CN102288704A - 一种清开灵注射液的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种清开灵注射液的定量检测方法，其是用高效液相色谱法测定清开灵注射液中氨基酸的含量，其中：(a)色谱条件为氨基酸分析柱，检测波长为338nm和262nm，柱温40℃；(b)被测品溶液：清开灵注射液；(c)对照品溶液：六种补充氨基酸、17种氨基酸溶液中；(d)测定法：分别取被测品溶液、磷苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯各0.5μl、硼酸缓冲液2.5μl、混匀1min，置自动进样瓶中，自动进样测定。本发明通过上述技术方案可以对清开灵注射液中的总氨基酸和主要氨基酸进行了定量控制，由此保证总氨基酸和六种主要氨基酸的含量限度，提高了清开灵注射液的国家药品标准，进而确保了清开灵注射液质量的稳定性。

Description

一种清开灵注射液的定量检测方法

技术领域

本发明涉及药品的定量检测方法，具体地说是一种清开灵注射液的定量检测方法。

背景技术

清开灵注射液为中药制剂，其源于传统名贵中成药″温病三宝″之一的安宫牛黄丸，由胆酸、珍珠母(粉)、猪去氧胆酸、栀子、水牛角(粉)、板蓝根、黄芩苷、金银花等八味药组成，主要功效是清热解毒、化痰通络、醒神开窍，临床上广泛用于急性肝炎、上呼吸道感染、病毒性肺炎等疾病的治疗。目前对于清开灵注射液的定量检测是通过测定总氮来控制清开灵注射液中的氨基酸成分(详见中国药典2010年版一部收载的质量标准)。该方法仅对总氮进行控制，然而总氮含量高并不意味着氨基酸含量高。为解决这一问题，有研究者采用氨基酸自动分析仪对其中的氨基酸进行测定，但氨基酸自动分析仪价格昂贵、分析时间长。由于清开灵注射液为中药制剂，亦属于高安全风险品种范畴。如何能够快速、准确地本对清开灵注射液有效成分的含量进行测定，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种能够快速、准确地对清开灵注射液有效成分的含量进行测定的方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现。

本发明所提供的清开灵注射液的定量检测方法是用高效液相色谱法测定清开灵注射液中氨基酸的含量，其中：

(a)色谱条件：氨基酸分析柱，流动相A为40mmol/L Na₂HPO₄溶液，流动相B为按照体积比为45∶45∶10的乙腈-甲醇-水；流速为每分钟2.0ml；梯度洗脱：0～1.9min，100％A相，18.1～18.5min，43％A相+57％B相，18.6～22.3min，100％B相，23.2～26min，100％A相；检测波长为338nm和262nm，柱温40℃；

(b)被测样品溶液：精密量取清开灵注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度；

(c)对照品溶液：称取谷氨酰胺、天门冬酰胺、色氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、羟脯氨酸六种补充氨基酸各0.25mmol，置10ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，振摇使溶解，得补充氨基酸储备液；取20μl补充氨基酸储备液加入2ml17种氨基酸溶液中混合，即得浓度约250pmol/μl的混合氨基酸对照品溶液；

(d)测定法：分别取被测样品溶液、邻苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯各0.5μl、硼酸缓冲液2.5μl、混匀1min，置自动进样瓶中，自动进样测定；记录对照品、被测样品的色谱图，按外标法以峰面积计算。

本发明通过上述技术方案可以对清开灵注射液中的总氨基酸和主要氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸)进行了定量检测，由此保证总氨基酸和六种主要氨基酸的含量限度，提高了清开灵注射液的国家药品标准，进而确保了清开灵注射液质量的稳定性。

本发明方法同时具有重复性好、定量准确、使用方便、操作简便快捷等特点。

附图说明

图1是对照品的色谱图。

图2是被测样品的色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1测定10个批次清开灵注射液中的氨基酸含量

材料与试剂

1.1仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪

梅特勒-托利多AB265-S电子天平

梅特勒-托利多Delta320酸度计

1.2样品与试剂

清开灵注射液(神威药业有限公司生产的10个批次的产品)；17种混合氨基酸标准品溶液(天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；安捷伦科技有限公司，250pmol/μl)；谷氨酰胺、天门冬酰胺、色氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、羟脯氨酸标准品(安捷伦科技有限公司，1g)，NaH₂PO₄·H₂O(分析纯)，NaOH(分析纯)，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，硼酸盐缓冲液(安捷伦科技有限公司，pH10.2)，邻苯二甲醛(OPA，安捷伦科技有限公司)，9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC，安捷伦科技有限公司)，纯化水。

2、色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA(4.6×150mm，5μm)

流动相A：40mmol/L Na₂HPO₄溶液(pH7.8，取NaH₂PO₄·H₂O 5.5g)，流动相B为乙腈-甲醇-水(45∶45∶10)；流速为每分钟2.0ml；按下表进行梯度洗脱，检测波长为338nm(适用于OPA-氨基酸)和262nm(适用于FMOC-氨基酸)，柱温40℃。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
1.9	100	0
			18.1	43	57
18.6	0	100
			22.3	0	100
23.2	100	0
			26	100	0

流速：2ml/min

检测器：紫外检测器、二极管阵列检测器或荧光检测器

3、对照品及供试品溶液的制备

对照品溶液的制备：

称取谷氨酰胺、天门冬酰胺、色氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、羟脯氨酸六种补充氨基酸各0.25mmol，置10ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，振摇使溶解，得补充氨基酸储备液；取20μl补充氨基酸储备液加入2ml浓度为250pmol/μl的17种氨基酸溶液中混合，即得浓度约250pmol/μl的23种混合氨基酸对照品溶液；

被测样品溶液的制备：

精密量取清开灵注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为被测样品溶液。

4、测定

按照以下自动进样程序进样测定：

(1)从硼酸盐缓冲液(pH10.2)中吸取2.5μl，吸取0.5μl样品；

(2)“在空气中”混合3μl，最大速度，2次；

(3)等待0.5分钟；

(4)从未加盖的水瓶中吸取0μl，清洗针头；

(5)从OPA瓶中吸取0.5μl；

(6)“在空气中”混合3μl，最大速度，6次；

(7)从未加盖的水瓶中吸取0μl，清洗针头；

(8)从FMOC瓶中吸取0.5μl；

(9)“在空气中”混合4μl，最大速度，6次；

(10)从水瓶中吸取32μl；

(11)“在空气中”混合18μl，最大速度，2次；

(12)进样。

记录对照品，被测样品的色谱图按外标注以峰面积计算。

5、含量测定结果

测定结果见表1。

表1氨基酸含量测定结果(mg/ml)

批次	总氨基酸	谷氨酸	脯氨酸	亮氨酸	丙氨酸	缬氨酸	甘氨酸
								0907162	10.29	1.33	1.35	1.48	1.23	0.89	0.91
0907169	10.42	1.76	1.52	1.47	1.36	1.01	0.87
								0907173	12.57	1.92	1.84	1.77	1.65	1.41	0.91
0907176	11.31	1.29	1.26	1.52	1.33	0.84	0.88
								0907180	13.52	1.54	1.48	1.71	1.45	1.09	0.90
0907184	13.15	1.38	1.59	1.82	1.36	1.21	0.87
								0907187	12.68	1.82	1.63	1.69	1.29	1.32	0.95
0907190	10.27	1.64	1.78	1.46	1.57	1.08	1.06
								0907193	14.59	1.73	1.39	1.37	1.34	0.95	0.93
0907196	13.01	1.39	1.54	1.49	1.47	1.27	0.97

根据表中的测定结果，拟定清开灵注射液中氨基酸的质量控制标准为：含总氨基酸应为5.0mg/ml～30mg/ml。其中六种主要氨基酸谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸的含量分别为0.8mg/ml～4.0mg/ml，0.8mg/ml～4.0mg/ml，0.8mg/ml～4.0mg/ml，0.50mg/ml～2.5mg/ml，0.50mg/ml～2.5mg/ml和0.50mg/ml～2.5mg/ml。

实施例2方法学验证

2.1系统适用性

按照实施例1所述方法制备对照品溶液和被测样品溶液，并按前法进行测定，结果显示，谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸的理论塔板数均大于2000，与相邻色谱峰的分离度大于1.5，符合要求。

2.2准确度试验

分别称取谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸各0.5g，混合，加水稀释至50ml，作为储备液，分别吸取8ml、10ml、12ml，加水稀释至100ml，即得每ml含0.8mg、1.0mg和1.2mg的供试品溶液(按谷氨酸计)，依本发明方法测定，结果表明，谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸的平均回收率分别为98.91％、98.45％、100.5％、99.39％、101.6％和98.61％，说明本发明方法的准确度较好。

2.3精密度试验

对进行回收率试验的样品(1mg/ml，按谷氨酸计)，依本发明方法测定六次，谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸的测定结果的相对标准偏差(RSD)均小于3％，表明本发明方法的精密度良好。

实施例3用高效液相色谱法测定清开灵注射液中的氨基酸含量

(a)色谱条件：氨基酸分析柱，流动相A为40mmol/L Na₂HPO₄溶液，流动相B为乙腈-甲醇-水(45∶45∶10)；流速为每分钟2.0ml；梯度洗脱：0～1.9min，100％A相，18.1～18.5min，43％A相+57％B相，18.6～22.3min，100％B相，23.2～26min，100％A相；检测波长为338nm和262nm，柱温40℃；

(b)被测样品溶液：精密量取清开灵注射液(神威药业有限公司，批号0907162)1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度；

(c)对照品溶液：称取谷氨酰胺、天门冬酰胺、色氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、羟脯氨酸六种补充氨基酸各0.25mmol，置10ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，振摇使溶解，得补充氨基酸储备液；取20μl补充氨基酸储备液加入2ml浓度为250pmol/μl的17种氨基酸溶液中混合，即得浓度约250pmol/μl的23种混合氨基酸对照品溶液；

(e)记录对照品和被测样品的色谱图(见附图1和附图2)，按外标法以峰面积计算，得各种氨基酸的含量测定结果，见表2。

表2氨基酸含量测定结果(mg/ml)

由表中结果可知，总氨基酸和六种主要氨基酸的测定结果符合拟定的质量标准。

实施例4

取1ml清开灵注射液(神威药业有限公司，批号0907169)至10ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得被测样品溶液。按照前述的液相条件和进样程序，分别进样，记录对照品和被测样品的色谱图，按外标法以峰面积计算，得各种氨基酸的含量测定结果，见表3。

表3氨基酸含量测定结果(mg/ml)

由表中结果可知，总氨基酸和六种主要氨基酸的测定结果符合拟定的质量标准。

实施例5

取1ml清开灵注射液(神威药业有限公司，批号0907173)至10ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得供试品溶液。按照前述的液相条件和进样程序，分别进样，记录对照品和供试品的色谱图，按外标法以峰面积计算，得各种氨基酸的含量测定结果，见表4。

表4氨基酸含量测定结果(mg/ml)

由表中结果可知，总氨基酸和六种主要氨基酸的测定结果符合拟定的质量标准。

Claims (2)

1.一种清开灵注射液的定量检测方法，其特征在于用高效液相色谱法测定清开灵注射液中的氨基酸的含量，其中：

(a)色谱条件：氨基酸分析柱，流动相A为40mmol/L Na₂HPO₄溶液，流动相B为按照体积比为45∶45∶10的乙腈-甲醇-水；流速为每分钟2.0ml；梯度洗脱：0～1.9min，100％A相，18.1～18.5min，43％A相+57％B相，18.6～22.3min，100％B相，23.2～26min，100％A相；检测波长为338nm和262nm，柱温40℃；

(b)被测样品溶液：精密量取清开灵注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度；

(c)对照品溶液：称取谷氨酰胺、天门冬酰胺、色氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、羟脯氨酸六种补充氨基酸各0.25mmol，置10ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，振摇使溶解，得补充氨基酸储备液；取20μl补充氨基酸储备液加入2ml 17种氨基酸溶液中混合，即得浓度约250pmol/μl的混合氨基酸对照品溶液；

(d)测定法：分别取被测样品溶液、邻苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯各0.5μl、硼酸缓冲液2.5μl，置自动进样瓶中，自动进样测定；记录对照品、被测样品的色谱图，按外标法以峰面积计算。

2.根据权利要求1所述的清开灵注射液的定量检测方法，其特征在于所说的自动进样的程序为：

(1)从硼酸盐缓冲液中吸取2.5μl，吸取0.5μl样品；

(2)“在空气中”混合3μl，最大速度，2次；

(3)等待0.5分钟；

(4)从未加盖的水瓶中吸取0μl，清洗针头；

(5)从磷苯二甲醛瓶中吸取0.5μl；

(6)“在空气中”混合3μl，最大速度，6次；

(7)从未加盖的水瓶中吸取0μl，清洗针头；

(8)从9-芴甲基氯甲酸酯瓶中吸取0.5μl；

(9)“在空气中”混合4μl，最大速度，6次；

(10)从水瓶中吸取32μl；

(11)“在空气中”混合18μl，最大速度，2次；

(12)进样。

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