CN111122719B - 一种二甲双胍维格列汀片杂质的分离检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二甲双胍维格列汀片杂质的液相色谱分离检测方法，该方法采用C18/SCX混合柱，流动相A为0.025～0.035mol/L磷酸二氢钾水溶液，pH值为4.5～5.0；流动相B为乙腈，进行梯度洗脱，检测波长为210nm(维格列汀)和208nm(盐酸二甲双胍)，柱温为25～35℃，流速为0.8～1.2mL/min，进样量为20～30μL。该方法能同时完全分离欧洲药典中收载的盐酸二甲双胍杂质A、B、C、D、E及维格列汀的杂质G、H、I、J，且简单准确、灵敏度高，该方法还可用于盐酸二甲双胍原料药、盐酸二甲双胍制剂、维格列汀原料药及维格列汀制剂有关物质的检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种二甲双胍维格列汀片杂质的分离检测液相色谱方法。
背景技术
二甲双胍维格列汀片(Metformin Hydrochloride and Vildagliptin Tablets)为薄膜包衣片，包含盐酸二甲双胍：维格列汀为850mg：50mg和1000mg：50mg两个规格，为瑞士诺华的产品，其商品名为Eucreas，于2007/11/14在欧盟上市获准上市。两种规格均于2014/12/09在中国进口上市，商品名为宜合瑞。此药属于两药复方制剂，用来治疗2型糖尿病。当单独使用二甲双胍治疗糖尿病时，随着病情加重，二甲双胍剂量增至最大耐受量时，仍不能有效地控制血糖。维格列汀属于二肽基肽酶一4抑制剂，能增加胰岛细胞对葡萄糖的敏感性，促进胰岛素的分泌，增强降糖作用。临床上常用维格列汀与二甲双胍联合应用于降糖。
目前，没有关于二甲双胍维格列汀复方片剂的杂质(有关物质)检测的相关文献的报道。根据欧洲药典EP9.2发布的盐酸二甲双胍标准，其工艺杂质有A、B、C、D、E；同时维格列汀含有降解杂质G、I、J及工艺杂质H。采用欧洲药典EP9.2、中国药典Chp2015和中国专利申请CN109682904A提供的色谱条件：强阳离子交换色谱柱来检测复方制剂，其杂质均不能得到有效分离。另外参考美国药典USP41中采用离子对试剂七氟丁酸进行梯度洗脱来分析复方制剂时，峰型较差，灵敏度较低。根据进口药品注册标准JX20140026有关物质检测，采用离子对试剂六氟磷酸铵，经过C18滤膜过滤，只有使用Thermo C18色谱柱，杂质才能够达到有效分离，但是色谱柱的使用寿命短(约15h)、重现性差，因此分析样品时刻存在风险。同时离子对试剂对仪器及色谱柱都有不可逆的损伤。现有中国专利申请CN109776372A和CN108689905A中采用C18色谱柱梯度运行，而二甲双胍与维格列汀有着显著的极性差异，因此普通的色谱柱和流动相并不适用于二甲双胍维格列汀复方制剂有关物质的检测。即现有技术没有能够解决二甲双胍维格列汀复方制剂杂质检测难的问题，因此，研究开发出一种耐用、快速、有效分离二甲双胍维格列汀片杂质的分析方法，对药物的质量控制具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种二甲双胍维格列汀片杂质的液相色谱分离检测方法，并进行了方法学验证，保证本方法的科学性、严谨性和实用性，以满足研发和生产的需求。
本发明具体提供了一种二甲双胍维格列汀片杂质的分离检测方法，其中二甲双胍杂质结构如分子式A、B、C、D、E所示，维格列汀杂质结构如分子式G、H、I、J所示，具体采用高效液相色谱法，以磺酸基阳离子与C18键合硅胶为填充剂，即采用C18/SCX混合柱；检测波长为210nm/218nm；柱温为25～35℃；流速为0.8～1.2mL/min；进样量为20～30μL；流动相A为0.025mol/L～0.035mol/L磷酸二氢钾水溶液，其pH值范围为4.5～5.0；流动相B为乙腈；进行梯度洗脱；
进一步的，色谱柱规格优选为4.6×250mm，5.0μm。梯度设置优选为：
| 时间(min) | 流动相A,％ | 流动相B,％ |
| 0 | 95 | 5 |
| 8 | 95 | 5 |
| 20 | 88 | 12 |
| 25 | 84 | 16 |
| 35 | 75 | 25 |
| 45 | 75 | 25 |
| 45.1 | 95 | 5 |
| 50 | 95 | 5 |
进一步的，流动相A优选为0.03mol/L磷酸二氢钾溶液，其pH值优选为4.6；
进一步的，流速优选为1.0mL/min；
进一步的，进样量优选为20μL。
