WO2011075002A1 - Способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот глицина, l-глутаминовой кислоты и l-цистина - Google Patents
Способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот глицина, l-глутаминовой кислоты и l-цистина Download PDFInfo
- Publication number
- WO2011075002A1 WO2011075002A1 PCT/RU2010/000627 RU2010000627W WO2011075002A1 WO 2011075002 A1 WO2011075002 A1 WO 2011075002A1 RU 2010000627 W RU2010000627 W RU 2010000627W WO 2011075002 A1 WO2011075002 A1 WO 2011075002A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- solution
- amino acids
- tablets
- amino acid
- standard
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8818—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving amino acids
Definitions
- the invention relates to the pharmaceutical industry, and specifically to a method for determining in a tablet the amount of active components in the form of amino acids: glycine, L-glutamic acid and L-cystine.
- a known preparation comprising amino acids: L-cystine, L-glutamic acid and glycine with a mass ratio of components of 1: 1: 1 and with a quantitative content of 0.1 g for each component, which is used as an agent inducing the biosynthesis of glutathione, the activity of glutathione transferase and having antitoxic, radioprotective and antihypoxic effects (RU 2096034 C1, IPC 6
- This known method does not allow with a sufficient degree of accuracy to determine all amino acids included in the tablet preparation, in particular glycine and L-glutamic acid, whose peaks in the chromatograms with insufficient retention time may intersect, which additionally contribute along with the properties of these amino acids included in the tablet excipients, as well as an equal concentration of amino acids.
- the objective of the invention is a reliable qualitative and quantitative determination in a short period of time in one analysis with a simple sample preparation of the tablets included in the overall composition in equal proportions of three amino acids: L-cystine, L-glutamic acid and glycine.
- a modifying reagent prepared by dissolving p-toluenesulfonyl chloride in acetonitrile, convenient in operation, is a kind of internal standard. Controlling the completeness of the derivatization reaction (obtaining tosyl derivatives of amino acids) in each individual tube is an important point, since we are dealing with a heterophasic reaction that is influenced by many factors: ambient temperature (the reaction occurs at room temperature), concentration of reagents , pH of a soda solution (0.2 M sodium carbonate solution) and its dissociation; in addition, when a solution of orthophosphoric acid (“stop reagent”) is added, gas is released, and consequently, the volume of the reaction mixture changes, which also affects the accuracy of determining the content of amino acids in the preparation.
- P-toluenesulfonyl chloride is not inherently a highly specific modifying (derivatizing) agent, since it can interact not only with the NH 2 - group of amino acids and the functional group of amines (primary and secondary with the formation of sulfamide compounds), but also with a hydroxyl OH group or carboxyl COOH group.
- OH groups formed upon dissociation of a 0.2 M aqueous solution of sodium carbonate can enter into an uncontrolled reaction with PTLC, and despite the fact that PTLC is taken in excess (minimum 13-fold excess relative to the modified substance) for the derivatization reaction, the invention allows with a sufficient degree of accuracy to calculate the quantitative content of each amino acid in the drug. In particular, due to the controlled passage of amino acid derivatization reactions before quantification.
- chromatographic analysis can be performed for three portions of a standard solution of amino acids and for three portions of the test solution of tablets. In this case, the calculation of the content of each amino acid in a tablet in mg is carried out according to the formula:
- SAK SG the average of three definitions of the area of each amino acid in a standard solution of amino acids
- Srrrcx i is the average of three determinations of the area of p-toluenesulfonyl chloride in the test solution of tablets,
- the correction Srrrcx ct / Srrrcx metrevice can be taken into account due to the use of an excessive amount of modifying reagent, which provides a controlled passage of amino acid derivatization reactions before their quantification.
- a standard solution of amino acids is preferably prepared by dissolving 10.0-15.0 mg of each of the amino acids L-cystine, L-glutamic acid and glycine in 100-150 ml of sodium carbonate solution with stirring, followed by bringing the solution to 250 ml and filtering it .
- the test tablet solution is preferably prepared by grinding at least three tablets and dissolving a weighed portion of 35.0 to 40.0 mg. the resulting powder in 100-150 ml of sodium carbonate solution, followed by adjusting the volume of the solution to 250 ml and filtering it.
- the preparation of the modifying reagent in the best embodiment of the invention is carried out by dissolving 15.0 mg of p-toluenesulfonyl chloride in 1.0 ml of acetonitrile, followed by shaking at a speed of 1500 rpm.
- the preparation of solutions of tosyl derivatives of a standard solution of amino acids and a test solution of tablets in the best embodiment of the invention is carried out by adding 50 ⁇ l of a solution of a modifying reagent in 200 ⁇ l, a standard solution of amino acids and 200 ⁇ l of a test solution of tablets, followed by shaking them at a speed of 1500 rpm for 30 seconds and holding for 30 minutes at room temperature, after which 25 ⁇ l of stop reagent in the form of a 42.5% phosphoric acid solution are added to the reaction mixtures, and for it was shaken again at 1500 rev / min. until the end of carbon dioxide injection within 0.45 - 1.5 minutes
- the mobile phase for high performance liquid chromatography can be prepared by dissolving 7.0 g of potassium phosphate monosubstituted in 700 ml of water, after which the pH of the solution is adjusted by adding concentrated orthophosphoric acid to 2.8, then the solution is stirred, 250 ml of acetonitrile is added, and then the solution volume adjusted with water to 1000 ml and filtered.
- aliquots of 40 ⁇ l of a standard solution of amino acids or a test solution of tablets are introduced into the chromatograph, while chromatography is carried out using a 150x4.6 mm column for 8 min in isocratic mode at a column temperature of 50 ° C, injector volume: 20 ⁇ l and an eluent flow rate of 1 ml / min.
- the implementation of the invention is illustrated by an example of a quantitative determination of amino acids: glycine, L-glutamic acid and L-cystine in a medicine in the form of tablets containing each of the listed amino acids in an amount of 70 mg.
- a test solution of a drug three tablets are ground in a porcelain mortar, then a 37.5 mg sample of the obtained powder is placed in a 250 ml volumetric flask, dissolved in 100 ml of a 0.2 M sodium carbonate solution with stirring for 20 minutes. on a magnetic stirrer and adjusted to the mark with a 0.2 M sodium carbonate solution, after which the solution is also filtered through an ashless filter.
- a modifying reagent PTLC
- 15.0 mg of p-toluenesulfonyl chloride tosyl chloride
- a hermetically sealed conical tube total volume 1.7 ml
- acetonitrile a hermetically sealed conical tube
- Chromatographic conditions column 150x4.6 mm, mobile phase - monosubstituted potassium phosphate solution (0.05 M) / acetonitrile, isocratic mode, column temperature 500 ° C, injector volume 20 ⁇ l, wavelength 254 nm, eluent flow rate 1 ml / min, analysis time 8 min.
- the average values of the characteristics of high-performance liquid chromatography for standard solutions of amino acids and subjects drug solutions should be in the intervals: peak release times - 2%, peak areas - 10%. In case of large deviations of the characteristics from the given ones, the analysis is repeated until the necessary parameters are achieved. To ensure the suitability of the chromatographic system, a deviation from the above chromatographic conditions is possible.
- chromatograms are obtained, which are illustrated in the description, in which the amino acids are identified by the retention time and the peak areas corresponding to each amino acid are determined in standard amino acid solutions and in the tested drug solutions.
- SAK ST the average of three determinations of the area of each amino acid in a standard solution of amino acids
- Srrrcx cg is the average of three determinations of the PTSX area in a standard solution of amino acids
- Peak areas and calculation of the content of each amino acid are carried out programmatically using a computer, which, as indicated above, is associated with the hardware-software complex of a high-performance liquid chromatograph.
- the average values of the characteristics of the chromatographic system for standard solutions of amino acids and test solutions of the drug are in the intervals of peak release time - less than 2%, the peak area - less than 10%, and sample preparation of standard solutions of amino acids and test solutions of the drug is clearly worked out (including compliance with all of the above conditions for the preparation of solutions, derivatization, interruption of the reaction, chromatographic conditions and the like), then the calculation of the content of each the acidity in a tablet in mg can be carried out according to the average peak areas, based on three parallel determinations, both for the standard solution of amino acids and for the test solution of the drug without taking into account the ratio of the peak areas of the modifying reagent in the test and standard solutions (in this case, the ratio is close to unity and they can be neglected) by the formula:
- the method allows to determine the quantitative content of amino acids in one tablet with an accuracy of ⁇ 5.3 mg, which corresponds to the permissible limit for a tablet of a drug containing glycine, L-glutamic acid and L-cystine.
- the method is implemented with the same parameters.
Landscapes
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
Задача изобретения заключается в надежном качественном и количественном определении за короткий промежуток времени за один анализ при простой пробоподготовке входящих в общую композицию таблетки в равных долях трех аминокислот L-цистина, L-глутаминовой кислоты и глицина. Способ включает последовательное выполнение: приготовления в водном растворе натрия карбоната стандартного раствора аминокислот глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина и испытуемого раствора таблеток, включающих перечисленные аминокислоты в равных долях, из порошка таблеток; приготовления растворов тозил-производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток введением в стандартный раствор и в испытуемый раствор аминокислот избыточного количества модифицирующего реагента, приготовленного растворением п- толуолсульфохлорида в ацетонитриле, а затем введением стоп-реагента в виде раствора ортофосфорной кислоты; проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии растворов тозил-производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток с использованием в качестве мобильной фазы водного раствора калия фосфата однозамещенного с ацетонитрилом; осуществление идентификации аминокислот на полученных хроматограммах по времени удерживания стандартного раствора и испытуемого раствора с определением площадей пиков аминокислот; расчет содержания каждой аминокислоты в таблетке по определенным площадям пиков аминокислот в стандартном растворе аминокислот и в испытуемом растворе таблеток, а также по величинам навесок аминокислот в стандартном растворе аминокислот, навески порошка таблеток в испытуемом растворе таблеток и по величине массы таблетки.
