JPH0458947B2

JPH0458947B2 -

Info

Publication number: JPH0458947B2
Application number: JP63151019A
Authority: JP
Inventors: Hideyo Uchiwa; Ryuji Sugai; Umeji Murakami; Taira Takemoto
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1988-06-17
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1992-09-18
Also published as: JPH02167052A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、高血圧予防のための健康食品等とし
て用いて有用な経口摂食組成物に関するものであ
る。

〔従来の技術〕

今日、高血圧症は我が国において死亡率の上位
を占める疫病の一つであり、その治療あるいは予
防は緊急かつ重要な課題となつている。

高血圧症には二次性高血圧症と、本態性高血圧
症とがあるが、後者の発症機序には食塩の過剰摂
取、遺伝性因子、レニン−アンジオテンシン−ア
ンドステロン調節不全、交換神経系緊張によるカ
テコラミン過剰分泌などが単独あるいは相互に関
連して発症の要因となつているとされている。

元来我が国は味噌、醤油といつた高塩含有の調
味料を用い、保存食の漬物や干物を含め味付けに
塩を基本としており、全国平均で１日当り12g、
北部では20gを超える摂取量であり、ヒトの適量
をはるかに超えている。過剰に摂取された食塩
は、体内の細胞外液量を増加させ尿として排泄さ
れるまでの間、循環血液量を増加させ、心拍出量
の増加などを招き、その結果血圧を上昇させる。
食塩過剰摂取が長期にわたり高血圧状態が持続す
ると、血管壁が肥厚し、硬化状態となり、血管抵
抗を増加させ高血圧を増悪させるのである。

かかる観点から高血圧予防の対策の１つとして
減塩食事療法が上げられるが、ヒトの欲望の一つ
である食欲の味覚を減じさせる事は極めて強い苦
痛を供なう。そこで、食塩等を摂取しても、それ
と供に、血圧の上昇を制御出来るものが望まれて
いる。

〔発明の解決課題〕

本発明者等は、高血圧症あるいは高血圧傾向の
人の食塩等高ナトリウム含有物摂取に際する血圧
の上昇を調節する経口摂取組成物を提供すべく鋭
意研究を行なつた結果、意外にも安全性の高いカ
ゼイン由来のアンジオテンシン転換酵素（以下、
ACEと略記する）阻害ペプチドを食塩等に配合
することにより、血圧上昇が緩和させる事を見出
し、本発明を完成するに至つた。

〔発明の構成〕

ナトリウム塩含有物に、カゼインを蛋白質分解
酵素により分解して得られるアンジオテンシン転
換酵素を阻害するペプチドを含有せしめたことを
特徴とする、経口摂食組成物である。

本発明に云うカゼイン由来のACE阻害ペプチ
ドとしては、例えば以下に示す如きアミノ酸配列
からなるCEI₁₂、CEIβ₇等があり、それらは単独
で、もしくは混合物として用いられる。

CEI₁₂：Phe−Phe−Val−Ala−Pro−Phe−Pro
−Glu−Val−Phe−Gly−Lys CEIβ₇：Ala−Val−Pro−Tyr−Pro−Gln−Arg これらACE阻害ペプチドのうち、CEI₁₂および
CEIβ₇は、牛由来カゼイン（特に後者はβ−カゼ
イン）のトリプシン加水分解物から得られる。

CEI₁₂の調製は、特開昭58−109425号公報等に
よつて公知の方法に準じて例えば以下のようにし
て行われる。

牛由来カゼイン（α−カゼインまたはβ−カゼ
イン）を、PH5.0〜9.0の条件下トリプシンにより
分解し、分解物から加熱処理あるいは酸処理によ
りトリプシンおよび未分解カゼインを沈降・除去
せしめる。次に、母液を、要すればアルカリで中
和し、減圧下に２〜３倍に濃縮した上、セフアデ
ツクスＧ−25等を充填したカラムに添加し、蒸留
水で溶出させてACE阻害活性を示す画分を集め、
さらに必要に応じて同様の精製を繰返した後、活
性画分から、例えば減圧濃縮あるいは有機溶媒添
加等の方法によりCEI₁₂を取得する。

また、CEIβ₇は、その出発原料がβ−カゼイン
に限定されることを除けば、上記のCEI₁₂と全く
同様にしてこれを調製することができる。この場
合、トリプシン分解物中にはCEIβ₇とCEI₁₂とが
同時に生成してくることになるが、それらはSP
セフアデツクスカラムクロマトグラフイーにより
容易に分別が可能である。

又、より有利には有機化学的な合成手法を用い
ることができる。

以下にCEI₁₂の合成法の一例を示す。ここでは、
不溶性担体としてポリスチレン樹脂を用いる固相
対称酸無水物法を利用し、ペプチド合成を行う。
なお、ここでは、アミノ酸はすべてＬ体を意味
し、アミノ酸の保護基の略号はそれぞれ次の残基
を表す。

Boc：tert.Butyloxy−carbonyl基 PAM：ｐ−methoxy phenyl acetamidomethl
resin Bzl：ベンジル基Ｚ：ベンジルオキシカルボニル基 Tos：ｐ−トリルスルホニル基 AAⁿ：ｎ番目のアミノ酸ポリスチレン樹脂に架橋されたAA¹（AA¹−
PAM）をTFAにより、脱保護基反応により、Ｈ
−AA¹−PAMを合成し、それにBoc−AA²−OH
をジクロルメタン中でDCCを用い活性化したをジメチルホルムアミド中で縮合させ、Boc−
AA²−AA¹−PAMを合成し、未反応のAA¹−
PAMを無水酢酸を用い、キヤツピングする。得
られたBoc−AA²−AA¹−PAMを再びTFAを用
い、脱保護基反応を行ない、同様にしてBoc−
AA³−OHを縮合し、以下同様にしてAA¹²まで
縮合反応を行なう。なお、用いるアミノ酸側鎖の
官能基は以下の様に封鎖しておく。

Arg（Tos），Asp（Ｏ−Bzl），Cys（４−
Methylbenzyl），Glu（Ｏ−Bzl），Lys（２−
Chlorophenyloxy carbonyl），Ser（Bzl），Thr
（Bzl），Try（２−Bromophenyloxy carbonyl），
His（Tos）縮合反応終了後、HFを用い脱保護基
反応を行ない、Boc及びPAM、側鎖の保護基を
除き、Ｈ−AA¹²…………AA¹−OHを得る。

ここでAA¹＝Lys，AA²＝Gly，AA³＝Phe，
AA⁴＝Val，AA⁵＝Glu，AA⁶＝Pro，AA⁷＝
Phe，AA⁸＝Pro，AA⁹＝Ala，AA¹⁰＝Val，
AA¹¹＝Phe，AA¹²＝Pheを示す。

また、これらを混合物として大量の試料を得る
為には、カゼインを蛋白質分解酵素により分解
後、その分解液を高温加熱処理し、この上清をそ
のまま得たり、又、この上清を更に酸処理し沈殿
物を除いた上清をポアサイズMW＝8000以下の透
析膜により透析し、透析液をそのままあるいは、
濃縮・凍結乾燥等の操作を行えばよい。

本製造に使用するカゼインは各種酸カゼイン、
カゼインナトリウム、カゼインカルシウム等のカ
ゼインが最も良いが、牛乳、スキムミルク等の未
精製のものでも原料として用いることができる。
本製法に従えば、この原料カゼインを水に溶解
し、トリプシン又はトリプシンを含む酵素剤を加
える。本発明に使用するトリプシンまたはそれを
含む酵素剤としては、市販の膵臓性の酵素（パン
クレアチン）でも十分であるが、収率等の点か
ら、結晶グレードのものが好ましい。

トリプシン以外の蛋白質加水分解酵素として
は、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、ズブ
チリシン等の蛋白ペプチド鎖内部の結合を加水分
解する所謂公知のエンドペプチダーゼであれば可
能である。

又、カゼインを酵素により分解する方法は公知
のいずれの方法でも良い。

以上の如きカゼイン由来のACE阻害ペプチド
類をナトリウム塩含有物に適当な形状で適宜混入
して経口摂食用に供する。ナトリウム塩含有経口
摂食物の例としては、食塩、味噌、醤油、グルタ
ミン酸ナトリウム等の調味料類、またこれらを用
い加工された食品ないしは嗜好品、例えば漬物、
干物、塩辛、佃煮、バター、マヨネーズ、ソーセ
ージ、菓子類、ナツツ類、スポーツ飲料等が挙げ
られる。

これら経口摂食物の製造方法としては、食品製
造に於ける通常の方法を使用することができる。

配合量は、経口摂食物ナトリウム塩量換算で
1g当りACE阻害ペプチドを５mg〜4gの範囲が適
当であり、かかる範囲から摂食目的に応じて適宜
の量が選択される。

〔発明の効果〕

本発明により、安全性が高く、有効性の高い血
圧上昇緩和ナトリウム塩含有経口摂食物の提供が
可能となつた。

以下、製造例、試験例、実施例によつて本発明を
更に、詳細に説明する。

製造例１ 50リツトルジヤーフアメンター（ミツワ製）に
牛由来カゼイン（和光純薬製、生化学用）2.5Kg
を35リツトルのH₂Ｏに懸濁し、アンモニア水
（和光純薬製、25％NH₄OH）によつてPHを7.6に
調製する。37℃に保温しトリプシン（シグマ製ト
リプシンEC3，４，21，４牛膵臓由来Type）
6.25gを加え、攪拌しながら18時間消化を行つた。
これをオートクレーブ（121℃，20分）し、更に
concHClを加え、PH1.0とし、未反応Casein等を
沈澱させた。これを10000rpm，４℃で連続遠心
分離を行ない、沈澱物を除いた後、上澄液を透析
チユーブ（スペクトラ、ポア６分画分子量
1000）を用いて流水下にて室温で透析を行つた。
チユーブのシールは、スペクトラ製のクローサー
で行つた。透析の終点は、透析チユーブ内液の伝
導度が4ms／cm以下に低下した時とした。（通常
３〜4hr必要）透析液を10000rpm，for 15min，４℃で遠心
分離し、不溶物を除いた後、凍結乾燥を行ないペ
プチド940gを得た。

本ペプチドはCEI₁₂とCEIβ₇を主体とするACE
阻害ペプチドであり、ID₅₀＝0.20mg／ml（酵素反
応溶液中の濃度）である。

〔ACE阻害ペプチドのACE阻害活性の測定〕アンジオテンシン転換酵素液（ACE液）の
調製 5gのラビツトラングアセトンパウダー（シグ
マ社製）を50mlの0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.3）に
溶解し、40000xg，40分の条件下で遠心処理し、
その上清液をさらに、上記緩衝液で、10倍に稀釈
し、アンジオテンシン転換酵素液を得た。

活性の測定試料を試験管に0.03ml入れ、これに基質とし
て、250μのヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−
ロイシン〔シグマ社（Sigma.Co.）製、最終濃度
5mM、NaCl300mMを含む。〕を添加し、37℃で
10分間保温後、上記酵素液を0.1ml添加し、37℃
で30分間反応させた。その後、1N塩酸0.25mlを
添加して反応を停止させた後、1.5mlの酢酸エチ
ルを加え、15秒間激しく攪拌した。その後、
3500rpmで15分間遠心して、酢酸エチル層１mlを
採取した。その酢酸エチル層を120℃で30分間加
熱し、溶媒を除去した。溶媒除去後、蒸留水１ml
を添加し、抽出されたヒプリル酸の吸収（228nm
の吸光度）を測定し、これを酵素活性とした。

阻害率は、次式より算出した。

阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×100％Ａ：阻害剤を含まない場合の228nmの吸光度Ｂ：阻害添加の場合228nmの吸光度そして、阻害率50％の時の試料濃度をID₅₀とす
る。

次に製造例１で得たペプチドの食塩摂取による
血圧上昇の抑制作用について試験した。

試験例１製造例１で得たペプチドと食塩を飼料にまぜ自
由に摂食させ３週間飼育した時の血圧上昇抑制作
用をみた。

(1) 試験方法４週令の自然発症高血圧ラツト（日本チヤール
ズ−リバー社）を温度23±３℃、湿度50±10％に
保たれた動物室に収容し１週間予備飼育した後、
健常なものを試験に用いた。飼料はオリエンタル
酵母社製MF（粉末飼料）に終濃度３％になるよ
うに食塩を添加したものを、飲水には１％食塩水
を用い、いずれも自由に摂取させる。またペプチ
ド投与群として、これに製造例１で得られたペプ
チドを、ラツト体重１Kg当り１日約3.0gとなるよ
うに調製しながら飼料に配合した。

対照として、食塩、ペプチドを配合しない飼料
および水を摂取させたものを用いた。

血圧および心拍数の測定を１週間に２度行なつ
た。測定は、非観血的無加温式尾動脈血圧・心拍
数測定装置を用い、１匹につき３回測定した値の
平均値を求めることにより行なつた。

結果は１群５匹の平均値で示した。

(2) 試験結果第１図に血圧測定結果を示す。

第１図から明らかな通り、自然発症高血圧ラツ
トは食塩の過剰摂取により有意な血圧上昇を示
し、これを、本発明のペプチドの配合により有意
に血圧の上昇を抑制し、緩和していることが認め
られた。

一方心拍数は、いずれの群も有意な差は認めら
れず一定であつた。

又、飼料摂取量、体重変化は対照と同様であ
り、安全面でも良好である事を確認した。

以下に実施例を示す。

実施例１、食卓塩食塩に重量当り５％の製造例１のペプチドを混
合することにより作成した。

実施例２、味噌通常の製造法にて調製された信州味噌に重量当
り0.5％の製造例１のペプチドを添加、練込み作
成した。

実施例３、醤油通常の製造法にて調製された、こいくち醤油に
100ml当り１％の製造例１のペプチドを添加、攪
拌し、作成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、自然発症高血圧ラツトに、食塩また
は食塩とカゼイン分解ペプチド含有飼料を３週間
自由に摂食させた試験群と対照群の血圧の経時変
化を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１ナトリウム塩含有物に、カゼインを蛋白質分
解酵素により分解して得られるアンジオテンシン
転換酵素を阻害するペプチドを含有せしめたこと
を特徴とする、経口摂食組成物。