进一步的，本发明提供了一种二甲双胍维格列汀片杂质的分离检测方法，其中所述二甲双胍杂质结构如上文中分子式A、B、C、D、E、F所示，维格列汀杂质结构如分子式G、H、I、J所示，具体采用高效液相色谱法，以磺酸基阳离子与C18键合硅胶为填充剂，即采用C18/SCX混合柱；检测波长为210nm/218nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；流动相A为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液，其pH值为4.6；流动相B为乙腈；进行梯度洗脱，梯度设置为：
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本发明在研究过程中发现，流动相的pH值对二甲双胍维格列汀及其有关杂质分离影响很大，尤其是二甲双胍的杂质B与维格列汀的杂质G的分离，在pH值为4.5～5.0时，才能达到基线分离。
本发明提供的检测方法，可以应用于二甲双胍的原料药和制剂，维格列汀的原料药和制剂以及二甲双胍维格列汀复方片剂的杂质分离检测。
上述方法的有益效果主要体现在：本发明方法准确、灵敏度高，稳定性好，对仪器和色谱柱损伤小，并通过方法学验证。
附图说明
图1：实施例1中的分离度溶液典型图谱；
图2：实施例1中的系统适用性溶液典型图谱；
图3：实施例1中的各杂质的定量限溶液典型图谱；
图4：实施例1中的各杂质的检测限溶液典型图谱；
图5：实施例1中的供试品0.1mol/L氢氧化钠破坏5min的图谱；
图6～图7：实施例1中的供试品溶液的典型图谱；
图8：实施例1中耐用性的系统适用性溶液(柱温40℃)图谱；
图9：实施例1中耐用性的系统适用性溶液(进样量30μL)图谱；
图10：对比例1中的系统适用性溶液图谱；
图11：对比例2中的系统适用性溶液图谱。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1：一种二甲双胍维格列汀片杂质的分离检测方法
1.仪器与试剂：
安捷伦1260液相色谱仪及配置的G1314F紫外检测器以及分析仪器配置的HPLC色谱工作站。乙腈(色谱级)、磷酸二氢钾(分析级)、磷酸(分析级)、纯化水。
色谱条件：
色谱柱：月旭C18/SCX柱(4.6×250mm，5.0μm)
检测波长：210nm/218nm
柱温：30℃
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
流动相A：0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调pH至4.6)
流动相B：乙腈
梯度洗脱：
稀释剂:水-乙腈-磷酸(90:10:1)
2.物料
| 名称 | 批号 | 来源 |
| 盐酸二甲双胍对照品 | 100664-201805 | 中检院 |
| 维格列汀对照品 | DZ201901 | 公司自制 |
| 杂质A | 100206-201704 | 中检院 |
| 杂质B | 20-JUN-18-02 | QCC |
| 杂质C | 1-NAZ-92-1 | TRC |
| 杂质D | F1708069 | 阿拉丁 |
| 杂质E | 03-FEB-18-05 | QCC |
| 杂质G | 20180702 | 石家庄耀博医药 |
| 杂质H | 20180617 | 石家庄耀博医药 |
| 杂质I | 190319 | 石家庄耀博医药 |
| 杂质J | 160822 | 石家庄耀博医药 |
| 二甲双胍维格列汀片 | WDX90 | 瑞士诺华 |
3.溶液配制：
(1)空白溶液：同稀释剂；
(2)分离度溶液：用稀释剂溶解杂质A、B、C、D、E、G、H、I、J对照品及盐酸二甲双胍对照品、维格列汀对照品定量稀释至浓度杂质A～E分别为1μg/mL、杂质G～J分别为2.5μg/mL、盐酸二甲双胍为0.2mg/mL、维格列汀为0.5mg/mL；
(3)系统适用性溶液：用稀释剂溶解杂质A、G、I、J对照品及盐酸二甲双胍对照品、维格列汀对照品定量稀释至浓度杂质A为1μg/mL、杂质G～J分别为2.5μg/mL、盐酸二甲双胍为0.2mg/mL、维格列汀为0.5mg/mL；
(4)各杂质的定量限溶液：精密量取上述分离度溶液1mL置10mL量瓶，用稀释剂定容，摇匀(相当于供试品浓度的0.05％)。
(5)各杂质的检测限溶液：精密量取上述分离度溶液1mL置25mL量瓶，用稀释剂定容，摇匀(相当于供试品浓度的0.02％)。
(6)供试品溶液：取二甲双胍维格列汀片研磨成细粉，取本品细粉适量(约相当于盐酸二甲双胍20mg)置100mL容量瓶中，加2/3体积的稀释剂溶解，振荡20分钟，定容，摇匀后过滤，取滤液作为盐酸二甲双胍供试品溶液；取本品细粉适量(约相当于维格列汀25mg)置50mL容量瓶中，加2/3体积的稀释剂溶解，振荡20分钟，定容，摇匀后过滤，取滤液作为维格列汀供试品溶液；