Description
Способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина
Область применения
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а конкретно к способу определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот: глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина.
Уровень техники
Исследования лекарственных возможностей композиции аминокислот L-цистина, L-глутаминовой кислоты и глицина проводятся достаточно давно.
Известен препарат, включающий аминокислоты: L-цистин, L-глутаминовую кислоту и глицин при массовом соотношении компонентов 1:1:1 и при количественном содержании 0,1 г для каждого компонента, который используется в качестве средства, индуцирующего биосинтез глутатиона, активность глутатионтрансферазы и оказывающего антитоксическое, радиопротекторное и антигипоксическое действие (RU 2096034 С1, МПК 6
А61К 31/195, 1997).
При производстве такого лекарственного препарата или аналогичного, включающего равные доли аминокислот L-цистина, L-глутаминовой кислоты и глицина в большем или меньшем количестве, необходим надежный и простой метод контроля лекарственного препарата, предусматривающий качественное и количественное определение перечисленных аминокислот.
Известен способ качественного и количественного определения аминокислот с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, при котором хроматографическое определение производится с использованием предварительно полученных флуоресцентных N2- бензоксазолил производных аминокислот.
Этот известный способ не позволяет с достаточной степенью точности определить все входящие в препарат, представляющий собой таблетку, аминокислоты, в частности глицин и L-глутаминовую кислоту, пики которых на хроматограммах при недостаточном времени удерживания могут
пересекаться, чему дополнительно способствуют наряду с свойствами этих аминоскислот входящие в таблетку вспомогательные вещества, а также равная концентрация аминокислот.
Сущность изобретения
Задача изобретения заключается в надежном качественном и количественном определении за короткий промежуток времени за один анализ при простой пробоподготовке входящих в общую композицию таблетки в равных долях трех аминокислот: L-цистина, L-глутаминовой кислоты и глицина.
Эту задачу решает способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот: глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина, который включает последовательное выполнение следующих операций:
- приготовление в водном растворе натрия карбоната стандартного раствора аминокислот глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина и испытуемого раствора таблеток, включающих перечисленные аминокислоты в равных долях, из порошка таблеток;
- приготовление растворов тозил-производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток введением в стандартный раствор и в испытуемый раствор аминокислот избыточного количества модифицирующего реагента, приготовленного растворением п- толуолсульфохлорида в ацетонитриле (ПТСХ), а затем введением стоп- реагента в виде раствора ортофосфорной кислоты;
- проведение высокоэффективной жидкостной хроматографии растворов тозил-производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток с использованием в качестве мобильной фазы водного раствора калия фосфата однозамещенного с ацетонитрилом;
- осуществление идентификации аминокислот на полученных хроматограммах по времени удерживания стандартного раствора и испытуемого раствора с определением площадей пиков аминокислот;
- расчет содержания каждой аминокислоты в таблетке по определенным площадям пиков аминокислот в стандартном растворе аминокислот и в испытуемом растворе таблеток, а также по величинам навесок аминокислот в стандартном растворе аминокислот, навески порошка таблеток в испытуемом растворе таблеток и по величине массы таблетки.
Для большей точности определения аминокислот глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина возможно проведение идентификации модифицирующего реагента на полученных хроматограммах с определением площадей соответствующих ему пиков, а расчета содержания каждой аминокислоты в таблетке проводить с введением поправки на величину отношения площадей пиков модифицирующего реагента в стандартном растворе аминокислот и в испытуемом растворе таблеток.
Модифицирующий реагент, приготовленный растворением п-толуолсульфохлорида в ацетонитриле, удобный в работе, является своеобразным внутренним стандартом. Контроль над полнотой прохождения реакции дериватизации (получения тозил-производных аминокислот) в каждой отдельной пробирке — это важный момент, так как мы имеем дело с гетерофазной реакцией, на которую влияет множество факторов: температура внешней среды (реакция идет при комнатной температуре), концентрация реагентов, рН содового раствора (0,2 М раствор натрия карбоната) и его диссоциация; кроме того при добавлении раствора ортофосфорной кислоты («стоп-реагента») происходит выделение газа, а следовательно, изменяется объем реакционной смеси, что также влияет на точность определения содержания аминокислот в препарате. П-толуолсульфохлорид не является по своей природе высокоспецифичным модифицирующим (дериватизирующим) агентом, так как может взаимодействовать не только с NH2- группой аминокислот и функциональной группой аминов (первичных и вторичных с образованием сульфамидных соединений), но и с гидроксильной ОН- группой или карбоксильной СООН- группой. ОН- группы образующиеся при диссоциации 0,2 М водного раствора натрия карбоната могут вступать в неконтролируемую реакцию с ПТСХ, и несмотря на то, что ПТСХ взят в избытке (минимум 13 -кратный избыток по отношению к модифицируемому
веществу) для проведения реакции дериватизации, изобретение позволяет с достаточной степенью точности осуществлять расчет количественного содержания каждой аминокислоты в лекарственном препарате. В частности по причине контролируемого прохождения реакций дериватизации аминокислот перед их количественным определением.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда характеристики высокоэффективной жидкостной хроматографии лежат для стандартных растворов аминокислот и испытуемых растворов препарата в интервалах по времени выхода пиков менее 2 %, по площади пиков - менее 10 % , а пробоподготовка стандартных растворов аминокислот и испытуемых растворов препарата четко отработана, хроматографический анализ может выполняться для трех порций стандартного раствора аминокислот и для трех порций испытуемого раствора таблеток. При этом расчет содержания каждой аминокислоты в таблетке в мг проводится по формуле:
w . SAK i » mAK cm * m
^(мг) =
* cm * а , г ΓдΤΙΩе
SAK i - средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в испытуемом растворе таблеток,
SAK СГ— средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот,
гпдк сг - навеска каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот, мг,
Шср - средняя масса таблетки, мг,
а - навеска порошка таблеток в испытуемом растворе таблеток, мг.
Если характеристики высокоэффективной жидкостной хроматографии не удовлетворяют указанным выше условиям, то хроматографический анализ вьшолняется также для трех порций стандартного раствора аминокислот и для трех порций испытуемого раствора таблеток, но расчет содержания каждой аминокислоты в таблетке в мг в этом случае проводят по формуле:
ЛК cm * тср
Х(мт) =
($АК cm I $ПТСХ ст ) * а
, где
SAK i - средняя по трем определениям площадь аминокислоты в испытуемом растворе таблеток,
Srrrcx i - средняя по трем определениям площадь п- толуолсульфохлорида в испытуемом растворе таблеток,
SAK СТ - средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот,
Srrrcx ст - средняя по трем определениям площадь п- толуолсульфохлорида в стандартном растворе аминокислот,
гпдк; СТ - навеска каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот, мг,
тер - средняя масса таблетки, мг,
а - навеска порошка таблеток в испытуемом растворе таблеток, мг.
Поправка Srrrcx ст / Srrrcx ί может быть введена в расчет благодаря использованию избыточного количества модифицирующего реагента, обеспечивающего контролируемое прохождение реакций дериватизации аминокислот перед их количественным определением.
При осуществлении изобретения предпочтительно использовать 0,2 М водный раствор натрия карбоната.
Стандартный раствор аминокислот предпочтительно приготавливать растворением навесок по 10,0- 15,0 мг каждой из аминокислот L-цистина, L-глутаминовой кислоты и глицина в 100 - 150 мл раствора натрия карбоната при перемешивании с последующим доведением объема раствора до 250 мл и его фильтрацией.
Испытуемый раствор таблеток предпочтительно приготавливать измельчением, по меньшей мере, трех таблеток и растворением навески в 35,0 — 40,0 мг. полученного порошка в 100-150 мл раствора натрия карбоната с последующим доведением объема раствора до 250 мл и его фильтрацией.
Приготовление модифицирующего реагента в наилучшем варианте реализации изобретения осуществляют растворением 15,0 мг п- толуолсульфохлорида в 1,0 мл ацетонитрила с последующим встряхиванием со скоростью 1500 об/мин. в течение 2 мин.
Приготовление растворов тозил-производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток в наилучшем варианте реализации изобретения осуществляют добавлением по 50 мкл раствора модифицирующего реагента в 200 мкл, стандартного раствора аминокислот и в 200 мкл испытуемого раствора таблеток с последующим их встряхиванием со скоростью 1500 об/мин в течение 30 секунд и выдерживанием 30 минут при комнатной температуре, после чего в реакционные смеси добавляют по 25 мкл стоп-реагента в виде 42,5% раствора ортофосфорной кислоты, а затем вновь встряхивают со скоростью 1500 об/мин. до окончания вьщеления углекислого газа в течение 0,45 - 1,5 мин.
Мобильная фаза для высокоэффективной жидкостной хроматографии может быть приготовлена растворением 7,0 г калия фосфата однозамещенного в 700 мл воды, после чего рН раствора доводят добавлением концентрированной ортофосфорной кислоты до значения 2,8, затем раствор перемешивают, добавляют 250 мл ацетонитрила, а затем объем раствора доводят водой до 1000 мл и фильтруют.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения в хроматограф вводят аликвоты по 40 мкл стандартного раствора аминокислот или испытуемого раствора таблеток, при этом хроматографию проводят с использованием колонки 150x4,6 мм в течение 8 мин в изократическом режиме при температуре колонки 50°С, объеме инжектора: 20 мкл и скорости потока элюента 1 мл/мин.
Пример осуществления изобретения
Осуществления изобретения поясняет примером количественного определения аминокислот: глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина в лекарственном препарате в форме таблетки, содержащей каждой из перечисленных аминокислот в количестве 70 мг.
Вначале приготавливают растворы, необходимые для реализации способа, которые используют свежеприготовленными.
Для приготовления 0,2 М раствора натрия карбоната в мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют 21,2 г натрия карбоната в 700 мл воды
очищенной на магнитной мешалке, доводят водой очищенной до метки и перемешивают.
Для приготовления стандартного раствора аминокислот навески L- цистина - 12,0 мг, L-глутаминовой кислоты - 12,0 мг, глицина - 12,0 мг помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в 100 мл ранее приготовленного 0,2 М раствора натрия карбоната при перемешивании в течение 20 минут на магнитной мешалке и доводят до метки 0,2 М раствором натрия карбоната, после чего раствор фильтруют через беззольный фильтр.
Для приготовление испытуемого раствора лекарственного препарата три таблетки растирают в фарфоровой ступке, затем навеску 37,5 мг полученного порошка помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в 100 мл 0,2 М раствора натрия карбоната при перемешивании в течение 20 мин. на магнитной мешалке и доводят до метки 0,2 М раствором натрия карбоната, после чего раствор также фильтруют через беззольный фильтр.
Для приготовление раствора модифицирующего реагента (ПТСХ) взвешивают 15,0 мг п-толуолсульфохлорида (тозилхлорида), помещают в герметично закрывающуюся коническую пробирку (общий объем 1,7 мл) и растворяют в 1,0 мл ацетонитрила; встряхивают на автоматическом встряхивателе со скоростью 1500 об/мин. в течение 2 мин.
Для приготовление 42,5% раствора ортофосфорной кислоты (стоп- реагента) в мерную колбу вместимостью 50 мл, содержащую 15-20 мл воды очищенной, помещают 25,0 мл концентрированной (85%) ортофосфорной кислоты, доводят водой очищенной до метки и перемешивают. Этот раствор имеет продолжительный срок хранения, до 1 месяца.
Для приготовление мобильной фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии в мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 7,0 г калия фосфата однозамещенного, растворяют в 700 мл воды очищенной на магнитной мешалке, доводят рН добавлением концентрированной ортофосфорной кислоты до значения 2,8, перемешивают, добавляют 250 мл ацетонитрила, доводят водой очищенной до метки, хорошо перемешивают, фильтруют через фильтр 0,45 мкм и дегазируют с помощью вакуумного насоса. Этот раствор также имеет продолжительный срок хранения, до 1 месяца.
После приготовления указанных выше растворов осуществляют получение тозил-производных (дериватизацию) стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора лекарственного препарата.
Для этого механическим дозатором отбирают по 200 мкл стандартного раствора аминокислот для трех параллельных определений и испытуемого раствора препарата также для трех параллельных определений, переносят в конические пробирки, добавляют механическим дозатором по 50 мкл раствора модифицирующего реагента, закрывают крышки и интенсивно встряхивают на автоматическом встряхивателе со скоростью 1500 об/мин. в течение 30 с, а затем выдерживают в течение 30 мин. при комнатной температуре для прохождения реакции.
После этого в реакционные смеси добавляют механическим дозатором по 25 мкл 42,5% раствора ортофосфорной кислоты (стоп-реагент) и снова встряхивают полученные смеси на автоматическом встряхивателе со скоростью 1500 об/мин. до окончания выделения углекислого газа (около 1 мин.).
После окончания процесса модификации (дериватизации) по три параллельных образца стандартных растворов аминокислот и испытуемых растворов препарата должны быть сразу последовательно введены в хроматографическую колонку высокоэффективного жидкостного хроматографа, имеющего программно-аппаратный комплекс для сбора и обработки данных со спектрофотометрическим детектором и аналого- цифровым преобразователем сигнала, совместимым с компьютером. В колонку хроматографа последовательно вводят микропшрицем вместимостью 100 мкл аликвоты (40 мкл) полученных тозил-производных стандартных растворов аминокислот и испытуемых растворов препарата (по три образца).
Хроматографические условия: колонка 150x4,6 мм, мобильная фаза - раствор калия фосфата однозамещенного (0,05 М) / ацетонитрил, изократический режим, температура колонки 500°С, объем инжектора 20 мкл, длина волны 254 нм, скорость потока элюента 1 мл/мин, время анализа 8 мин.
Средние значения характеристик высокоэффективной жидкостной хроматогорафии для стандартных растворов аминокислот и испытуемых
растворов препарата должны быть в интервалах: времена выхода пиков - 2 %, площади пиков - 10 %. При больших отклонениях характеристик от заданных анализ повторяют до достижения необходимых параметров. Для обеспечения пригодности хроматографической системы возможно отклонение от указанных выше условий хроматографирования.
По результатам анализа получают хроматограммы, представленные на иллюстрации в описании, на которых по времени удерживания проводят идентификацию аминокислот и определяют площади пиков, соответствующих каждой аминокислоте, в стандартных растворах аминокислот и в испытуемых растворах препарата.
Расчет содержания каждой аминокислоты в таблетке в мг проводят по средним площадям пиков, исходя из трех параллельных определений, как для стандартного раствора аминокислот, так и для испытуемого раствора препарата по формуле: (мг) =
( АК cm I ПТСХ cm ) * a
, где
SA ί— средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в испытуемом растворе таблеток;
Srrrcx ί - средняя по трем определениям площадь ПТСХ в испытуемом растворе таблеток;
SAK СТ— средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот;
Srrrcx сг - средняя по трем определениям площадь ПТСХ в стандартном растворе аминокислот;
mA ст - навеска каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот, мг;
Шср - средняя масса таблетки, мг;
а - навеска порошка таблеток, мг.
Площади пиков и расчет содержания каждой аминокислоты осуществляются программно с использованием компьютера, который, как
указано выше, связан с программно-аппаратным комплексом высокоэффективного жидкостного хроматографа.
Если средние значения характеристик хроматографической системы для стандартных растворов аминокислот и испытуемых растворов препарата находятся в интервалах по времени выхода пиков - менее 2 %, по площади пиков - менее 10 % , а пробоподготовка стандартных растворов аминокислот и испытуемых растворов препарата четко отработана (включая соблюдение всех вышеизложенных условий при приготовлении растворов, проведении дериватизации, прерывании прохождения реакции, условий хроматографирования и тому подобное), то расчет содержания каждой аминокислоты в таблетке в мг можно проводят по средним площадям пиков, исходя из трех параллельных определений, как для стандартного раствора аминокислот, так и для испытуемого раствора препарата без учета соотношения площадей пиков модифицирующего реагента в испытуемом и стандартном растворах (в данном случае соотношение близко к единицы и им можно пренебречь) по формуле:
. SAK i * mAK cm * mcp
(мг) = —
SAK ст * а , где
SA i - средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в испытуемом растворе таблеток;
SAK СТ - средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот;
ГПАК СГ - навеска каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот, мг;
шср - средняя масса таблетки, мг;
а - навеска порошка таблеток, мг.
Способ позволяет определить количественное содержание аминокислот в одной таблетке с точностью ±5,3 мг, что соответствует допустимому пределу для таблетки лекарственного препарата, содержащей глицин, L-глутаминовую кислоту и L-цистин.
Для количественного определения аминокислот глицина, L- глутаминовой кислоты и L-цистина в лекарственном препарате в форме таблетки, содержащей каждой из перечисленных аминокислот в количестве 90 мг, способ реализуется с теми же параметрами.
Claims
1. Способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина, включающий последовательное выполнение
приготовления в водном растворе натрия карбоната стандартного раствора аминокислот глицина, L-глутаминовой кислоты и L-цистина и испытуемого раствора таблеток из порошка таблеток,
приготовления растворов тозил-производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток введением в стандартный раствор и в испытуемый раствор аминокислот избыточного количества модифицирующего реагента, приготовленного растворением п- толуолсульфохлорида в ацетонитриле, а затем введением стоп-реагента в виде раствора ортофосфорной кислоты,
высокоэффективной жидкостной хроматографии растворов тозил- производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток с использованием в качестве мобильной фазы водного раствора калия фосфата однозамещенного с ацетонитрилом,
идентификации аминокислот на полученных хроматограммах по времени удерживания стандартного раствора и испытуемого раствора с определением площадей пиков аминокислот,
расчета содержания каждой аминокислоты в таблетке по определенным площадям пиков аминокислот в стандартном растворе аминокислот и в испытуемом растворе таблеток, а также по величинам навесок аминокислот в стандартном растворе аминокислот, навески порошка таблеток в испытуемом растворе таблеток и по величине массы таблетки
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят идентификацию модифицирующего реагента на полученных хроматограммах с определением площадей соответствующих ему пиков, а расчета содержания каждой аминокислоты в таблетке осуществляют с введением поправки на величину отношения площадей пиков модифицирующего реагента в стандартном растворе аминокислот и в испытуемом растворе таблеток.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что выполняют хроматографический анализ для трех порций стандартного раствора аминокислот и для трех порций испытуемого раствора таблеток, а расчета содержания каждой аминокислоты в таблетке в мг проводят по формуле:
. SAK , * тАК cm * тср
^(мг) =
SAK cm * а
, где
SAK i - средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в испытуемом растворе таблеток,
SAK СТ - средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот,
ШАК СТ - навеска каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот, мг,
Шср - средняя масса таблетки, мг,
а - навеска порошка таблеток в испытуемом растворе таблеток, мг.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что выполняют хроматографический анализ для трех порций стандартного раствора аминокислот и для трех порций испытуемого раствора таблеток, а расчет содержания каждой аминокислоты в таблетке в мг проводят по формуле:
(SAK , SflTVX , ) * тАК ст * ср
(мг) =
($АК cm I SllTCX ст ) * а , где
SAK ί — средняя по трем определениям площадь аминокислоты в испытуемом растворе таблеток,
Srrrcx i - средняя по трем определениям площадь п- толуолсульфохлорида в испытуемом растворе таблеток,
SAK СТ - средняя по трем определениям площадь каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот,
Srrrcx ст - средняя по трем определениям площадь п- толуолсульфохлорида в стандартном растворе аминокислот,
ШАК СТ - навеска каждой аминокислоты в стандартном растворе аминокислот, мг,
Шср - средняя масса таблетки, мг, a - навеска порошка таблеток в испытуемом растворе таблеток, мг.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют 0,2 М водный раствор натрия карбоната.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что стандартный раствор аминокислот получают растворением навесок по 10,0 - 20,0 мг каждой из аминокислот L-цистина, L-глутаминовой кислоты и глицина в 100 - 150 мл раствора натрия карбоната при перемешивании с последующим доведением объема раствора до 250 - 300 мл и его фильтрацией.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что испытуемый раствор таблеток получают измельчением, по меньшей мере, трех таблеток и растворением навески в 35,0 - 45,0 мг. полученного порошка в 100 - 150 мл раствора натрия карбоната с последующим доведением объема раствора до 250 - 300 мл и его фильтрацией.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовление модифицирующего реагента осуществляют растворением 15,0 мг п- толуолсульфохлорида в 1,0 мл ацетонитрила с последующим встряхиванием со скоростью 1500 об/мин. в течение 2 мин.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовление растворов тозил-производных стандартного раствора аминокислот и испытуемого раствора таблеток осуществляют добавлением по 50 мкл раствора модифицирующего реагента в 200 мкл, стандартного раствора аминокислот и в 200 мкл испытуемого раствора таблеток с последующим их встряхиванием со скоростью 1500 об/мин в течение 30 секунд и выдерживанием 30 минут при комнатной температуре, после чего в реакционные смеси добавляют по 25 мкл стоп-реагента в виде 42,5% раствора ортофосфорной кислоты, а затем вновь встряхивают со скоростью 1500 об/мин. до окончания выделения углекислого газа в течение 0,45 - 1,5 мин.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовление мобильной фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют растворением 7,0 г калия фосфата однозамещенного в 700 мл воды, после чего рН раствора доводят добавлением концентрированной ортофосфорной кислоты до значения 2,8, затем раствор перемешивают, добавляют 250 мл ацетонитрила, после чего объем раствора доводят водой до 1000 мл и фильтруют.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что в хроматограф вводят аликвоты по 40 мкл стандартного раствора аминокислот или испытуемого раствора таблеток, при этом хроматографию проводят с использованием колонки 150x4,6 мм в течение 8 мин в изократическом режиме при температуре колонки 50°С, объеме инжектора: 20 мкл и скорости потока элюента 1 мл/мин.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201000173 | 2009-12-18 | ||
| EA201000173A EA013977B1 (ru) | 2009-12-18 | 2009-12-18 | Способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот глицина, l-глутаминовой кислоты и l-цистина |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2011075002A1 true WO2011075002A1 (ru) | 2011-06-23 |
Family
ID=42779177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2010/000627 WO2011075002A1 (ru) | 2009-12-18 | 2010-10-28 | Способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот глицина, l-глутаминовой кислоты и l-цистина |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA013977B1 (ru) |
| WO (1) | WO2011075002A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112903886A (zh) * | 2019-12-04 | 2021-06-04 | 四川科伦药物研究院有限公司 | 1-丁基磺酰氯有关物质的分离和检测方法 |
| WO2024109016A1 (zh) * | 2022-11-24 | 2024-05-30 | 湖北三峡实验室 | 高效液相色谱测定反应液中甘氨酸和二酮哌嗪含量的方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2700831C1 (ru) * | 2019-01-24 | 2019-09-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) | Способ количественного определения глицина в биологических лекарственных препаратах методом гидрофильной высокоэффективной жидкостной хроматографии |
| CN111505151B (zh) * | 2020-04-30 | 2022-09-02 | 宜昌三峡普诺丁生物制药有限公司 | 高效液相色谱法测定l-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04275298A (ja) * | 1991-03-02 | 1992-09-30 | Kikkoman Corp | ぺプチド及びこれを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
| RU2096034C1 (ru) * | 1994-11-30 | 1997-11-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Медицинский научно-производственный комплекс "БИОТИКИ" | Фармацевтическая композиция, индуцирующая биосинтез глутатиона, активность глутатионтрансферазы и оказывающая антитоксическое, радиопротекторное и антигипоксическое действие, и способы лечения, профилактики и защиты с ее использованием |
| RU2167410C2 (ru) * | 1999-08-03 | 2001-05-20 | Пермская государственная фармацевтическая академия | Способ количественного определения алифатических аминокислот |
| RU2267115C2 (ru) * | 2003-06-23 | 2005-12-27 | ОАО "Фармстандарт-Лексредства" | Способ количественного определения состава многокомпонентных лекарственных препаратов жаропонижающего, аналгезирующего, противопростудного действия |
| RU2332662C2 (ru) * | 2005-09-26 | 2008-08-27 | Григорий Борисович Голубицкий | Способ определения количественного состава таблеток "пенталгин фс" |
| JP2009109406A (ja) * | 2007-10-31 | 2009-05-21 | Kowa Co | イブプロフェン、チペピジン及びチアミンの同時定量方法並びに当該方法を用いた有効成分含量の担保された製剤の製造方法 |
-
2009
- 2009-12-18 EA EA201000173A patent/EA013977B1/ru active IP Right Revival
-
2010
- 2010-10-28 WO PCT/RU2010/000627 patent/WO2011075002A1/ru active Application Filing
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04275298A (ja) * | 1991-03-02 | 1992-09-30 | Kikkoman Corp | ぺプチド及びこれを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
| RU2096034C1 (ru) * | 1994-11-30 | 1997-11-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Медицинский научно-производственный комплекс "БИОТИКИ" | Фармацевтическая композиция, индуцирующая биосинтез глутатиона, активность глутатионтрансферазы и оказывающая антитоксическое, радиопротекторное и антигипоксическое действие, и способы лечения, профилактики и защиты с ее использованием |
| RU2167410C2 (ru) * | 1999-08-03 | 2001-05-20 | Пермская государственная фармацевтическая академия | Способ количественного определения алифатических аминокислот |
| RU2267115C2 (ru) * | 2003-06-23 | 2005-12-27 | ОАО "Фармстандарт-Лексредства" | Способ количественного определения состава многокомпонентных лекарственных препаратов жаропонижающего, аналгезирующего, противопростудного действия |
| RU2332662C2 (ru) * | 2005-09-26 | 2008-08-27 | Григорий Борисович Голубицкий | Способ определения количественного состава таблеток "пенталгин фс" |
| JP2009109406A (ja) * | 2007-10-31 | 2009-05-21 | Kowa Co | イブプロフェン、チペピジン及びチアミンの同時定量方法並びに当該方法を用いた有効成分含量の担保された製剤の製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SIMONYAN A.V. ET AL: "Ispolzovanie ningidrinovoy reaktsii dlya kolichestvennogo opredeleniya aminokislot a razlichnykh obektakh", METODICHESKIE REKOMENDATSII. VOLGOGRAD, 2007, pages 106 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112903886A (zh) * | 2019-12-04 | 2021-06-04 | 四川科伦药物研究院有限公司 | 1-丁基磺酰氯有关物质的分离和检测方法 |
| CN112903886B (zh) * | 2019-12-04 | 2024-05-24 | 四川科伦药物研究院有限公司 | 1-丁基磺酰氯有关物质的分离和检测方法 |
| WO2024109016A1 (zh) * | 2022-11-24 | 2024-05-30 | 湖北三峡实验室 | 高效液相色谱测定反应液中甘氨酸和二酮哌嗪含量的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201000173A1 (ru) | 2010-08-30 |
| EA013977B1 (ru) | 2010-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2011075002A1 (ru) | Способ определения в таблетке количества активных компонентов в виде аминокислот глицина, l-глутаминовой кислоты и l-цистина | |
| CN109725073A (zh) | 乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法 | |
| Oldi et al. | Analysis of perchlorate in human saliva by liquid chromatography− tandem mass spectrometry | |
| CN113933403A (zh) | 一种丙氨酰谷氨酰胺有关物质的测定方法 | |
| US4141856A (en) | Reference material for establishing anion concentrations in analytical chemistry tests | |
| CN109991337B (zh) | 同时检测中华绒螯蟹蟹黄中四类药物及其代谢物的方法 | |
| CN102988357B (zh) | 一种复方α酮酸药物组合物及其制备方法 | |
| Ahuja | Baclofen | |
| CN104597157A (zh) | 一种脂溶性铂配合物及其制剂有关物质的测定方法 | |
| Reed et al. | Simple, optimized liquid-chromatographic method for measuring total hydroxyproline in urine evaluated | |
| Bertucci et al. | HSA binding of HIV protease inhibitors: a high‐performance affinity chromatography study | |
| Swanepoel et al. | Fluorimetric method of analysis for D-norpseudoephedrine hydrochloride, glycine and L-glutamic acid by reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| RU2332662C2 (ru) | Способ определения количественного состава таблеток "пенталгин фс" | |
| RU2293320C2 (ru) | Способ количественного определения тиотриазолина и пирацетама в комплексных лекарственных препаратах | |
| JG et al. | Development and validation of high performance liquid chromatography method for analysis of sibutramine hydrochloride and its impurity | |
| CN116735746B (zh) | 一种分离测定盐酸氯哌丁及其杂质的方法 | |
| Lau-Cam et al. | HPLC method with precolumn phenacylation for the assay of valproic acid and its salts in pharmaceutical dosage forms | |
| CN104316482A (zh) | 一种盐酸氨溴索颗粒的质量控制方法 | |
| CN112034074B (zh) | 测定禽畜肉中的七种非选择性环氧化酶抑制药物残留的方法 | |
| Ji et al. | Precolumn derivatization liquid chromatography method for analysis of dietary supplements for glucosamine: single laboratory validation study | |
| Savaşer et al. | Validated LC determination of the piroxicam-β-cyclodextrin inclusion complex in tablets and in human plasma | |
| CN112881565B (zh) | 三苯双脒有关物质的hplc检测方法 | |
| Srikanth et al. | Development and validation for the simultaneous estimation of olmesartan medoxomil and hydrochlorothiazide by using RP-HPLC methods | |
| Saputri et al. | 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (nbd-cl) as pre and post-column derivatization reagent for amine groups analysis using chromatography: a mini-review | |
| Leonov et al. | Simultaneous Determination of Succinic Acid and Water-Soluble Vitamins by Ion-Pair High-Performance Liquid Chromatography |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 10837955 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 10837955 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 10837955 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |