CN111505151B - 高效液相色谱法测定l-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法 - Google Patents

高效液相色谱法测定l-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用高效液相色谱法测定L‑缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，配制L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸对照品溶液；经高效液相色谱仪检测，供试品色谱图与对照品溶液色谱图中L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰时间及峰形进行对比，判定供试品溶液中是否含有其他氨基酸。本方法通过筛选氨丙基键合硅胶色谱柱，找到分离效果，筛选波长，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相，通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间，有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。

Description

高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及一种测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，具体为采用高效液相色谱法检测L-缬氨酸原料中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的残留的方法。
技术背景
L-缬氨酸(L-2-氨基-3-甲基丁酸；CAS号：72-18-4)属人体必需氨基酸，作为氨基酸类药，营养增补剂，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分。其具有分子式C10H20N2O4，且具有下述结构式：
Figure BDA0002476411100000011
L-缬氨酸是三个支链氨基酸之一，属必需氨基酸，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱，其作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，具有广泛的市场前景。针对发酵法生产缬氨酸均为L-型，无需旋光拆分，但在成品中会存在一些其他氨基酸，给其临床应用带来一些影响。同时由于L-缬氨酸其他氨基酸检测，在中国药典2015年版和美国药典42版均采用薄层色谱法，其检测灵敏度差，各类氨基酸不明确，无法明确显示各类其他氨基酸的具体含量。采用美国药典40版的磷酸盐和乙腈二元流动相体系，氨基柱使用寿命不长，基线不稳，且L-缬氨酸与本发明提到的其他氨基酸无法基线分离。采用氨基酸分析仪，设备成本和检测成本昂贵，不宜普及。本发明针对现有技术不足，经过长期实践研究，确定一种灵敏度高，检测时间短的其他氨基酸检测方法，其能够快速灵敏的检测出L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的含量，并且能够使L-缬氨酸与其他氨基酸基线分离。
发明内容
本发明的技术方案利用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸含量的检测方法。本方法通过筛选不同品牌的氨丙基键合硅胶色谱柱，找到分离效果，基线效果最好的色谱柱，筛选波长，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相，通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例，选择合适三乙胺的量、pH及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间，提高峰的分离度和理论塔板数，改善色谱峰形，空白溶剂不干扰各氨基酸的检测，并有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。
本发明实施例采用了如下技术方案：
一种用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为70～76：24～30的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为10～20mmol/L，加入0.1％-0.3％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.0～6.5；
流速：0.8～1.2ml/min；
柱温：20～30℃；
进样体积：20μl；
检测波长：UV210nm。
相对于现有技术，本方法简单，高效，灵敏度高，在本发明提供的检测条件下，各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间合适，色谱峰形和分离度良好，理论塔板数高，且空白溶剂不干扰各氨基酸的检测，并有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。该方法同时检测了7种氨基酸，为控制L-缬氨酸生产工艺中的L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸检测提供了准确可靠的检测方法。
具体的，优选的，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的含量：
优选的色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex LunaNH2。
优选的流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；
优选的所述磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调pH为6.2；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
优选的流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
优选的，进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱。
从色谱图1-14，采用本发明的检测方法，可以快速分离L-缬氨酸、L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，并能够确定各氨基酸的具体类型和含量，本发明的检测方法对于提高L-缬氨酸的纯度，更好的应用于临床用药具有重要意义。
附图说明
图1实施例1色谱图。
图2实施例2色谱图。
图3实施例3色谱图。
图4 L-缬氨酸对照溶液色谱图。
图5苯丙氨酸对照溶液色谱图。
图6亮氨酸对照溶液色谱图。
图7异亮氨酸对照溶液色谱图。
图8 L-正缬氨酸对照溶液色谱图。
图9丙氨酸对照溶液色谱图。
图10甘氨酸对照溶液色谱图。
图11混合对照1色谱图。
图12混合对照2色谱图。
图13混合溶液1色谱图。
图14混合溶液2色谱图。
图15实施例4色谱图。
具体实施方式
实施例1
取S200308批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.1％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.1；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.1％的三乙胺，用磷酸调pH为6.1；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图1所示。
实施例2
取S200301批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为74：26的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.3％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.4；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.3％的三乙胺，用磷酸调pH为6.4；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图2所示。
实施例3
取200309批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调pH为6.2；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图3所示。
实施例4
取S200307批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图15所示。
实施例5
对照样品试验：
取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图中主成分峰的拖尾因子应不大于1.5，重复进样6次，RSD应不大于2.0％，理论塔板数按L-缬氨酸峰计算应不低于2000。
其中有关物质的确定方法如下：
XP205电子天平，Dionex U3000液相色谱仪
对照溶液的制备：
L-缬氨酸对照溶液：称取L-缬氨酸对照品(含量：99.0％)10.00mg，用流动相溶解并稀释至20ml，摇匀，再量取500μl用流动相稀释至25ml，摇匀。
L-正缬氨酸对照溶液：称取L-正缬氨酸对照品(含量：99.0％)10.00mg，用流动相溶解并稀释至20ml，摇匀，作为L-正缬氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至25ml，摇匀。
亮氨酸对照溶液：称取亮氨酸对照品(含量：99.0％)28.76mg，用流动相溶解并稀释至50ml，摇匀，作为亮氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
异亮氨酸对照溶液：称取异亮氨酸对照品(含量：99.0％)26.24mg，用流动相溶解并稀释至50ml，摇匀，作为异亮氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
甘氨酸对照溶液：称取甘氨酸对照品(含量：99.0％)10.00mg，用流动相溶解并稀释至20ml，摇匀，作为甘氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至25ml，摇匀。
丙氨酸对照溶液：称取丙氨酸对照品(含量：99.5％)19.79mg，用流动相溶解并稀释至50ml，摇匀，作为丙氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
苯丙氨酸对照溶液：称取苯丙氨酸对照品(含量：99.5％)20.39mg，用流动相溶解并稀释至100ml，摇匀，作为苯丙氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
混合对照：量取L-正缬氨酸储备液、甘氨酸储备液、亮氨酸储备液、异亮氨酸储备液、苯丙氨酸储备液各100μl，丙氨酸储备液200μl，用流动相溶解并稀释至10ml，摇匀，进样两针。
混合溶液：称取L-缬氨酸(含量：99.0％)20mg，分别加入上述的L-正缬氨酸储备液、甘氨酸储备液、亮氨酸储备液、异亮氨酸储备液、苯丙氨酸储备液各100μl，储备液对照溶液200μl，用流动相溶解并稀释至10ml，摇匀，进样两针。
按照以下色谱条件和方法进行：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调pH为6.2；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱。
取上述混合溶液20μl注入液相色谱仪，得到色谱图，如图13和14所示，从混合溶液色谱中检查各峰之间能否分开，计算其分离度。
测定结果：取各氨基酸对照溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，对各氨基酸进行定位，结果如下表1。
表1
名称 保留时间 相对保留时间 理论塔板数 分离度 图谱号
苯丙氨酸 5.987 0.70 6894 2.57 图5
亮氨酸 6.730 0.79 8529 1.80 图6
异亮氨酸 7.273 0.85 8570 2.30 图7
L-正缬氨酸 7.943 0.93 13889 1.72 图8
L-缬氨酸 8.530 1.00 6772 5.61 图4
丙氨酸 11.090 1.30 7841 2.48 图9
甘氨酸 12.380 1.45 8318 NA 图10
混合对照 NA NA NA NA 图11和图12
混合溶液 NA NA NA NA 图13和图14
本领域技术人员知晓，上述检测的L-正缬氨酸和L-缬氨酸为异构体，性质相似，亮氨酸和异亮氨酸为异构体，性质相似，且L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸均为含有羧基和氨基的一类小分子物质，理化性质相似，不易实现分离，本申请人按照中国药典2015年版和美国药典42版均采用薄层色谱法，其检测灵敏度差，各类氨基酸不明确，无法显示各类其他氨基酸的具体含量。本申请人采用美国药典40版的磷酸盐和乙腈二元流动相体系，氨基柱使用寿命不长，基线不稳，且L-缬氨酸与本发明提到的其他氨基酸无法基线分离。但采用本申请的检测方法，调控了L-缬氨酸、L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸峰在色谱柱上的保留时间，提高峰的分离度和理论塔板数，改善色谱峰形，且空白溶剂不干扰各氨基酸的检测，使各氨基酸在检测时分离，并准确定量，同时有效解决了氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。

Claims (1)

1.高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，所述的其他氨基酸为L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备对照品溶液：称取L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸分别置于不同量瓶中，用流动相溶解、定容、摇匀；
（2）制备供试品溶液：称取L-缬氨酸原料用流动相溶解、定容、摇匀；
（3）高效液相色谱法测定：分别取对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录保留时间和峰面积；取供试品溶液注入高效液相色谱仪，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液是否含有L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸，将供试品色谱图中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸峰面积与对照溶液相应氨基酸峰面积对比，计算出L-缬氨酸原料中各氨基酸的含量；
色谱条件如下：
色谱柱: 氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5µm；
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2%的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
进样体积：20µl；
检测波长：UV210nm。
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