja) | アンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
| JP2001106699A (ja) | 新規なヘクサペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
| JP3992143B2 (ja) | 新規生理活性ペプチド | |
| JP3009719B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP2001106698A (ja) | 新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
| JP3483212B2 (ja) | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 | |
| JP3465921B2 (ja) | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 | |
| JP3009720B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP3112694B2 (ja) | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 | |
| JP3220420B2 (ja) | ペンタペプチド、その製造方法およびその用途 | |
| JP3108920B1 (ja) | 新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
| JP2951428B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP3031692B2 (ja) | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 | |
| JP2965683B2 (ja) | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 | |
| JP3012292B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP3465922B2 (ja) | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 | |
| JP2953634B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090516 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100516 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100516 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110516 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110516 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120516 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130516 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |