JPH04282400A - アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシン変換
酵素（以下ＡＣＥと称す）阻害活性を有し、高血圧の治
療あるいは予防等に有用な新規なペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】レニン−アンジオテンシン系が、高血圧
や心不全などの循環器系疾患の病態に、重要な意義を有
することは、多くの研究によって明らかにされている。 このレニン−アンジオテンシン系には、ＡＣＥが存在し
、この酵素が血圧の調節に関して深い関係を有している
。すなわちＡＣＥは、活性前躯体であるオリゴペプチド
・アンジオテンシンＩのカルボキシル基末端からジペプ
チドを切り出し、血管収縮性を有するアンジオテンシン
ＩＩを生成する。また、降圧ペプチド又はブラジキニン
を分解する作用も有しており、血圧上昇に作用する酵素
である。従ってアンジオテンシンＩＩの生成を阻害する
、すなわちＡＣＥの活性を阻害することによって、血圧
上昇を抑制することができる。以上のことから天然物、
合成物についてＡＣＥ阻害物質の検索が行われ、カプト
プリルをはじめとする種々の阻害剤の開発がなされてい
る。

【０００３】さて、ＡＣＥは、上述のごとくジペプチド
を切り出すアミノペプチダーゼであるので、ＡＣＥの結
合部位に対する親和力を有するペプチドは、基本的には
ＡＣＥの阻害物質になりうる。従来、タンパク質は、種
々の消化酵素の働きでアミノ酸にまで分解され、単なる
栄養分として吸収されると考えられてきたが、最近一部
のタンパク質は小腸からオリゴペプチドとして吸収され
るという報告もなされ、そのペプチドが生体にホルモン
様作用を及ぼす可能性は高い。この様な背景のもと、食
品由来の生理活性ペプチドの検索が各方面で行われてい
る。すでに免疫賦活などの作用を有するペプチドが公知
となっており、ＡＣＥを阻害するペプチドがカゼイン、
大豆等の酵素分解物中に存在することが知られているが
、経口投与によるＡＣＥ阻害活性の有効性を示す具体的
なペプチドについては知られていないのが現状である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、経口
投与においても優れたＡＣＥ阻害活性を有し、高血圧の
治療又は予防に有用なペプチドを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、乳清タ
ンパク質をトリプシン分解して得られるペプチドを有効
成分とすることを特徴とするＡＣＥ阻害活性を有するペ
プチドが提供される。

【０００６】以下本発明を更に詳細に説明する。

【０００７】本発明のペプチドは、ＡＣＥ阻害活性を有
し、且つ乳清タンパク質をトリプシン分解して得られる
ペプチドを有効成分とする。

【０００８】本発明において有効成分として用いるペプ
チドは、乳清タンパク質を出発原料として、トリプシン
により分解して得られるものであって、好ましくは分子
量１０００以下程度のペプチドである。該出発原料とし
て用いる乳清タンパク質としては、例えばチーズホエー
、酸ホエー等を挙げることができる。また該乳清タンパ
ク質を分解するトリプシンは、タンパク質分解酵素の一
種であって、市販品を用いることができる。前記乳清タ
ンパク質を分解する際のトリプシンの仕込み量は、好ま
しくは乳清タンパク質１００重量部に対して、０．１〜
１重量部の範囲である。

【０００９】次に本発明のペプチドを製造方法により説
明する。

【００１０】本発明のペプチドを製造するには、例えば
ｐＨ６〜９の条件下、好ましくは予め低分子物質を除去
した乳清タンパク質とトリプシンとを、反応温度２５〜
５０℃において、８〜２４時間反応させ、乳清タンパク
質の分解物を得、次いで、加熱処理及び／又は酸処理に
より、トリプシン及び未分解のタンパクを沈殿除去した
後、ペプチドを精製する方法又は前記分解物にメタノー
ル、エタノール等の有機溶媒を添加してペプチドを抽出
した後、ペプチドを精製する方法等により得ることがで
きる。この際得られるペプチドは、有機溶剤等を除去し
た後、水溶液とし、限外濾過等により分子量の大きなペ
プチドを除去してから精製するのが好ましい。該精製は
、例えば商品名「ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｃ１８−ＯＰＮ」
（ナカライテスク社製）等の逆相系樹脂を充填したカラ
ムに、前記得られた分解物を添加し、非吸着部分を良く
洗浄した後、メタノール等の有機溶媒により溶出させ、
ＡＣＥ阻害活性を示す画分のみを収集する方法、高速液
体クロマトグラフィーにより大量分取する方法又はゲル
濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー等の生化学的手段により精製する方法等によって行な
うことができる。