精密量取上述(1)～(6)溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
4.方法学验证
4.1专属性
空白溶剂及空白辅料对有关物质检测无干扰，分离度溶液中二甲双胍、维格列汀与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，各杂质峰之间分离度大于1.2，达到基线分离；系统适用性溶液中二甲双胍、维格列汀与相邻杂质峰之间，各杂质峰之间的分离度均大于1.5，表明本方法专属性良好。测定结果见表1，色谱图如图1～2所示。
表1分离度结果
| 名称 | 保留时间 | 分离度 | 理论板数 |
| 杂质A | 3.494 | —— | 11939 |
| 杂质D | 7.766 | 19.68 | 10013 |
| 盐酸二甲双胍 | 9.239 | 4.26 | 9125 |
| 杂质E | 11.700 | 5.40 | 7796 |
| 杂质C | 12.511 | 1.72 | 13983 |
| 杂质G | 14.659 | 4.36 | 10530 |
| 杂质B | 15.345 | 1.24 | 9368 |
| 杂质I | 16.703 | 2.84 | 40824 |
| 维格列汀 | 20.315 | 7.99 | 18022 |
| 杂质J | 33.134 | 32.33 | 365096 |
| 杂质H | 40.231 | 23.92 | 181553 |
4.2检测限和定量限
各个杂质的检测限均大于2或3，定量限均大于10；测定结果如下表2，色谱图如图3～4所示。
表2检测限和定量限的测定结果
上述结果表明：各杂质的最低检出浓度均为0.02％，各杂质的定量限检出浓度均为0.05％，表明灵敏度良好，能够满足二甲双胍维格列汀片有关物质的检测。
4.3强制降解试验
4.3.1酸碱破坏
称取二甲双胍维格列汀细粉510mg置50mL量瓶中，加入1mol/L的盐酸溶液3mL，室温放置1天，取出用碱中和后，加2/3体积的稀释剂溶解，振荡20分钟，定容，摇匀。过滤后取滤液20μL进样测定，结果：盐酸二甲双胍较稳定；维格列汀与未破坏的样品比较，除样品中特定检测出的杂质峰，色谱图中均未见其他杂质峰。
4.3.2碱破坏
称取二甲双胍维格列汀细粉510mg置50mL量瓶中，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，室温放置5min，取出用酸中和后，加2/3体积的稀释剂溶解，振荡20分钟，定容，摇匀。过滤后取滤液20μL进样测定，结果：盐酸二甲双胍较稳定；维格列汀与未破坏的样品比较，色谱图中出现杂质G，破坏5min降解10.96％，达到物料平衡，见图5所示。且主峰与杂质峰达到分离，不干扰检测，表明此检测方法稳定。
4.3.3高温破坏
取二甲双胍维格列汀细粉适量在105℃放置6h，取出后放置室温，称取细粉510mg置50mL量瓶中，加2/3体积的稀释剂溶解，振荡20分钟，定容，摇匀。过滤后取滤液20μL进样测定，结果：盐酸二甲双胍较稳定；维格列汀与未破坏的样品比较，色谱图中出现杂质I、杂质J，破坏4h降解11.34％，达到物料平衡，且主峰与杂质峰达到分离，不干扰检测。
4.3.4光照破坏
取二甲双胍维格列汀细粉适量在光4500Lx±500Lx放置10天，称取细粉510mg置50mL量瓶中，加2/3体积的稀释剂溶解，振荡20分钟，定容，摇匀。过滤后取滤液20μL进样测定，结果：盐酸二甲双胍较稳定；维格列汀与未破坏的样品比较，除样品中特定检测出的杂质峰，色谱图中均未见其他杂质峰。
4.3.5氧化破坏
称取二甲双胍维格列汀细粉510mg置50mL量瓶中，加入0.01％双氧水2mL室温放置5min，加2/3体积的稀释剂溶解，振荡20分钟，定容，摇匀。过滤后取滤液20μL进样测定，结果：盐酸二甲双胍较稳定；维格列汀与未破坏的样品比较，色谱图中出现杂质G、杂质I，破坏5min降解11.24％，达到物料平衡，且主峰与杂质峰达到分离，不干扰检测。
4.4耐用性试验
4.3.1柱温35℃
照色谱条件中的参数，更改柱温为35℃，对上述系统适用性溶液(3)进样分析，其结果能达到有效分离，色谱图如图6所示。在柱温25℃的条件，其分离效果更能达到要求。
4.3.1进样量30μL
照色谱条件中的参数，更改进样量30μL，对上述系统适用性溶液(3)进样分析，其结果能达到有效分离，色谱图如图7所示。其他色谱条件的参数在要求范围内微调，其分离效果均能达到要求，表明耐用性良好。
