JPH04275298A

JPH04275298A - ぺプチド及びこれを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤

Info

Publication number: JPH04275298A
Application number: JP3059286A
Authority: JP
Inventors: Seiji Murakami; 村上　成治; Jun Yamakoshi; 山越　純; Emiko Kinoshita; 恵美子木下; Takuo Koga; 拓郎古賀; Yasuhiko Nakajima; 中嶋　康彦; Mamoru Kikuchi; 護菊地
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1991-03-02
Filing date: 1991-03-02
Publication date: 1992-09-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチド及び該
ペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻
害剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】最近、アンジオテンシン変換酵素の阻害
剤を本態性高血圧の予防及び治療に有用な医薬品又は食
品に利用できることが期待されている。アンジオテンシ
ン変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１）は、不活性なアン
ジオテンシンＩに作用し、血管収縮、アルドステロン分
泌促進等の強い血圧上昇作用を有するアンジオテンシン
ＩＩを生じさせる昇圧系酵素である。　　またアンジオ
テンシン変換酵素は、強い血管拡張作用を有するブラジ
キニンを分解し、不活性化させる働きをしている酵素で
ある。従って、このアンジオテンシン変換酵素の活性を
阻害することにより、血圧上昇を防ぐことが可能である
。

【０００３】従来、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤
としては、例えば蛇毒より得られたペプチド性阻害剤の
他、既に医薬品として用いられているカプトプリル、エ
ナラプリル等の合成化合物が知られている。さらに、牛
乳カゼインのトリプシン加水分解物中からアンジオテン
シン変換酵素阻害活性を有するペプチドが見出されてい
る（例えば、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９
，１４０５（１９８５）など参照）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、顕著なアン
ジオテンシン変換酵素阻害作用すなわち血圧降下の効果
を有し、安全性が高く、医薬品としてのみならず、機能
性食品としても有用な新規なペプチド及びこれを有効成
分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供するこ
とを目的としてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために種々研究を重ねた結果、先ず、小麦グ
ルテンを酸性プロテアーゼ（例えば、アスペルギルス・
サイトーイを起源とするものなど）で酵素分解して得た
加水分解物が、アンジオテンシン変換酵素に対し顕著な
阻害作用を示すことを見出した。そしてさらに検討を進
めた結果、該加水分解物に含まれる特定のアミノ酸配列
を有するペプチドが前記酵素に対して強い阻害作用を示
すことを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成
するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、一般式Ｒ１−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｒ２（式中のＲ１は水素原子又はアミノ酸残基であり、Ｒ２
は水酸基又はアミノ酸残基である）で表わされる、アミノ酸重合度が３〜６のペプチドであ
り、また本発明は、前記一般式で表わされるペプチドを
有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤である
。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。先
ず、本発明の前記一般式で表わされるペプチドは、Ｌｅ
ｕ（ロイシン）−Ｇｌｎ（グルタミン）−Ｐｒｏ（プロ
リン）のアミノ酸配列を有するトリペプチドを基本骨格
とし、そのＮ末端には任意のアミノ酸残基を結合させて
もよく、またＣ末端にはＡｒｇ（アルギニン）を除く任
意のアミノ酸残基を結合させてもよく、そしてアミノ酸
重合度が３〜６のものである。アミノ酸重合度が６を越
えると阻害作用が低下して好ましくない。

【０００８】次に、前記一般式で表わされるペプチドは
、その製法は特に制限されないが、例えば以下の方法に
より製造することができる。（イ）小麦グルテンを常法により変性処理したのち、必
要により加水し、これに酸性プロテアーゼを乾燥原料１
ｇ当たり１００〜１０，０００ＰＵ添加し、ｐＨ１．５
〜４、１５〜４５℃で３〜４８時間、かきまぜながら酵
素反応を行わせる。酸性プロテアーゼとしては、例えば
アスペルギルス・サイトーイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　　ｓａｉｔｏｉ）を起源とするもの〔例：モルシン（
盛進製薬）〕、リゾープス・シネンシス（Ｒｈｉｚｏｐ
ｕｓ　　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）を起源とするもの〔例：
サンプローゼＦ（阪急共栄物産）〕などが好適なものと
して挙げられる。

【０００９】次いで、得た加水分解物を熱処理して残存
酵素を失活させたのち、遠心分離などで濾過して不溶物
を除去し、得た濾液につき精製処理を行う。この目的物
を得る精製法としては、例えばゲル濾過法、逆相ＨＰＬ
Ｃなどの常法が適宜選択して用いられる。

【００１０】（ロ）別の方法としては、ペプチド合成装
置を用い、例えばＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのトリペプチ
ドの場合には、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｏ−ＣＨ２−フェ
ニルアセタミドメチル樹脂、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＯＮ
ｐ及びＢｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕを装填し、ジシクロヘキシル
カルボジイミドの存在下、無水対称法で合成することが
できる（上記Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル、Ｏ
Ｎｐ：ｐ−ニトロフェニルエステル）。

【００１１】以上のごとくして前記一般式で表わされる
アミノ酸重合度が３〜６の目的とするペプチドを製造す
ることができる。次に本発明における前記一般式で表わ
されるペプチドは、アンジオテンシン変換酵素（以下、
ＡＣＥという）阻害活性を示すが、これらのペプチドを
ＡＣＥ阻害剤として使用する場合には、液状、固体　　
（例えば粉末など）のいずれでもよく、また該ペプチド
を１種又は２種以上を組合わせて用いてもよい。そして
また、例えば前記（イ）の方法により目的とするペプチ
ドを得る場合には、十分な精製を行うことなく、加水分
解物に由来する他の成分を含有していてもよい。

【００１２】前記一般式で表わされるアミノ酸重合度が
３〜６のペプチドは、その急性毒性がいずれもＬＤ５０
（ラット、経口投与）＞１６ｇ／ｋｇであって、多量に
摂取しても生体に悪影響を及ぼさない。それ故、該ペプ
チドをそのまま、又はこれに、例えばビタミン類、ミネ
ラル類、糖類、酸味料、香料などの各種成分を加えて食
してもよい。さらには該ペプチドを種々の飲食品、例え
ば牛乳、豆乳、清涼飲料、スープなどの液状食品、固形
食品、粉末食品に含有させることができ、このときの該
ペプチドの含有量は、特に制限されないが、０．０５〜
１０％（Ｗ／Ｗ）が好適である。

【００１３】次に、本発明のペプチドは、経口的又は非
経口的に投与することができ、さらに該ペプチドを適当
な医薬担体と混合して用いることもできる。なお医薬担
体としては、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソル
ビット、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乳糖、砂
糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット、
グリシンなどの賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、ポリエチレングリコール、シリカなどの潤滑剤、
馬鈴薯澱粉などの崩壊剤、ラウリル硫酸ナトリウムなど
の湿潤剤などである。

【００１４】また剤型としては、錠剤、丸剤、散剤、カ
プセル剤、顆粒剤などの固形剤であってもよく、溶液、
懸濁液などの液剤であってもよい。なお、非経口的に投
与する場合は、注射剤、点滴注射剤、座剤などとして用
いることができる。

【００１５】これらの投与に適する製剤は、常法の製剤
法により製造される。本発明のＡＣＥ阻害剤の投与量は
有効成分として、通常０．１〜６００ｍｇ／ｋｇ／日が
適当である。

【００１６】

【実施例】以下、実施例を示す。実施例１（１）Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのトリペプチドの製造小
麦グルテン４００ｇに蒸留水６，０００ｍｌを添加し、
１２１℃、１０分間加熱処理したのち、１Ｍのクエン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０）を１，２００ｍｌ加え
、さらに１Ｎ−ＨＣｌでｐＨを２．０に調整したのち、
酸性プロテアーゼのモルシン（前述）を２，０００，０
００ＰＵ加え、全液量を８，０００ｍｌとし、３０℃で
４４時間かきまぜながら酵素反応を行わせた。

【００１７】得た加水分解物を１００℃で１０分間加熱
して残存酵素を失活させたのち、遠心分離により不溶物
を除去し、濾液７，６００ｍｌを得た。

【００１８】なお、この濾液そのもののＡＣＥ阻害活性
（該活性等の測定法は後記実施例１の（２）に示す）は
、ＩＣ５０として２６．７μｇ蛋白／ｍｌであり、小麦
グルテンをＡＯプロテアーゼ（盛進製薬社製、アスペル
ギルス・オリーゼ起源）で加水分解した場合（ＩＣ５０
＝１６０μｇ蛋白／ｍｌ）に比し、極めて高い。

【００１９】該濾液を６００ｍｌに濃縮後、これをＢｉ
ｏ−ｇｅｌ　　Ｐ２（バイオラッド社製）を用いたゲル
濾過クロマトグラフィー（溶出条件：カラム　　φ５０
×９００ｍｍ、試料添加量　　１５ｍｌ、流速　　８０
ｍｌ／時間、移動相　　１Ｍ酢酸）により分画し、高い
ＡＣＥ阻害活性を示す画分を回収し、凍結乾燥させた。該凍結乾燥物を蒸留水４００ｍｌに溶解し、第１回目の
逆相ＨＰＬＣ〔溶出条件：カラム　　ＣＡＰＣＥＬＬ　
　ＰＡＫ　　Ｃ１８（資生堂製）φ２０×２５０ｍｍ、
流速　　８．０ｍｌ／分、移動相　　Ａ；０．１％トリ
フルオロ酢酸、Ｂ；８０％アセトニトリル＋０．１％ト
リフルオロ酢酸、グラジェント条件；０〜１５分Ａ１０
０％、Ｂ　　０％、１５〜９０分　　Ａ　　２１％、Ｂ
　　７９％（リニアー）〕により、３３〜３５分の高い
ＡＣＥ阻害活性を示す溶出区分を採取し、乾固させた。

【００２０】該乾固物を蒸留水１２０ｍｌに溶解し、第
２回目の逆相ＨＰＬＣ〔溶出条件：カラム及び流速は前
記と同じ、移動相　　Ａ；２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
．５）、Ｂ；４０％メタノール＋２ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７．５）、グラジェント条件；０〜２４分　　Ａ　
　１００％、Ｂ　　０％、２４〜１４４分　　Ａ　　０
％、Ｂ　　１００％（リニアー）〕により、５６〜５８
分の高いＡＣＥ阻害活性を示す溶出区分を採取し、乾固
させた。

【００２１】さらに該乾固物を蒸留水４０ｍｌに溶解し
、第３回目の逆相ＨＰＬＣ〔溶出条件：カラム及び流速
は前記と同じ、移動相　　Ａ；０．１％トリフルオロ酢
酸、Ｂ；４０％アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ
酢酸、グラジェント条件；０分Ａ８５％、Ｂ　　１５％
、０〜１２分　　Ａ　　８２．５％、Ｂ　　１７．５％
（リニアー）、１２〜２４分　　Ａ　　８２．５％、Ｂ
　　１７．５％、２４〜４０分　　Ａ８０％、Ｂ　　２
０％（リニアー）〕により、１９〜２４分の高いＡＣＥ
阻害活性を示す溶出区分を採取し、乾固させた。

【００２２】またさらに、該乾固物（純度約８０％）の
一部を超純水２０ｍｌに溶解し、第４回目の逆相ＨＰＬ
Ｃ〔溶出条件：前記第３回目の逆相ＨＰＬＣと同じ〕に
より、２１〜２３分の高いＡＣＥ阻害活性を示す溶出区
分を採取し、乾固させて目的とするＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏのトリペプチド２．２ｇ（純度９９％以上）を得た
。

【００２３】このものの性質は次の通りである。アミノ酸組成（試料を６Ｎ−ＨＣｌで真空下、１１０℃
、２４時間加熱処理後、アミノ酸分析計により求めた）
：Ｌｅｕを１．０としたときのモル比　　Ｌｅｕ１．０
、Ｇｌｕ　　０．９３、Ｐｒｏ　　１．０アミノ酸配列
（プロティンシークェンサーにより決定）：Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ分子量：３５６．４元素分析値：Ｃ１６Ｈ２８Ｎ４Ｏ５として　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｃ　　　　　　　　Ｈ　　　
　　　　　　　Ｎ　　　　　　　　　　Ｏ理論値（％）
　　５３．９２　　７．９２　　１５．７２　　２２．
４４実測値（％）　　５３．９９　　７．８５　　１５
．８０　　２２．４３

【００２４】（２）ＡＣＥ阻害活
性の測定ａ）測定法ＡＣＥ（シグマ社製、ウサギ肺起源）を０．１Ｍホウ酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、８０ｍＵ／
ｍｌのＡＣＥ液を得る。各試料を試験管に０．０５ｍｌ
注入し、これに基質として０．１５ｍｌのヒプリルヒス
チジルロイシン［最終濃度　　５ｍＭ、ＮａＣｌ　　３
００ｍＭ、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
３）を含む］を添加し、さらに前記ＡＣＥ液０．１ｍｌ
を加えて、３７℃で３０分間反応させる。次いで、これ
に１Ｎ−ＨＣｌを０．５ｍｌ加えて酵素反応を停止させ
、１．５ｍｌの酢酸エチルを加えて酢酸エチル中に抽出
されたヒプリル酸の２２８ｎｍの吸光度を測定し、これ
をＡＣＥの酵素活性とした。

【００２５】そしてＡＣＥ阻害率は次の式による。阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００（％）Ａ：試料を含ま
ない場合の２２８ｎｍの吸光度Ｂ：試料を添加した場合
の２２８ｎｍの吸光度また阻害率５０％のときの阻害剤
濃度をＩＣ５０として示す。ｂ）前記（１）により得たＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのペ
プチドのＩＣ５０＝６．３μＭこのように、本発明のペプチドのＡＣＥ阻害活性は、従
来報告されている公知のペプチドのＡＣＥ阻害活性と遜
色なく、顕著である。

【００２６】実施例２Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏの血圧降下作用６週令のＣｒｊ
：Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットの左腎動脈を狭窄して作製
した二腎性Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ型高血圧ラット（平均体
重３００ｇ、１群５匹）を使用した。

【００２７】そして表１に示す検体［Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−
Ｐｒｏは実施例１で得たもの（純度９９％以上）、カプ
トプリルはシグマ社製のもの］を適当量の蒸留水に溶解
し、これを胃ゾンデを用いて前記ラットに単回強制経口
投与し、非観血式血圧測定装置（室町機械製　　ＭＫ−
１０００）にて経時的に収縮期血圧を測定した。その結
果を表１にまとめて示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】表１から、本発明のペプチドの投与により
、投与後４時間まで血圧降下値は増大し、また投与後２
４時間を経過しても、血圧降下作用が持続していること
がわかり、そしてまた、本発明のペプチドの９６０ｍｇ
／ｋｇ投与による血圧降下値は、医薬品の血圧降下剤で
あるカプトプリル１０ｍｇ／ｋｇ投与によるそれとほぼ
一致していることがわかる。

【００３０】実施例３本発明のペプチドの飲食品への使用例（１）　　実施例１における第３回目の逆相ＨＰＬＣに
より得た固形のＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（純度約８０％
）１００ｍｇを常法により得た豆乳１００ｍｌに添加し
、殺菌して飲料製品とした。（２）　　前記（１）と同様のＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ
５０ｍｇを粉末スープ１００ｇに混合して製品とした。

【００３１】実施例４本発明のペプチドの医薬への応用Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏは実施例１で得たもの（純度９
９％以上）を使用（１）静脈注射剤Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ５０ｍｇを殺菌生理食塩水１ｍ
ｌに溶解し、無菌的にフィルター（孔径０．２２μｍ）
で濾過して得た濾液を注射剤とする。（２）経口用錠剤　　　　（イ）Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３部　　　　（ロ）マ
ンニット　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０．９部　　　　（ハ）馬鈴薯澱粉　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１部　　　　（ニ）ステアリン酸マグ
ネシウム　　　　　　　　　　　　　　　　０．１部（
イ）と（ロ）を混合し、これに（ハ）を１０％澱粉糊と
して加えて粒状化し、これをＮｏ．６０メッシュ（Ｂ．
Ｓ．）の篩を通し、乾燥させた後、さらにＮｏ．１６メ
ッシュ（Ｂ．Ｓ．）の篩で選別し、この粒子を（ニ）と
混合した後、打錠機で製錠する。

【００３２】

【発明の効果】本発明の前記一般式で表わされるペプチ
ドは、新規なものであり、そして安全で、副作用もなく
、顕著な血圧降下作用を有し、極めて優れたＡＣＥ阻害
剤である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式Ｒ１−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｒ２（式中のＲ１は水素原子又はアミノ酸残基であり、Ｒ２
は水酸基又はアミノ酸残基である）で表わされる、アミノ酸重合度が３〜６のペプチド。
【請求項２】請求項１記載のペプチドを有効成分とする
アンジオテンシン変換酵素阻害剤。