【００１１】得られるペプチドは、液状又は粉末化処理
等を行うことによって有効成分とすることができ、必要
に応じて、塩酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、
酒石酸塩等の製薬上許容される塩を付加することも可能
である。

【００１２】本発明のペプチドは、そのまま又は健康食
品或いは機能性食品として経口投与することができる他
、静脈注射投与等によって投与することができる。この
際本発明であるペプチドの摂取量は、摂取する対象によ
って異なるが、例えば人の場合、有効成分であるペプチ
ドの固形分換算で、通常１日当り１００ｍｇ程度以上摂
取するのが好ましく、特に本発明のペプチドは天然物由
来のものであって毒性の心配がないので、毎日常用する
ことにより優れた効果を得ることができる。

【００１３】

【発明の効果】本発明のペプチドは、優れたＡＣＥ阻害
活性を有し、安全性にも優れているので、医薬、健康食
品又は機能性食品等に使用することにより、高血圧の治
療又は予防等に優れた効果が期待できる。

【００１４】

【実施例１】チーズホエーパウダー１００ｇを蒸留水１
リットルに溶解した後、透析チューブ（分画分子量１２
０００〜１４０００）を用いて、４℃流水中で透析を２
日間行い、リボフラビン、乳糖等の低分子物質を除去し
た。次いで透析内液を１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ
８．０に調製した後、塩化カルシウムを終濃度５ｍＭに
なるように添加し、３７℃に保温して、トリプシン（シ
グマ化学社製のトリプシン、牛すい臓由来ＴｙｐｅＸＩ
ＩＩ、ＴＰＣＫ処理、１２２００ＢＡＥＥ　ｕｎｉｔ／
ｍｇプロテイン）１００ｍｇを加え、撹拌しながら１２
時間分解を行った。次に得られた分解液に塩酸を添加し
てｐＨ３．０とし、未反応のタンパク質およびトリプシ
ンを沈殿させた。遠心分離（８０００ｒｐｍ，３０分間
）により沈殿物を除去した後、さらに限外濾過器（アド
バンテック東洋社製、商品名「ＵＨＰ−１５０」、濾過
膜：フジフィルター工業社製、分画分子量１００００）
で高分子物質を除去した。得られた濃縮液を、０．０１
重量％ＴＦＡ溶液で膨潤させた逆相系樹脂［商品名「Ｃ
ＯＳＭＯＳＩＬ　　Ｃ１８−ＯＰＮ」（ナカライテスク
社製）］を充填したカラム（φ３．５×５０ｃｍ）に通
し、０．０１重量％ＴＦＡ溶液で洗浄後、０．０１重量
％ＴＦＡ−メタノールの直線濃度勾配で溶出を行なった
。流速は３ｍｌ／分、濃度勾配は０．２％／分とした。 最もアンジオテンシン変換酵素阻害活性の強い画分（グ
ラジエント開始後、１０分から５０分まで）を収集し、
減圧濃縮によりメタノールを除き、凍結乾燥により白色
粉末１００ｍｇを得た。

【００１５】得られたペプチドを、下記分析条件により
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。 その結果を図１に示す。

【００１６】分析条件 カラム：Ｒ−ＯＤＳ−５　　４．６×２５０ｍｍ　　Ｙ
ＭＣ社製 Ａバッファー：０．０１％ＴＦＡ溶液、Ｂバッファー：
アセトニトリル 流　　速：１ｍｌ／ｍｉｎ 図１に１０分から６０分までのＢバッファーのリニアグ
ラジエントパターンを示す。

【００１７】

【試験例１】実施例１で調製したペプチドを試験管に０
．０４ｍｌ入れた後、０．１Ｍホウ酸緩衝液（０．３Ｍ
，ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．３）で終濃度を５ｍＭに調
整した酵素基質（ヒプリヒスチジルロイシン、シグマ化
学社製）０．２ｍｌを添加し３７℃で１０分間保温した
。次いで、蒸留水を添加して２５ｍＵ／ｍｌに成るよう
に調整したうさぎ肺のＡＣＥ（シグマ化学社製）０．０
４ｍｌを添加し、３７℃、３０分間反応させた。その後
、１Ｎ塩酸０．２５ｍｌを添加し反応を終了した後、１
．７ｍｌの酢酸エチルを加え、２０秒間激しく撹拌し、
３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、酢酸エチル層
を１．４ｍｌ採取した。得られた酢酸エチル層を１２０
℃で４０分間加熱し溶媒を除去した後、蒸留水を１．０
ｍｌ添加し、抽出したヒプリル酸の吸収（２２８ｎｍの
吸光度）を測定して、これを酵素活性とした。

【００１８】次の式からペプチドの阻害活性ＩＣ５０［
ＡＣＥの活性を５０％阻害するために必要な試料濃度（
μｇ／ｍｌ）］を測定したところ、実施例１及び実施例
２で調製したペプチドは、共にペプチドの阻害活性ＩＣ
５０が、４０μｇ／ｍｌであった。 阻害率＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ）×１００％Ａ：試料（
ペプチド）を含まない場合の酵素活性（２２８ｎｍの吸
光度） Ｂ：試料添加の場合の酵素活性（２２８ｎｍの吸光度）
Ｃ：酵素および試料を添加しない場合の酵素活性（２２
８ｎｍの吸光度）

【００１９】

【試験例２】水及び飼料を自由に摂取させて飼育した１
２週令雄の自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）（日本チャ
ールズリバー社、１群５匹）に、試料（実施例１で調製
したペプチドを生理食塩水に溶解したもの）を、該ラッ
トへ胃ゾンデにより強制的に経口投与し、６時間後に血
圧を測定した。試料の投与量は、ラットの体重１Ｋｇ当
り、１２５ｍｇ，５００ｍｇ、１０００ｍｇとした。ま
た血圧の測定には、非観血式血圧測定装置（商品名「Ｐ
Ｅ−３００」、ＮＡＲＣＯ　ＢＩＯ−ＳＹＳＴＥＭ社製
）を用い、ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により最高血圧を測定
した。その結果を１群の平均値として表１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】

【試験例３】１２週齢雄のＳＨＲ（１群３匹）を水及び
試料は自由摂取させ、馴化飼育した後、前日絶食させた
ＳＨＲに、生理食塩水に溶解した実施例１で調製したペ
プチドを、胃ゾンデにより強制経口投与（１０００ｍｇ
／ｋｇ体重）した。対照群（１群６匹）には、生理食塩
水のみを与えた。次いで試験例２と同様に血圧測定を行
なった。この際血圧測定は、強制投与後２，３，５，７
時間後に行なった。その結果を１群の平均値で表２に示
す。

【００２２】

【表２】

【００２３】試験例２及び３の結果から、本発明のペプ
チドが、強制経口投与により血圧を低下させ得ることが
判った。

【００２４】

【試験例４】１２週齢雄のＳＨＲ（１群６匹）を、試験
例３と同様に馴化飼育した後、蒸留水に溶解させた試料
２１．４ｍｇ／ｍｌを給水瓶に入れ、自由に６日間摂取
させた。１日の平均摂取量は、約３６０ｍｇ（体重１ｋ
ｇあたり１０００ｍｇに相当）であった。また飼料は自
由摂取させた。６日目以降は対照群（１群６匹）と同じ
水を与え飼育した。血圧は１日１回、試験例１と同じ方
法で測定した。その結果を１群の平均値として表３に示
す。

【００２５】

【表３】

【００２６】表３の結果より、本発明のペプチドは少量
ずつ長期に摂取することによっても血圧を有意に降下さ
せることが判った。また投与を中止すると徐々に血圧は
上昇し、投与前の血圧にまで回復した。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における本発明の精製されたＡＣＥ阻
害ペプチドのＨＰＬＣによる分析結果を示すグラフであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　乳清タンパク質をトリプシン分解して
   得られるペプチドを有効成分とすることを特徴とするア
   ンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。