5.样品检测
对上述供试品溶液(6)进样分析，色谱图如图8～图9所示。
对比例1：参照USP41中盐酸二甲双胍质量标准的有关物质方法测定二甲双胍维格列汀片杂质
色谱条件：
色谱柱：C18-L60(2.1×100mm，1.8μm)
检测波长：230nm
柱温：35℃
流速：0.3mL/min
进样量：1μL
流动相A：0.065％七氟丁酸水溶液(用磷酸调pH至4.0)
流动相B：0.065％七氟丁酸甲醇溶液
梯度洗脱：
| 时间(min) | 流动相A,％ | 流动相B,％ |
| 0 | 100 | 0 |
| 1.3 | 100 | 0 |
| 3.8 | 85 | 15 |
| 7.0 | 30 | 70 |
| 8.0 | 30 | 70 |
| 8.01 | 100 | 0 |
| 13 | 100 | 0 |
分别称取盐酸二甲双胍对照品25.21mg、维格列汀对照品25.34mg置50mL量瓶，用水溶解定容后，参照美国药典的方法测定，记录色谱图，见图10，由图可见，峰型较差，维格列汀未见主峰，表明此方法不适合二甲双胍维格列汀片有关物质的检测。
对比例2：参照中国专利CN109776372A具体实施所述分析方法测定二甲双胍维格列汀片有关物质
色谱条件：
色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)
检测波长：210nm
柱温：30℃
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
流动相A：0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液(用氢氧化钠溶液调pH至6.7)
流动相B：乙腈
梯度洗脱：
| 时间(min) | 流动相A,％ | 流动相B,％ |
| 0 | 95 | 5 |
| 3 | 95 | 5 |
| 9 | 89 | 11 |
| 24 | 55 | 45 |
| 29 | 30 | 70 |
| 30 | 95 | 5 |
| 40 | 95 | 5 |
取上述系统适用性溶液进行上述方法测定，记录色谱图，结果见图11，由图可见，杂质峰之间未达到有效分离，灵敏度低，二甲双胍未见主峰，表明此方法不适合二甲双胍维格列汀片有关物质的检测。
Claims (7)
1.一种二甲双胍维格列汀片杂质的分离检测方法，其中二甲双胍杂质结构如分子式A、B、C、D、E所示，维格列汀杂质结构如分子式G、H、I、J所示，其特征在于：高效液相色谱条件为：
色谱柱为C18/SCX混合柱；
检测波长为210nm/218nm；
柱温为25～35℃；
流速为0.8～1.2mL/min；
进样量为20～30μL；
流动相A为0.025～0.035mol/L磷酸二氢钾水溶液，pH值为4.5～5.0；流动相B为乙腈；梯度洗脱如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述色谱柱为C18/SCX混合柱，规格为4.6×250mm，5.0μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相A为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液，其pH值为4.6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流速为1.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述进样量为20μL。
6.一种二甲双胍维格列汀片杂质的分离检测方法，其中二甲双胍杂质结构如分子式A、B、C、D、E所示，维格列汀杂质结构如分子式G、H、I、J所示，其特征在于：高效液相色谱条件为：
色谱柱为C18/SCX混合柱，规格为4.6×250mm，5.0μm；
检测波长为210nm/218nm；
柱温为30℃；
流速为1.0mL/min；
进样量为20μL；
流动相A为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液，pH值为4.6；流动相B为乙腈；梯度洗脱如下：
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其能应用于盐酸二甲双胍原料药、盐酸二甲双胍制剂、维格列汀原料、维格列汀制剂及二甲双胍维格列汀片的杂质分离检测。
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